Thiết lập quy trình phát hiện nhân tố alu ở người bằng pcr sử dụng trong giảng dạy ở các trường đại học

Chuyên khảo Phát hiện nhân tố alu ở người bằng pcr cho giảng dạy đại học phân tích chuyên sâu các khía cạnh quan trọng trong lĩnh vực

• Người hướng dẫn: GV. Phan Thị Phượng Trang
• Trường học: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ trẻ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết lập quy trình phát hiện nhân tố Alu ở người bằng PCR sử dụng trong giảng dạy ở các trường đại học
• Loại tài liệu: Báo cáo nghiệm thu đề tài
• Năm xuất bản: 2004
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Hướng dẫn phát hiện nhân tố Alu bằng PCR cho người mới

Kỹ thuật Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR), do Karl Mullis phát minh năm 1985, là một công cụ nền tảng trong sinh học phân tử. Nó cho phép khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu thành hàng triệu bản sao từ một lượng khuôn rất nhỏ, chẳng hạn như từ một giọt máu hay tế bào niêm mạc má. Tầm quan trọng của PCR không thể phủ nhận, với ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, pháp y, lập bản đồ gen và công nghệ sinh học. Trong bối cảnh giáo dục đại học tại Việt Nam, việc trang bị kiến thức và kỹ năng thực hành về PCR cho sinh viên là một yêu cầu cấp thiết. Đề tài này tập trung vào việc thiết lập quy trình phát hiện nhân tố Alu ở người bằng PCR, một ứng dụng cụ thể và hấp dẫn, nhằm tạo ra một bộ công cụ giảng dạy trực quan. Nhân tố Alu là các đoạn DNA lặp lại, chiếm một phần đáng kể trong bộ gen người. Sự hiện diện hoặc vắng mặt của một đoạn Alu cụ thể tại một locus nhất định, ví dụ như trên gen TPA (Tissue Plasminogen Activator) ở nhiễm sắc thể số VIII, có tính đa hình cao trong quần thể. Điều này biến nó thành một chỉ thị di truyền lý tưởng để minh họa các khái niệm về di truyền học, đa hình di truyền và "dấu vân tay DNA" trong môi trường học thuật. Việc xây dựng một quy trình hoàn chỉnh, từ chiết tách DNA đến phân tích kết quả, không chỉ giúp sinh viên nắm vững lý thuyết mà còn cung cấp kinh nghiệm thực hành quý báu.

1.1. Tìm hiểu về kỹ thuật PCR và nhân tố Alu trên gen TPA

Kỹ thuật PCR hoạt động dựa trên ba bước lặp lại theo chu kỳ: biến tính (denaturation) ở 94-95°C để tách chuỗi đôi DNA, bắt cặp (annealing) ở nhiệt độ thấp hơn (40-70°C) để mồi (primer) gắn vào khuôn, và kéo dài (elongation) ở 72°C để enzyme Taq DNA polymerase tổng hợp mạch mới. Quá trình này nhân bản đoạn DNA mục tiêu theo cấp số nhân. Trong khi đó, nhân tố Alu là các yếu tố di truyền di động ngắn (SINEs), dài khoảng 300 cặp base (bp), có mặt với số lượng gần một triệu bản trong bộ gen người. Sự tồn tại của một đoạn Alu trong intron 8 của gen TPA trên nhiễm sắc thể số VIII là một ví dụ điển hình về đa hình chèn. Một cá thể có thể là đồng hợp tử trội (+/+) khi cả hai alen đều chứa Alu, đồng hợp tử lặn (-/-) khi không có alen nào chứa Alu, hoặc dị hợp tử (+/-) khi một alen chứa và một alen không. Việc sử dụng PCR để khuếch đại vùng này cho phép phân biệt rõ ràng ba kiểu gen này trên điện di gel agarose.

