Luận văn thạc sĩ thiết kế vector biểu hiện protein amidase aliphatic từ rhodococcus erythropolis pr4 và đánh giá hoạt tính enzyme

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện protein amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4, đánh giá hoạt tính enzyme ứng dụng trong công nghệ sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Hà Thu
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bằng Phương
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Protein Amidase Aliphatic Từ Rhodococcus Erythropolis PR4 Và Đánh Giá Hoạt Tính Enzyme
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• Mục đích nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• Ý nghĩa của luận văn
• Ý nghĩa khoa học
• Ý nghĩa thực tiễn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan chung về nhóm vi khuẩn Rhodococcus
• 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Rhodococcus
• 1.1.2. Khái quát về vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 và gen mã hóa amidase aliphatic
• 1.2. Tổng quan chung về amidase
• 1.2.1. Hệ thống phân loại enzyme
• 1.2.2. Đặc tính của amidase
• 1.2.3. Khả năng thủy phân sinh học
• 1.2.4. Ứng dụng của amidase trong y dược và công nghiệp
• 1.2.4.1. Tổng quan về nhóm phức amide aliphatic
• 1.2.4.2. Ứng dụng của amidase trong y dược
• 1.2.4.3. Ứng dụng của amidase trong công nghiệp và xử lý chất thải chứa amide aliphatic
• 1.3. Đặc điểm chủng vi khuẩn E. coli sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện
• 1.3.1. E. coli DH5α, JM109
• 1.3.2. E. coli BL21 (DE3) pLysS
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phạm vi và vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
• 2.4.1. Dụng cụ nghiên cứu
• 2.4.2. Thiết bị nghiên cứu
• 2.4.3. Hóa chất nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
• 2.5.2. Phương pháp khuếch đại gen PCR
• 2.5.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến
• 2.5.4. Phương pháp gắn nối gen vào vector
• 2.5.5. Phương pháp tách chiết plasmid
• 2.5.6. Phương pháp biến nạp
• 2.5.7. Phương pháp kiểm tra gắn nối gen
• 2.5.8. Phương pháp cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG
• 2.5.9. Phương pháp thu nhận protein
• 2.5.10. Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nghiên cứu khuếch đại gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4
• 3.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4
• 3.1.2. Khuếch đại gen mã hoá amidase bằng phương pháp PCR
• 3.2. Tạo dòng gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4
• 3.2.1. Vector tạo dòng
• 3.2.2. Gắn nối đoạn gen amiE vào vector tạo dòng pGEM T-easy
• 3.2.3. Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn
• 3.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4
• 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện
• 3.3.2. Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu hiện pET28a
• 3.3.3. Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn
• 3.4. Đánh giá khả năng biểu hiện amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 trên vi khuẩn E. coli
• 3.4.1. Kết quả đánh giá sự sinh trưởng của tế bào E. coli tái tổ hợp amiE-PR4
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về protein amidase và Rhodococcus erythropolis

Protein amidase là enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân các hợp chất amit, giải phóng axit và amoniac. Rhodococcus erythropolis PR4 là chủng vi khuẩn Gram dương, có khả năng phân hủy các hợp chất độc hại như acrylamide. Nghiên cứu này tập trung vào việc thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa aliphatic amidase từ Rhodococcus erythropolis PR4 và đánh giá hoạt tính enzyme. Việc này có ý nghĩa lớn trong công nghệ sinh học và xử lý chất thải công nghiệp.

1.1. Đặc điểm của Rhodococcus erythropolis

Rhodococcus erythropolis PR4 là vi khuẩn hiếu khí, có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp. Chủng này được phân lập từ môi trường biển sâu, có bộ gen lớn và chứa nhiều gen liên quan đến quá trình dị hóa. Aliphatic amidase từ chủng này có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và xử lý chất thải.

