CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan chung về nhóm vi khuẩn Rhodococcus 1. Đặc điểm của vi khuẩn Rhodococcus Rhodococcus là một chủng vi khuẩn Gram dương, hiếu khí không bắt buộc, không nhạy cảm với kháng sinh, có lượng G/C cao, thuộc chi Coryneform của bộ Actinomycetales, đồng thời có quan hệ gần gũi với nhóm các vi khuẩn Mycobacterium và Corynebacterium [70]. Hầu hết các vi khuẩn thuộc chủng này đều lành tính, được tìm thấy phát triển mạnh và đa dạng trong nhiều môi trường bao gồm đất, nước và tế bào nhân chuẩn.
Một số loài có bộ gen lớn như bộ gen 9,7 Mbp (67% G/C) của Rhodococcus sp. Có thể nói các chủng Rhodococcus có đặc tính linh hoạt trong trao đổi chất do khả năng thủy phân chuyển hóa một loạt các hợp chất xenobiotic như polyiplorinated biphenyls (PCBs), acrylamide và tạo ra các steroid có hoạt tính sinh học như axit acrylic [40]. Sự đa dạng về di truyền và dị hóa trên, không chỉ do nhiễm sắc thể lớn mà còn do sự hiện diện của ba plasmid tuyến tính. Theo một số nghiên cứu, Rhodococcus cũng là một hệ vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong thực nghiệm do tốc độ sinh trưởng tương đối nhanh và chu kỳ phát triển đơn giản, tuy nhiên các ảnh hưởng đến thí nghiệm của chúng chưa được nhận biết rõ ràng [70].
Một số chủng Rhodococcus được sử dụng vào sản xuất chất hoạt động bề mặt và một số khác là nguồn enzyme hữu ích như phenylalanine dehydrogenase và endoglycosidases. Một ứng dụng quan trọng khác của Rhodococcus đến từ sự chuyển đổi sinh học. Sử dụng các hệ sinh học để chuyển đổi vật liệu khởi đầu rẻ thành các hợp chất có giá trị hơn như khả năng chuyển hóa các chất gây ô nhiễm môi trường có hại, bao gồm toluene, naphtalene, thuốc diệt cỏ và PCBs. Rhodococcus là loài có khả năng chuyển hóa một số hợp chất thơm bằng cách oxy hóa vòng thơm để tạo thành một glycol (hai nhóm rượu).
Trong khi việc kiểm soát phản ứng hóa học đang là một thách thức đối với các nhà hóa học tổng hợp thì các quá trình thủy phân sinh học của Rhodococcus có thể được sử dụng để sản xuất các phân tử 4 nhóm thế (chiral) trong trường hợp tổng hợp hóa học trực tiếp không khả thi hoặc thiếu hiệu quả. Một ví dụ 4 cụ thể về trường hợp này là việc sử dụng Rhodococcus để tạo ra indene , tiền thân của thuốc AIDS indinavir, một chất ức chế protease và có chứa hai trong năm lõi chiral cần thiết trong nhóm phức [20]. Rhodococcus đã được nghiên cứu như là một nhân tố tiềm năng cho việc xử lý sinh học các chất gây ô nhiễm vì nó thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên và mang những đặc điểm nhất định như khả năng chuyển hóa nhiều loại hydrocacbon nhờ bề mặt kỵ nước cho phép chúng phát triển mạnh dưới hàng loạt điều kiện khắc nghiệt đồng thời chúng [14]. Khả năng hô hấp vi sinh vật giúp Rhodococcus tồn tại trong môi trường có nồng độ oxy thấp trong khi khả năng hô hấp hiếu khí cũng cho phép chúng tồn tại trong môi trường oxy hóa.