1.2. Vai trò của việc ứng dụng PCR trong giảng dạy đại học

Mặc dù PCR là kỹ thuật phổ biến trên thế giới, việc giảng dạy thực hành tại nhiều trường đại học ở Việt Nam vẫn còn hạn chế. Sinh viên thường chỉ được tiếp cận qua lý thuyết, thiếu đi kinh nghiệm thao tác trực tiếp. Việc thiết lập quy trình phát hiện nhân tố Alu bằng PCR nhằm giải quyết khoảng trống này. Quy trình này cung cấp một bài thực hành sinh động, giúp sinh viên hiểu sâu hơn về: nguyên lý khuếch đại gen, thiết kế mồi, tối ưu hóa phản ứng, và phân tích kết quả di truyền. Hơn nữa, nó còn là một ví dụ thực tiễn về ứng dụng của sinh học phân tử trong việc phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ huyết thống ở cấp độ phân tử, và nghiên cứu di truyền học quần thể. Việc tạo ra một bộ hóa chất PCR hoàn chỉnh, dễ sử dụng sẽ giúp các trường chủ động hơn trong công tác giảng dạy, nâng cao chất lượng đào tạo và khơi dậy niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho sinh viên.

II. Thách thức khi triển khai kỹ thuật PCR tại Việt Nam

Việc phổ cập kỹ thuật PCR trong giảng dạy tại các trường đại học Việt Nam đối mặt với nhiều thách thức đáng kể. Rào cản lớn nhất là sự thiếu hụt các bộ hóa chất PCR được tiêu chuẩn hóa, giá cả phải chăng và phù hợp với mục đích giảng dạy. Các phòng thí nghiệm thường phải tự chuẩn bị hóa chất từ nhiều nguồn khác nhau, dẫn đến sự không đồng nhất về chất lượng và kết quả. Điều này không chỉ gây tốn kém về thời gian, công sức mà còn làm tăng nguy cơ thất bại trong thực nghiệm, ảnh hưởng đến trải nghiệm học tập của sinh viên. Một thách thức khác đến từ sự phức tạp của các quy trình chuẩn. Ví dụ, các phương pháp chiết tách DNA bộ gen kinh điển như phương pháp của Blin N. (1976) hay sử dụng proteinase K và phenol/chloroform đòi hỏi nhiều bước, sử dụng hóa chất độc hại và cần trang thiết bị chuyên dụng. Những quy trình này không phù hợp với một lớp học thực hành có quy mô lớn với thời gian hạn chế. Do đó, việc thiết lập một quy trình phát hiện nhân tố Alu không chỉ dừng lại ở việc tối ưu hóa phản ứng PCR mà còn phải bao gồm việc cải tiến các bước chuẩn bị mẫu, làm cho chúng đơn giản, nhanh chóng và an toàn hơn cho môi trường học đường, đảm bảo tỷ lệ thành công cao cho sinh viên.

2.1. Hạn chế về bộ kit thực hành sinh học phân tử sẵn có

Trên thị trường, các bộ kit (bộ hóa chất) PCR thương mại thường được thiết kế cho mục đích nghiên cứu chuyên sâu hoặc chẩn đoán y tế, với chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật phức tạp. Điều này khiến chúng không phù hợp cho việc giảng dạy đại trà. Sự thiếu vắng các bộ kit thực hành được thiết kế riêng cho giáo dục tạo ra một khoảng trống lớn. Các trường đại học cần một giải pháp "tất cả trong một", bao gồm đầy đủ hóa chất từ khâu tách chiết mẫu đến phản ứng PCR và điện di, kèm theo tài liệu hướng dẫn chi tiết, dễ hiểu. Việc chủ động nghiên cứu và phát triển một bộ hóa chất phát hiện đoạn Alu-TPA nội địa là một hướng đi cần thiết để giảm sự phụ thuộc vào sản phẩm nhập khẩu, hạ giá thành và tùy biến quy trình cho phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

2.2. Sự phức tạp của các quy trình chiết tách DNA tiêu chuẩn

Các phương pháp chiết tách DNA truyền thống thường bao gồm các bước ủ với enzyme proteinase K để phá vỡ protein, sau đó loại bỏ protein bằng hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (PCA), và cuối cùng là tủa DNA bằng cồn. Mặc dù cho DNA có độ tinh sạch cao, quy trình này mất nhiều thời gian và đòi hỏi thao tác cẩn thận với hóa chất nguy hiểm. Đối với sinh viên lần đầu tiếp xúc, nguy cơ nhiễm chéo hoặc thất bại là rất cao. Do đó, một trong những mục tiêu chính của đề tài là đơn giản hóa khâu này. Cần một phương pháp tách chiết nhanh, an toàn hơn từ tế bào má trong (thu được từ nước súc miệng), nhưng vẫn đảm bảo chất lượng DNA đủ tốt để làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen Alu-TPA.