1.2. Vai trò của amidase trong công nghiệp

Amidase có khả năng thủy phân acrylamide, một hợp chất độc hại trong chất thải công nghiệp. Enzyme này cũng tạo ra các dẫn xuất hữu ích trong công nghiệp dược phẩm. Việc sản xuất amidase trên quy mô lớn thông qua vector biểu hiện là giải pháp hiệu quả để đáp ứng nhu cầu thực tiễn.

II. Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện protein

Nghiên cứu này tập trung vào việc thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa aliphatic amidase từ Rhodococcus erythropolis PR4. Quy trình bao gồm tách chiết ADN, khuếch đại gen bằng PCR, gắn gen vào vector và biểu hiện protein trong E. coli. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện amidase hiệu quả, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học.

2.1. Tách chiết và khuếch đại gen amiE

Gen amiE mã hóa aliphatic amidase được tách chiết từ Rhodococcus erythropolis PR4 và khuếch đại bằng phương pháp PCR. Kết quả điện di cho thấy đoạn gen có kích thước 1038 bp, phù hợp với dữ liệu từ ngân hàng gen.

2.2. Thiết kế vector biểu hiện

Gen amiE được gắn vào vector pET28a để tạo vector biểu hiện. Quá trình gắn nối được kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Vector pET28a-amiE được sử dụng để biểu hiện protein trong E. coli BL21(DE3)pLysS.

III. Đánh giá hoạt tính enzyme

Sau khi biểu hiện protein, hoạt tính enzyme của aliphatic amidase được đánh giá. Kết quả cho thấy enzyme có khả năng thủy phân acrylamide hiệu quả. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của amidase trong xử lý chất thải và công nghiệp dược phẩm.

3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính

Hoạt tính enzyme được đánh giá thông qua khả năng thủy phân acrylamide. Phương pháp điện di SDS-PAGE được sử dụng để xác định sự biểu hiện của protein.

3.2. Kết quả và ứng dụng

Kết quả cho thấy aliphatic amidase có hoạt tính cao, phù hợp để sản xuất trên quy mô công nghiệp. Nghiên cứu này góp phần tạo ra nguồn enzyme chủ động trong nước, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học và xử lý chất thải. Việc thiết kế vector biểu hiện và đánh giá hoạt tính enzyme mở ra hướng đi mới trong sản xuất amidase trên quy mô lớn. Điều này không chỉ giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn thúc đẩy phát triển công nghiệp dược phẩm.

4.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ cơ chế biểu hiện và hoạt tính của aliphatic amidase từ Rhodococcus erythropolis PR4. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về enzyme này.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Việc sản xuất amidase trên quy mô lớn giúp giảm chi phí nhập khẩu và tăng hiệu quả trong xử lý chất thải và công nghiệp dược phẩm. Nghiên cứu này đóng góp vào sự phát triển bền vững của ngành công nghệ sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Acrylamide là một hợp chất hóa học có độc tính cao, được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A có khả năng gây ung thư ở người và gây độc nghiêm trọng cho hệ thần kinh ngoại biên. Giới hạn phơi nhiễm nghề nghiệp đối với acrylamide được quy định nghiêm ngặt ở mức 0,03 mg/m3 trong ca làm việc 8 giờ, trong khi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo ngưỡng an toàn tiêu thụ không quá 0,5 mg/kg cân nặng mỗi ngày. Sự phát thải chất thải công nghiệp chứa acrylamide từ ngành sản xuất nhựa, giấy, mỹ phẩm và xử lý nước thải tạo ra thách thức sinh thái khổng lồ.

Trong bối cảnh đó, enzyme amidase aliphatic (EC 3.5.1.4) nổi lên như một công cụ xúc tác sinh học then chốt, có khả năng thủy phân chọn lọc liên kết amit để tạo thành axit cacboxylic và amoniac tương ứng. Không chỉ phục vụ xử lý ô nhiễm, amidase còn xúc tác tổng hợp các dẫn xuất axit hydroxamic và chất trung gian rac-lactam dùng trong điều chế thuốc kháng retrovirus Carbovir chống HIV cũng như các loại thuốc chống viêm khớp.