Ngoài ra, chúng có thể cố định đạm tạo các chất dinh dưỡng trong môi trường có dưỡng chất thấp. Nhờ một số loại enzyme độc đáo, Rhodococcus có khả năng chuyển hóa mạnh nhiều hydrocacbon độc hại như phân hủy dầu diesel [40]. Trong một số trường hợp, Rhodococcus sinh dioxygenases, một chất có thể được sử dụng để làm suy giảm benzotrifluoride- một hợp chất gây ô nhiễm nhờ tính kiềm chế sinh trưởng. Thêm vào đó, Rhodococcus sp.
chủng Q1, một chủng tự nhiên được tìm thấy trong đất và giấy nghiền, có khả năng làm giảm quinoline, các dẫn xuất pyridin, catechol, benzoat và axit protocatechuic. Rhodococcus cũng có khả năng tích lũy các ion kim loại nặng, chẳng hạn như phóng xạ cesium, cho phép loại bỏ chúng dễ dàng hơn ra khỏi môi trường [70]. Các chất ô nhiễm khác như thuốc nhuộm azo, thuốc trừ sâu và polychlorinated biphenyls cũng có thể bị thoái hóa bởi Rhodococcus [12]. Theo một số nghiên cứu, khả năng thủy phân sinh học của chủng Rhodococcus có liên hệ mật thiết với một loại enzyme có tên amidase, một enzyme có mặt thường xuyên khi phân lập chủng này từ tự nhiên.
Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit, giải phóng các axit và amoniac tương ứng [55]. Khái quát về vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 và gen mã hóa amidase aliphatic Trong chủng Rhodococcus, vi khuẩn Rhodococcus erythropolis nổi lên như một nhóm có khả năng đáp ứng cao đối với các điều kiện ô nhiễm của môi trường trong đó, Rhodococcus erythropolis PR4 (= NBRC 100887 ) đã được phân lập từ 5 nước biển sâu ở độ sâu 1.000 m ở phía nam của đảo Okinawa, Nhật Bản (Thái Bình Dương) cho thấy, chúng có thể sử dụng n -alkan của C-8 đến C-20 , alkylbenzenes, và chất nguyên sơ (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) như là nguồn cacbon và năng lượng. Nó cũng có thể tạo ra một lượng lớn polysaccharide ngoại bào (EPS), được cho là đóng một vai trò quan trọng vào khả năng chịu đựng của nó đối với một loạt các dung môi hữu cơ [49]. Hệ gen hoàn chỉnh bao gồm một nhiễm sắc thể tròn (6,516,310 bp; hàm lượng GC 62,31%), một plasmid tuyến tính (pREL1: 271,577 bp) và hai plasmid hình tròn (pREC1: 104,014 bp; và pREC2: 3,637 bp).
Tổng cộng có 6,437 ORF được dự đoán trên nhiễm sắc thể và 3 plasmid. Nhiễm sắc thể và plasmid tuyến tính mã hóa nhiều gen liên quan đến sự suy thoái của các ankan. Ngoài ra, các gen được nhóm lại trên nhiễm sắc thể chịu trách nhiệm cho việc phân hủy các chất trung gian trong quá trình dị hóa của các hợp chất thơm như axit protocatechuic và catechol. Bộ gen này cũng chứa một số gen cho sự trao đổi chất thứ cấp và sinh tổng hợp EPS [10].
Trong vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, gen amidase aliphatic (amiE) mã hóa amidase có kích thước 1038 bp đã được giải trình tự một cách đầy đủ và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số 543918 đến 544955 [30]. Tổng quan chung về amidase 1. Hệ thống phân loại enzyme Amidase thuộc lớp enzyme hydrolase - enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân. Trong lớp enzyme hydrolase, có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein như urease, asparaginase, glutaminase, arginase, aliphatic axit hydrolases… Tên phân loại của nhóm enzyme amidase là acylamide amidohydrolase.
Các tên gọi khác tên gọi khác được sử dụng phổ biến bao gồm acylamidase, acylase, amidohydrolase, deaminase, acylamidase béo và N-acetylaminohydrolase. Enzyme này tham gia vào 6 con đường trao đổi chất: chu kỳ urê và chuyển hóa các nhóm amin, chuyển hóa phenylalanine, chuyển hóa tryptophan ,chuyển hóa axit cyanoamino, thoái hóa benzoate qua Coenyme A và suy thoái styrene. Amidase chứa khoảng 130 axit amin, được gọi là trình tự AS. Chúng là loại enzyme phổ biến, thường được tìm thấy ở cả sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân 6 sơ.