III. Phương pháp thiết lập quy trình PCR phát hiện nhân tố Alu

Để thiết lập quy trình phát hiện nhân tố Alu ở người bằng PCR một cách hiệu quả và đáng tin cậy, quá trình nghiên cứu được tiến hành một cách bài bản, bắt đầu từ khâu quan trọng nhất là thiết kế và sàng lọc mồi. Dựa trên trình tự gen TPA từ ngân hàng gen (GenBank K03021), nhiều cặp mồi (primer) tiềm năng đã được thiết kế bằng phần mềm chuyên dụng như Amplify v1. và Jellyfish v.4. Mục tiêu là chọn ra cặp mồi có khả năng bắt cặp đặc hiệu vào hai đầu của vùng chứa nhân tố Alu, cho phép phân biệt rõ sản phẩm có chèn Alu (kích thước lớn hơn) và không chèn Alu (kích thước nhỏ hơn) trên gel điện di. Các cặp mồi được đánh giá dựa trên các tiêu chí như nhiệt độ nóng chảy (Tm), khả năng tạo cấu trúc thứ cấp (dimer) và tính đặc hiệu. Sau khi sàng lọc trên lý thuyết, các cặp mồi được đưa vào thử nghiệm thực tế. Quá trình tối ưu hóa điều kiện phản ứng là bước tiếp theo, bao gồm việc khảo sát một khoảng rộng nhiệt độ bắt cặp và nồng độ ion Mg²⁺ để tìm ra điều kiện tối ưu, giúp tối đa hóa lượng sản phẩm đặc hiệu và giảm thiểu các sản phẩm không mong muốn (vạch ký sinh).

3.1. Quy trình sàng lọc và lựa chọn cặp mồi primer tối ưu

Từ các thiết kế ban đầu, sáu cặp mồi tổ hợp đã được tổng hợp và đưa vào khảo sát thực nghiệm. Mẫu DNA khuôn được chiết tách từ tế bào má của các tình nguyện viên, đặc biệt là các mẫu dị hợp tử (+/-) được ưu tiên sử dụng vì chúng cho phép đánh giá khả năng khuếch đại đồng thời cả hai loại alen của cặp mồi. Các phản ứng PCR được thực hiện ở nhiều nhiệt độ bắt cặp khác nhau, từ 55°C đến 59°C. Kết quả điện di cho thấy cặp mồi PlatA/Alu1R cho kết quả vượt trội nhất: vạch sản phẩm rõ nét, ít vạch ký sinh, và hoạt động tốt trong một khoảng nhiệt độ rộng. Cặp mồi này tạo ra sản phẩm có kích thước dự kiến là 534 bp cho alen chứa Alu (+) và 234 bp cho alen không chứa Alu (-). Do đó, cặp PlatA/Alu1R đã được lựa chọn cho các bước tối ưu hóa và hoàn thiện quy trình tiếp theo.

3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho phản ứng khuếch đại gen

Sau khi chọn được cặp mồi PlatA/Alu1R, các điều kiện phản ứng được tinh chỉnh để đạt hiệu quả cao nhất. Nồng độ mồi được khảo sát trong khoảng từ 0.1µM đến 0.8µM, kết quả cho thấy nồng độ từ 0.2µM đến 0.8µM đều cho sản phẩm tốt. Nồng độ ion Mg²⁺, một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme Taq DNA polymerase, cũng được khảo sát ở các mức 2mM, 4mM, 5mM và 8mM. Phản ứng cho kết quả tốt trên hầu hết các nồng độ Mg²⁺ được thử nghiệm. Dựa trên các kết quả này, một điều kiện phản ứng tối ưu đã được đề xuất và chuẩn hóa: nhiệt độ bắt cặp là 58°C trong 40 giây, lặp lại 35 chu kỳ. Điều kiện này đảm bảo phản ứng diễn ra mạnh mẽ, đặc hiệu và có tính lặp lại cao, phù hợp để xây dựng một quy trình chuẩn cho giảng dạy ở các trường đại học.