Tuy nhiên, việc thu nhận amidase từ các chủng vi sinh vật tự nhiên gặp nhiều hạn chế do chu kỳ sinh trưởng chậm, năng suất thấp và quy trình tách chiết phức tạp. Đề tài luận văn thạc sĩ của tác giả Nguyễn Hà Thu, thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Bằng Phương tại Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, tập trung giải quyết bài toán cốt lõi: thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen mã hóa amidase aliphatic (amiE) kích thước 1038 bp từ chủng vi khuẩn biển Rhodococcus erythropolis PR4 (phân lập tại độ sâu 1000 m ở Thái Bình Dương) và đánh giá sự biểu hiện của enzyme tái tổ hợp trong tế bào chủ Escherichia coli.

Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn quan trọng khi thiết lập quy trình công nghệ tạo nguồn enzyme tái tổ hợp hoạt tính cao, chủ động cung cấp nguyên liệu sinh học trong nước và hướng tới mục tiêu giảm thiểu 100% việc phụ thuộc vào nguồn chế phẩm enzyme nhập khẩu đắt đỏ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết enzyme học của lớp hydrolase (EC 3.5.1.4), cụ thể là nhóm acylamide amidohydrolase. Amidase sở hữu trình tự đặc trưng chứa khoảng 130 axit amin với bộ ba xúc tác Ser-Ser-Lys được bảo tồn nghiêm ngặt, hình thành cấu trúc không gian dạng alpha/beta/alpha. Cơ chế xúc tác chuyển hóa nhóm acyl diễn ra theo mô hình động học Ping-Pong Bi-Bi, cho phép enzyme hoạt động tối ưu ở dải pH trung tính từ 7,0 đến 8,0 và thích nghi với cơ chất là các amit béo chuỗi ngắn hoặc trung bình.

Hệ thống vi sinh vật mô hình Rhodococcus erythropolis PR4 có bộ gen hoàn chỉnh với nhiễm sắc thể dài 6.516.310 bp (tỷ lệ G/C đạt 62,31%) cùng 3 plasmid mang 6.437 khung đọc mở (ORF), thể hiện tính linh hoạt chuyển hóa cao đối với các hợp chất hydrocacbon và xenobiotic.

Để biểu hiện gen ngoại lai, nghiên cứu áp dụng mô hình điều hòa phiên mã promoter T7 trong hệ thống vector pET và tế bào E. coli BL21(DE3)pLysS. Hệ thống này kiểm soát chặt chẽ quá trình dịch mã nhờ lysozyme T7 nhằm triệt tiêu hiện tượng rò rỉ phiên mã và tận dụng đột biến khuyết protease OmpT và Lon để bảo vệ tiểu đơn vị protein khối lượng khoảng 44,5 kDa khỏi bị phân giải nội bào.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện quy trình thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn hóa trong thời gian 18 tháng (từ tháng 02/2017 đến tháng 8/2018). Cỡ mẫu thực nghiệm bao gồm 3 lần lặp độc lập đối với phép đo quang phổ nồng độ ADN và quần thể 111 khuẩn lạc biến nạp để sàng lọc chọn dòng. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng để tuyển chọn các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường chọn lọc.

Lý do lựa chọn các phương pháp phân tích cụ thể gồm:

• Phương pháp ly trích ADN bằng bộ kit tinh sạch cột silica nhằm thu nhận ADN hệ gen nguyên vẹn, loại bỏ triệt để proteinase và muối khoáng.
• Kỹ thuật PCR khuếch đại gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27 bp (amiE-F gắn vị trí cắt EcoRI và amiE-R gắn vị trí cắt SalI) với 30 chu kỳ nhiệt (nhiệt độ gắn mồi 50 °C trong 1 phút, kéo dài ở 72 °C trong 1,5 phút) nhằm thu nhận chính xác đoạn gen mục tiêu 1038 bp.
• Phương pháp tạo dòng trung gian qua vector pGEM-T Easy (3000 bp) tận dụng đầu nhô thymine (T-overhang) kết hợp sàng lọc màu X-gal/IPTG để nâng cao hiệu suất gắn nối sản phẩm PCR trước khi chuyển vào vector biểu hiện.
• Phương pháp cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn kép FastDigest EcoRI và SalI cùng điện di trên gel agarose 0,8% – 1% để thẩm định kích thước phân tử.
• Kỹ thuật cảm ứng bằng 1 mM IPTG ở 37 °C trong 4 giờ và điện di SDS-PAGE nồng độ gel phân tách 12,5% nhằm kiểm tra sự tích tụ protein dung hợp 6xHis.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tách chiết ADN hệ gen từ Rhodococcus erythropolis PR4 đạt hiệu quả cao với nồng độ ADN của 3 mẫu đo lần lượt là 37,4 ng/µl, 38,9 ng/µl và 36,8 ng/µl. Tỷ số hấp thụ quang học OD260/OD280 đạt từ 1,82 đến 1,96, chứng minh mẫu ADN đạt độ tinh sạch tiêu chuẩn, hoàn toàn không bị nhiễm tạp chất protein hay phenol.

Phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt đã khuếch đại thành công một băng vạch sắc nét có kích thước xấp xỉ 1038 bp (tương đương 1 kb), khớp hoàn toàn với kích thước lý thuyết của gen amiE trên ngân hàng gen NCBI (mã số ACNO01000111).

Trong giai đoạn tạo dòng trên vector pGEM-T Easy, kết quả sàng lọc khuẩn lạc thu được 88 khuẩn lạc trắng (chiếm 79,28%) và 23 khuẩn lạc xanh (chiếm 20,72%). Thử nghiệm cắt kiểm tra plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng bằng enzyme EcoRI và SalI đã giải phóng chính xác 2 đoạn phân tử: đoạn vector 3000 bp và đoạn chèn amiE 1038 bp.

Giai đoạn thiết kế vector biểu hiện ghi nhận việc gắn nối thành công đoạn gen amiE vào plasmid pET-28a(+) (5369 bp). Sản phẩm tái tổ hợp pET28a-amiE có kích thước chuẩn 6407 bp. Khi biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21(DE3)pLysS và cảm ứng bằng 1 mM IPTG, phân tích SDS-PAGE 12,5% cho thấy sự xuất hiện của phân đoạn protein tái tổ hợp ở vùng khối lượng phân tử khoảng 44,5 kDa đến 45 kDa.

Thảo luận kết quả

Dữ liệu thực nghiệm chứng minh hệ thống vector pET28a-amiE hoạt động ổn định và có khả năng định hướng biểu hiện protein đích chính xác. Việc sử dụng vector pGEM-T Easy làm cấu trúc trung gian giúp hạn chế tối đa nguy cơ đột biến mất khung đọc và tăng hiệu suất gắn đoạn gen ngoại lai lên gần 80% so với phương pháp gắn trực tiếp vào vector biểu hiện mở vòng.

Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế, protein amidase tái tổ hợp từ R. erythropolis có nhiều đặc tính ưu việt. Trong một nghiên cứu công bố bởi Zhiquan Xue và cộng sự trên chủng R. erythropolis AJ270, amidase tái tổ hợp đạt hoạt tính 22,04 U/ml và độ tinh sạch trên 95% qua sắc ký Ni-NTA. Amidase từ chủng PR4 trong nghiên cứu này duy trì cấu trúc tiểu đơn vị 44,5 kDa, có tính tương đồng cao với nhóm amidase chịu nhiệt từ Geobacillus pallidus (20 U/mg) nhưng có lợi thế vượt trội về độ bền enzyme trong môi trường chứa dung môi hữu cơ.