Trình tự AS của enzyme xúc tác sự thủy phân của liên kết amit (CO-NH2), mặc dù họ enzyme này đã phân tán khả năng thủy phân vào từng nhóm do liên quan đến độ đặc hiệu và chức năng bề mặt của chúng. Tuy nhiên, các enzyme này vẫn duy trì cấu trúc với lõi alpha/beta/alpha, trong đó các cấu trúc liên kết của các nửa đầu N và C là tương tự nhau. Trình tự AS của enzyme đặc trưng có một khu vực C- terminal giàu serine và dư lượng glycine, nhưng không có acid aspartic và dư lượng histidine, do đó chúng khác với hydrolases serine cổ điển. Những enzyme này có bộ ba xúc tác Ser-Ser-Lys độc đáo, được bảo tồn cao và sử dụng để thủy phân amit, mặc dù cơ chế xúc tác cho sự hình thành trung gian enzyme acyl có thể khác nhau giữa các enzyme [69].
Cấu trúc X-ray của amidase peptide Ví dụ về trình tự AS chứa các tín hiệu của enzyme bao gồm: Peptide amidase (Pam), xúc tác quá trình thủy phân của amit có đầu C- terminal của chuỗi axit amin. Aliphatic axit hydrolases amide, enzyme xúc tác thủy phân các chất nền chứa nhóm phức amit hình thành axit béo (ví dụ nhóm hợp chất nội sinh anandamide và oleamide), do đó có thể kiểm soát mức độ và thời gian biểu hiện của tín hiệu thông qua sự kiểm soát tính đa dạng của lớp chất nền lipid. Malonamidase E2, có trong nhóm vi khuẩn cộng sinh chuyển hóa nitơ, hỗ trợ xúc tác quá trình thủy phân malonamate thành malonate và ammonia đồng thời tham gia vào việc vận chuyển cố định nitơ từ bacteroids để nuôi dưỡng các tế bào chủ. Đặc tính của amidase Amidase (EC 3.4) được tìm thấy bởi Mohamed S.
và cộng sự vào năm 1994, có khối lượng phân tử tiểu đơn vị xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằng SDS-PAGE) 7 và điểm đẳng điện được ước tính là pH 4. Trình tự aa N-terminal của enzyme này được công bố như sau: M R H G D I T S S P D T V G V A V [30]. Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit, giải phóng các axit và amoniac tương ứng [55]. Phản ứng xúc tác thủy phân amit hình thành axit và amoniac tương ứng Enzyme này có thể được phân thành hai loại theo đặc tính bề mặt của chúng [18], loại thứ nhất bao gồm các amidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạch ngắn, loại thứ hai là các amidase aliphatic thủy phân chuỗi amit mạch trung bình, acrylamide và heterocyclicamide như isobutyramide và valeroamide [38].
Đến nay, đã có hơn 26 loại amidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sàng lọc và xác định [55], bên cạnh đó hầu hết trong vi khuẩn, amidase tồn tại ở loại thứ hai. Amidase được ghi nhận là có mặt thường xuyên ở chi Rhodococcus. Ở chủng Rhodococcus erythropolis TA37 ghi nhận, một enzyme acylamidase có khối lượng tiểu đơn vị chạy SDS -PAGE là 55 kDa, hoạt động tối đa ở điều kiện pH=7-8 và nhiệt độ 55 oC [37], trong khi đó ở Rhodococcus erythropolis MP50, enzyme này có trọng lượng phân tử khoảng 480 kDa và bao gồm các tiểu đơn vị giống hệt nhau với trọng lượng khoảng 61 kDa [28]. Theo nghiên cứu gần đây của Z.
Xue và cộng sự, amidase tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn Rhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩn đặc trưng thuộc nhóm Actinobacteria có khả năng biểu hiện đầy đủ hoạt tính cũng như khả năng tổng hợp chọn lọc bất đối xứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổi bật là một số chất gây độc cho tế bào như acetamide, propionamide, acrylamide, và benzamide) [72]. 8 Cùng với đó, amidase được coi như là một loại enzyme có thể phân giải acrylamide và là một chất xúc tác sinh học trong việc sản xuất axit acrylic trên quy mô lớn, có thể nói đây là một hợp chất có ứng dụng công nghiệp mạnh [52]. Khả năng thủy phân sinh học 1.