IV. Cách hoàn thiện quy trình phát hiện gen Alu TPA hiệu quả

Một quy trình phát hiện gen Alu-TPA hoàn chỉnh không chỉ dựa vào một phản ứng PCR tối ưu mà còn cần một phương pháp chuẩn bị mẫu đơn giản và các bước kiểm tra xác thực sản phẩm đáng tin cậy. Dựa trên việc so sánh bốn phương pháp chiết tách DNA khác nhau, một quy trình cải tiến đã được xây dựng. Quy trình này được thiết kế để đơn giản hóa tối đa các bước, giảm thời gian thực hiện và hạn chế sử dụng hóa chất độc hại, rất phù hợp cho môi trường giảng dạy. Để khẳng định chắc chắn rằng sản phẩm PCR thu được thực sự là đoạn gen TPA có nguồn gốc từ bộ gen người, các kỹ thuật kiểm tra chéo đã được áp dụng. Phương pháp PCR tổ (nested PCR) và lai phân tử Slot Blot được sử dụng để xác thực tính đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại. Song song đó, các đoạn DNA Alu-TPA dương tính (+) và âm tính (-) đã được tạo dòng vào vector plasmid pBluescript II KS(+). Việc này không chỉ giúp giải trình tự để so sánh với ngân hàng gen mà còn tạo ra các mẫu đối chứng dương chuẩn, một thành phần không thể thiếu trong bộ hóa chất giảng dạy sau này.

4.1. Cải tiến phương pháp thu nhận DNA bộ gen từ tế bào má

Quy trình chiết tách DNA cải tiến bắt đầu bằng việc thu thập tế bào má từ 3ml nước súc miệng với dung dịch muối 0.9%. Sau khi ly tâm thu tế bào, các bước phá màng tế bào (sử dụng dung dịch SNET và đun cách thủy), loại bỏ protein (sử dụng dung dịch PCA và chloroform) và tủa DNA (sử dụng isopropanol lạnh) được thực hiện một cách nhanh chóng. Toàn bộ quy trình này (Sơ đồ 2 trong tài liệu gốc) đơn giản hơn đáng kể so với các phương pháp chuẩn, không cần enzyme proteinase K, và có thể hoàn thành trong thời gian ngắn. Thử nghiệm lặp lại 10 lần cho thấy quy trình này cho kết quả ổn định, lượng DNA thu được đủ chất lượng để làm khuôn cho phản ứng PCR phát hiện nhân tố Alu thành công.

4.2. Kỹ thuật xác thực đoạn Alu TPA bằng PCR tổ và Slot Blot

Để xác nhận sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi PlatA/Alu1R đúng là đoạn gen TPA, kỹ thuật PCR tổ đã được thực hiện. Một cặp mồi thứ hai (Alu2F/Alu1R), nằm bên trong đoạn sản phẩm đầu tiên, được dùng để khuếch đại lại. Kết quả cho thấy các vạch DNA có kích thước đúng như dự đoán (126bp và 426bp), khẳng định nguồn gốc của sản phẩm. Thêm vào đó, kỹ thuật Slot Blot cũng được sử dụng. Sản phẩm PCR được cố định trên màng lai và cho lai với một mẫu dò đã được đánh dấu. Tín hiệu lai dương tính (Hình 14) một lần nữa chứng tỏ sự đặc hiệu của phản ứng. Các bước xác thực này đảm bảo tính chính xác khoa học của quy trình, một yếu tố cốt lõi khi áp dụng vào giảng dạy sinh học phân tử.