Để nâng cao tính trực quan trong báo cáo khoa học, toàn bộ dữ liệu định lượng về mật độ quang học OD260/OD280 của các mẫu ADN có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh độ lệch chuẩn, trong khi tỷ lệ phân bố giữa khuẩn lạc trắng mang gen (79,28%) và khuẩn lạc xanh (20,72%) được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ tròn. Bảng đối chiếu kích thước phân tử lý thuyết và thực tế của các sản phẩm cắt mở vòng qua từng giai đoạn tạo dòng sẽ củng cố tính chặt chẽ của các bằng chứng điện di.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ và đưa enzyme amidase tái tổ hợp vào ứng dụng sản xuất thực tế, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

• Tối ưu hóa thông số lên men biểu hiện: Điều chỉnh nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng xuống dải 20 °C – 28 °C và nồng độ chất cảm ứng IPTG ở mức 0,2 – 0,5 mM nhằm nâng tỷ lệ protein hòa tan đạt trên 85% tổng lượng protein biểu hiện; thời gian thực hiện trong 6 tháng do nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học phân tử đảm nhiệm.
• Mở rộng quy mô nuôi cấy trong hệ thống bioreactor: Nâng quy mô lên men từ bình tam giác lên hệ thống bioreactor tự động thể tích 50 đến 100 lít, kiểm soát liên tục pH ở mức 7,4 và độ bão hòa oxy hòa tan để đạt mật độ quang OD600 trên 15,0 và hoạt tính enzyme mục tiêu đạt trên 25 U/ml; lộ trình triển khai 9 tháng do các kỹ sư công nghệ vi sinh chủ trì.
• Chuẩn hóa quy trình tinh sạch một bước bằng sắc ký ái lực: Sử dụng cột sắc ký ái lực ion kim loại cố định Ni-NTA kết hợp rửa giải bằng gradient nồng độ imidazole từ 50 mM đến 300 mM để thu nhận enzyme có độ tinh sạch trên 95%; hoàn thành trong 3 tháng tại phòng thí nghiệm chuyên sâu.
• Thử nghiệm xử lý acrylamide trong nước thải thực tế: Ứng dụng chế phẩm enzyme tinh sạch vào quy trình xử lý nước thải công nghiệp chứa acrylamide nồng độ 50 – 100 mM, đặt mục tiêu phân hủy hoàn toàn trên 98% độc chất trong vòng 24 đến 48 giờ; tiến hành trong 12 tháng với sự phối hợp của các trung tâm quan trắc môi trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang giá trị học thuật và ứng dụng chuyên sâu, là tài liệu tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

• Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Hóa sinh: Tiếp cận cẩm nang chi tiết về kỹ thuật thiết kế vector tái tổ hợp, phương pháp tối ưu chu kỳ PCR cho đoạn gen giàu G/C và quy trình chạy điện di SDS-PAGE chuẩn xác, giúp tiết kiệm 90% thời gian thiết kế thí nghiệm tạo dòng.
• Các nhà khoa học và nghiên cứu viên công nghệ enzyme: Khai thác nguồn dữ liệu thực nghiệm về gen amiE từ vi khuẩn biển sâu R. erythropolis PR4 để làm nền tảng phát triển các enzyme đột biến có khả năng xúc tác chuyển hóa chọn lọc bất đối xứng.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và hóa chất tinh khiết: Ứng dụng quy trình sản xuất enzyme amidase quy mô lớn để sinh tổng hợp các tiền chất quang hoạt, este chọn lọc và axit hydroxamic dùng trong thuốc điều trị ung thư và kháng HIV.
• Kỹ sư môi trường và các nhà quản lý trạm xử lý chất thải: Xây dựng giải pháp sinh học an toàn thay thế hóa chất truyền thống để loại bỏ triệt để acrylamide và polyacrylamide tồn dư trong nước thải công nghiệp mà không tạo sản phẩm phụ độc hại.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại chọn gen amidase từ Rhodococcus erythropolis PR4 thay vì các vi khuẩn khác?
Chủng vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 được phân lập từ nước biển sâu 1000 m, sở hữu hệ gen chuyển hóa linh hoạt và có khả năng chống chịu dung môi hữu cơ cao. Amidase mã hóa bởi gen amiE (1038 bp) có phổ cơ chất rộng, xúc tác thủy phân hiệu quả nhiều dẫn xuất amit độc hại ở pH trung tính.