V. Ứng dụng Bộ hóa chất phát hiện Alu TPA cho giảng dạy

Mục tiêu cuối cùng của đề tài là tạo ra một sản phẩm hữu hình, có thể ứng dụng trực tiếp vào công tác giảng dạy. Từ quy trình đã được tối ưu hóa và kiểm chứng, một bộ hóa chất phát hiện đoạn Alu-TPA bằng kỹ thuật PCR hoàn chỉnh đã được thiết kế. Bộ hóa chất này được chia thành ba hộp riêng biệt, tương ứng với ba giai đoạn chính của thí nghiệm: (1) Tách chiết DNA bộ gen từ tế bào má, (2) Phản ứng PCR khuếch đại nhân tố Alu, và (3) Điện di và phân tích sản phẩm. Thiết kế này giúp quy trình trở nên module hóa, dễ dàng quản lý và thực hiện trong một lớp thực hành. Mỗi hộp chứa đầy đủ các dung dịch, hóa chất cần thiết cùng với một bản hướng dẫn sử dụng chi tiết, giúp giảm thiểu sai sót và đảm bảo tính đồng nhất trong kết quả. Đặc biệt, bộ hóa chất PCR còn bao gồm cả mẫu đối chứng dương (plasmid pB-TPA-Alu (+) và pB-TPA-Alu (-) đã được tạo dòng) và DNA chứng nội để kiểm soát chất lượng phản ứng. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc chủ động sản xuất công cụ thực hành sinh học phân tử tại Việt Nam.

5.1. Cấu trúc và thành phần của bộ kit PCR hoàn chỉnh

Bộ kit PCR được thiết kế để đáp ứng nhu cầu thực hành cho 50 phản ứng. Hộp tách chiết DNA chứa các dung dịch SNET, PCA, chloroform, isopropanol, ethanol và đệm TE. Hộp phản ứng PCR bao gồm hỗn hợp phản ứng (PCR buffer, dNTPs, MgCl₂, DNA chứng nội), hỗn hợp mồi (PlatA/Alu1R và mồi cho chứng nội), enzyme Taq DNA polymerase, và các mẫu plasmid đối chứng. Cuối cùng, hộp điện di cung cấp đệm nạp mẫu, đệm chạy điện di TAE 50X cô đặc, và thuốc nhuộm Ethidium bromide. Cấu trúc này đảm bảo người dùng có mọi thứ cần thiết để thực hiện thí nghiệm từ đầu đến cuối một cách thuận lợi.

5.2. Đánh giá hiệu quả từ lớp học thực nghiệm tại đại học

Để đánh giá tính thực tiễn và hiệu quả, bộ hóa chất đã được đưa vào giảng dạy thử nghiệm cho 120 sinh viên ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Kết quả thu được rất khả quan, với 98,33% sinh viên thực hiện thành công phản ứng và thu được kết quả nhân bản tốt. Sự thành công này chứng tỏ quy trình được thiết kế rất rõ ràng, dễ thao tác và có độ ổn định cao. Các phiếu đánh giá từ sinh viên cũng cho thấy sự hứng thú và phản hồi tích cực về bài thực hành. Kết quả thử nghiệm này là minh chứng mạnh mẽ cho tính ứng dụng của đề tài, khẳng định bộ hóa chất hoàn toàn có thể được chuyển giao và nhân rộng tại các trường đại học khác, góp phần nâng cao chất lượng đào tạo ngành công nghệ sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ. Một nhà nghiên cứu có thể lấy một lượng nhỏ DNA khuôn từ một giọt máu, một sợi tóc hay tế bào ở má và sử dụng kỹ thuật PCR để tạo ra hàng triệu bản sao đoạn DNA mong muốn nhằm phục vụ cho các khảo sát trong pháp y (forensics) hoặc di truyển. Trong khi đó với một lượng nhỏ khuôn DNA như vậy thì không thể sử dụng trong pháp y hoặc di truyền nếu không sử dụng PCR. Do vậy, ưu điểm của công cụ PCR là khẩ năng nhân bản chính xác một trình ty DNA mong muốn với một lượng lớn [1].

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, kỹ thuật PCR được sử dụng trong việc lập bản đổ gen, dòng hóa gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen. Ở các nước phát triển, PCR đã được sử dụng rộng rãi như công cụ chẩn đoán trong y học để phát hiện những bệnh đi truyền, được sử dụng trong điều tra tội phạm để xác định những người bị tình nghỉ ở cấp độ phân tử và là một công cụ mạnh mẽ trong việc giải trình tự của các gen trong bộ gen người [2]. Là một kỹ thuật thực sự hữu hiệu như vậy, nhưng ở Việt Nam trong những năm gần đây, PCR chỉ được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm và ứng dụng phát hiện gen của tác nhân gây bệnh tại các trung tâm xét nghiệm lớn. Trên thế giới, kỹ thuật PCR đã được đưa vào chương trình giảng dạy phổ thông trung học, trong khi đó tại nhiều Trường đại học ở Việt Nam thì sinh viên chưa được tiếp cận.