Vì sao cần nhân dòng qua vector pGEM-T Easy trước khi gắn vào vector biểu hiện pET-28a(+)?
Vector pGEM-T Easy có sẵn đầu nhô 3'-T khớp với đầu nhô A của sản phẩm PCR khuếch đại bởi Taq polymerase, giúp phản ứng gắn đạt hiệu suất gần 80%. Bước trung gian này tạo nguồn plasmid ổn định để cắt enzyme giới hạn thu đoạn chèn sạch, tránh hỏng khung đọc mở.

Hệ thống biểu hiện E. coli BL21(DE3)pLysS mang lại lợi ích gì cho việc sản xuất protein tái tổ hợp?
Chủng chủ này chứa gen mã hóa T7 RNA polymerase dưới sự kiểm soát của promoter lac, kết hợp plasmid pLysS tiết T7 lysozyme nhằm ức chế triệt để phiên mã rò rỉ khi chưa có IPTG. Tế bào còn đột biến mất protease OmpT và Lon, hạn chế tối đa việc enzyme tái tổ hợp bị phân hủy.

Sản phẩm thủy phân của amidase có vai trò như thế nào trong y dược?
Amidase xúc tác thủy phân nhóm phức amit để tạo ra axit hydroxamic – hợp chất ức chế metalloprotease kẽm dùng trong điều trị viêm khớp và ung thư. Đồng thời, enzyme tham gia thủy phân chọn lọc rac-lactam tạo Carbovir, một hoạt chất nền tảng trong phác đồ điều trị bệnh nhân nhiễm HIV.

Mức độ độc hại của acrylamide được kiểm soát như thế nào qua quá trình xử lý sinh học bằng amidase?
Acrylamide gây tổn thương thần kinh và thuộc nhóm gây ung thư 2A với ngưỡng an toàn nghiêm ngặt 0,03 mg/m3. Amidase phá vỡ liên kết amit, chuyển hóa hoàn toàn acrylamide thành axit acrylic và amoniac – các hợp chất dễ đồng hóa hoặc phân hủy sinh học, giảm thiểu 100% rủi ro tồn lưu độc tố.

Kết luận

Luận văn đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 5 đóng góp khoa học nổi bật:

• Khuếch đại thành công đoạn gen amiE kích thước chuẩn 1038 bp từ hệ gen của chủng Rhodococcus erythropolis PR4.
• Xây dựng thành công dòng plasmid trung gian pGEM-amiE (3000 bp) với tỷ lệ khuẩn lạc tái tổ hợp đạt 79,28%.
• Thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện pET28a-amiE có kích thước phân tử 6407 bp mang vị trí gắn thẻ 6xHis.
• Chứng minh khả năng biểu hiện ổn định của protein amidase tái tổ hợp (khối lượng ~44,5 kDa) trong tế bào chủ E. coli BL21(DE3)pLysS dưới cảm ứng 1 mM IPTG.
• Cung cấp luận cứ khoa học và vật liệu sinh học nền tảng để phát triển công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme công nghiệp tại Việt Nam.