Do vậy, việc cập nhật kiến thức cho giảng viên và giảng dạy cho sinh viên về kỹ thuật PCR để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của xã hội là hết sức cấp thiết. Ngoài ra, ở Việt Nam, hiểu biết vé “dấu vân tay di truyén”, cach để xác Trang 2 còn rất nhiều hạn chế. định mối quan hệ giữa người này với người khác vẫn thể sẽ trang bị cho sinh viên Thông qua thực hiện trên nhân tố Alu, để tài này có định mối quan hệ giữa những hiểu biết cơ bản để có thể giải thích cách xác người này với người khác trong cộng đồng. việc giảng dạY Với mong muốn hình thành một bộ hóa chất phục vụ cho này chúng tôi sẽ trình bày sinh viên ở các Trường đại học về PCR, trong để tài các đoạn Ai và (3) các nội dung sau: (1) thiết kế mổi, (2) chạy PCR phát hiện hoàn thiện quy trình và đánh giá.

MỤC TIÊU PCR sử Để tài “Thiết lập quy trình phát hiện nhân tố Alu ở người bằng thành một qui trình hoàn dụng trong giảng dạy ở các trường đại học” nhằm hình (tissue plasminogen chỉnh để phát hiện nhân tố Aiz của người trên gen TPA Alu-TPA). Két qua nay activator) ở nhiễm sắc thé sé VIII bing PCR (gọi tắt là việc giảng dạy về kỹ sẽ góp phần vào việc chủ động tao ra bộ hóa chất phục vụ thuật PCR trong các Trường đại học. NỘI DUNG Đề tài được thực hiện theo các nội dung sau: 1. Sàng lọc và thiết kế các mỗi (primer) giản để chiết tách 2.

Thực nghiệm chọn lọc và hoàn thiện qui trình đơn ĐNA bộ gen của người từ nước súc miệng 3. Khảo sát tính ổn định của các cặp mỗi được thiết kế 4. Dòng hóa các đoạn DNA Aiu-7PA đã được nhân bản Trang 3 5. Kiểm tra các đoạn DNA được nhân bản 6.

Hoàn thiện và kiểm tra tính ổn định của bộ hóa chất, thử giảng dạy tại trường Đại học Khoa học tự nhiên và đánh giá 7. Chuyển giao kết quả được nghiên cứu cho các Trường Đại học và Cao đẳng phụ vụ cho công tác giảng dạy 1. CƠ SỞ KHOA HỌC 1. Kỹ thuật PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in viiro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, nhân bản, nhân số lượng bẩn sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mổi (mổi) đặc hiệu cho đoạn DNA này.

Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, „ kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm. Tất cá các DNA polymerase đều cần những mỗi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trinh ty DNA của gen (gợi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này.

Mỗi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mỗi này được nối đài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mỗi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phan tng PCR, ở điều kiện Trang 4 đâm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mổi sẽ được nhân bản thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gen. Như vậy, để nhân ban một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu doan DNA đú để tạo các môi bổ sung chuyên biệt.

Các mỗi này gồm một mỗi xuôi và một mỗi ngược so với chiều phiên mã của gen [1], [4]. Phần ứng PCR là gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau (Hình 1). Mỗi chu kỳ gồm ba bước là: - Bước 1 (bước biến tỉnh, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cẩn thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94°C ~ 95°C trong vòng 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.

- Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mổi cho phép các mỗi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40°C - 70°C, tùy thuộc Tm của các mổi sử dụng và kéo đài từ 30 - 60 giây. - Bước 3 (bước tổng hợp, elongation): nhiệt độ được tăng lên dén 72°C gitip cho DNA polymerase (v6n la polymerase chju nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần nhân bản, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Trong phần ứng PCR một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự Trang Š nhân bắn theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 chu kỳ sự nhân bản sẽ là 10° so với số lượng bản mẫu ban đầu [1], [4]. 94°C 130; 10” $$ > 30 chu kỳ Hình 1.

Sơ đồ mình họa một chương trình PCR 1. Nhân tố Aiu trên gen TPA ở nhiễm sắc thể số VII của người Nhân tố Aj¿ là những đoạn DNA có trình tự lặp lại ngẫu nhiên có mặt trên DNA bộ gen của bộ linh trưởng (Primates). Họ Ai có gần một triệu thành viên gồm những nhân tố DNA ngắn lặp lại. Trên những đoạn DNA này thường có những vị trí nhận biết của enzym cắt han ché Alul.

Kích thước của các trình tự DNA Ai¿ khoảng 300bp. Ở người, trên nhiễm sắc thể số VII tùy theo cá nhân mà có sự hiện diện của đoạn DNA A/w hay không giữa Exon 8 và Exon 9 (Hình 2) [5]. Sử dụng những đặc tính này, người ta có thể dùng PCR để suy đoán mối quan hệ giữa các cá nhân, hay để xác định tần số có sự hiện diện của đoạn Ai trong một cộng đồng [6], [7]. mm” Vùng được nhân bản 5! —Y+— Gen TPA/Nhiém sic thé VIII Intron 8 Hinh 2.

So dé vj tri doan DNA Alu dich trén gen TPA nhiễm sắc thể VHI Phần 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Trang 6 2. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT và VẬT LIỆU 2. Các thiết bị chính nghiệm Vi sinh - Bao gồm dụng cụ và thiết bị cơ bản của một phòng thí Sinh học phân tử: — Eppendorf: 200ul, 500ul, 1,5ml — Pipette: 0,5-10pl, 2-20HI, 10-100p1, 100-1000p1 — Dia petri (Đức) - Ta lanh Candy-Combi 2 — Ti mat Vestfrost Reetech — Ti 4m Memmert — Máy đo pH — Nôi hấp khử trùng Tommy - SS 325 any) — May ly tam (Mikro 22R, Hettech Zentrifugen-Germ es) — BO dién di ngang HorizonR 558 (Life Technologi ) — Hép soi dén tt ngoai Hoefer (Model no UVTM-19-230V nhiệt theo chu kỳ, PCR (PTC-100 Programable Thermal - Máy điểu Controller, MJ Research, Inc) ~ Máy đo quang phổ GeneQuantpro — Máy vortex (Minishaker) — Microwave (Sharp) m Pharmacia Biotech) ~ Máy chụp hình gel ImageMaster VDS (Amersha Trang 7 Biocence) - Bộ nạp mẫu (Slot Blot) (Amersham dién bién nap, tao xung điện din g dé bién nap DNA plasmid vao té — Méy bào vi sinh vat (Bio-Rad, MY) 2. Hóa chất và môi trường tài này được sẵn xuất bởi Công ty Các hóa chất được sử dụng trong để Sigma, Merck và Amersham Bioscence.

DNA —_ Các hóa chất và đệm dùng để chiết tách - Phenol bão hòa trong TE pH 8.0 - Chloroform (Merk) - Isopropanol (Merk) - Ethanol 99,9% (git 4 - 20°C) - Ethanol 70% (gitf 6 - 20°C) - Dung dich 20% SDS -Cl (pH 8,0), 10mM EDTA (pH - Dung dich TE vé trùng: 100mM Tris 8,0) Tris-Cl (pH8,0), SmM EDTA (pH8,0), - Dung dich SNET: 20mM 400mM NaCl, 1% (w/v) SDS : isoamy! alcohol (25:24:1) - Dung dich PCA: phenol : chloroform Trang 8 — Hóa chất và đệm dùng tách chiết DNA plasmid từ E. coli - Dung dich 1: 50mM glucose, 25mM Tris-HCI (pH 8) 10mM EDTA (pH 8), hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, giữ trong tủ mát. - Dung dich 2: 0,2N NaOH, 1% (w/v) SDS, chỉ pha trước khi sử dụng. - Dung dich 3: 5M potassium acetate, 60ml glacial acetic acid, 28,5ml nước cất (pH8), giữ trong tủ mát, trước khi sử dụng phải nhúng vào nước đá.

- RNase Img/ml, gitt 6 -20°C - _ Phenol bão hòa trong TE pH8, giữ trong tủ mát.