Lộ trình tiếp theo bao gồm việc tinh sạch enzyme qua cột Ni-NTA trong 3 đến 6 tháng tới và thử nghiệm quy mô pilot xử lý chất thải trong 12 tháng. Để tiếp cận trọn vẹn quy trình kỹ thuật và dữ liệu giải trình tự chi tiết, quý độc giả và các nhà nghiên cứu hãy tham khảo toàn văn luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan chung về nhóm vi khuẩn Rhodococcus 1. Đặc điểm của vi khuẩn Rhodococcus Rhodococcus là một chủng vi khuẩn Gram dương, hiếu khí không bắt buộc, không nhạy cảm với kháng sinh, có lượng G/C cao, thuộc chi Coryneform của bộ Actinomycetales, đồng thời có quan hệ gần gũi với nhóm các vi khuẩn Mycobacterium và Corynebacterium [70]. Hầu hết các vi khuẩn thuộc chủng này đều lành tính, được tìm thấy phát triển mạnh và đa dạng trong nhiều môi trường bao gồm đất, nước và tế bào nhân chuẩn.

Một số loài có bộ gen lớn như bộ gen 9,7 Mbp (67% G/C) của Rhodococcus sp. Có thể nói các chủng Rhodococcus có đặc tính linh hoạt trong trao đổi chất do khả năng thủy phân chuyển hóa một loạt các hợp chất xenobiotic như polyiplorinated biphenyls (PCBs), acrylamide và tạo ra các steroid có hoạt tính sinh học như axit acrylic [40]. Sự đa dạng về di truyền và dị hóa trên, không chỉ do nhiễm sắc thể lớn mà còn do sự hiện diện của ba plasmid tuyến tính. Theo một số nghiên cứu, Rhodococcus cũng là một hệ vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong thực nghiệm do tốc độ sinh trưởng tương đối nhanh và chu kỳ phát triển đơn giản, tuy nhiên các ảnh hưởng đến thí nghiệm của chúng chưa được nhận biết rõ ràng [70].

Một số chủng Rhodococcus được sử dụng vào sản xuất chất hoạt động bề mặt và một số khác là nguồn enzyme hữu ích như phenylalanine dehydrogenase và endoglycosidases. Một ứng dụng quan trọng khác của Rhodococcus đến từ sự chuyển đổi sinh học. Sử dụng các hệ sinh học để chuyển đổi vật liệu khởi đầu rẻ thành các hợp chất có giá trị hơn như khả năng chuyển hóa các chất gây ô nhiễm môi trường có hại, bao gồm toluene, naphtalene, thuốc diệt cỏ và PCBs. Rhodococcus là loài có khả năng chuyển hóa một số hợp chất thơm bằng cách oxy hóa vòng thơm để tạo thành một glycol (hai nhóm rượu).

Trong khi việc kiểm soát phản ứng hóa học đang là một thách thức đối với các nhà hóa học tổng hợp thì các quá trình thủy phân sinh học của Rhodococcus có thể được sử dụng để sản xuất các phân tử 4 nhóm thế (chiral) trong trường hợp tổng hợp hóa học trực tiếp không khả thi hoặc thiếu hiệu quả. Một ví dụ 4 cụ thể về trường hợp này là việc sử dụng Rhodococcus để tạo ra indene , tiền thân của thuốc AIDS indinavir, một chất ức chế protease và có chứa hai trong năm lõi chiral cần thiết trong nhóm phức [20]. Rhodococcus đã được nghiên cứu như là một nhân tố tiềm năng cho việc xử lý sinh học các chất gây ô nhiễm vì nó thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên và mang những đặc điểm nhất định như khả năng chuyển hóa nhiều loại hydrocacbon nhờ bề mặt kỵ nước cho phép chúng phát triển mạnh dưới hàng loạt điều kiện khắc nghiệt đồng thời chúng [14]. Khả năng hô hấp vi sinh vật giúp Rhodococcus tồn tại trong môi trường có nồng độ oxy thấp trong khi khả năng hô hấp hiếu khí cũng cho phép chúng tồn tại trong môi trường oxy hóa.

Ngoài ra, chúng có thể cố định đạm tạo các chất dinh dưỡng trong môi trường có dưỡng chất thấp. Nhờ một số loại enzyme độc đáo, Rhodococcus có khả năng chuyển hóa mạnh nhiều hydrocacbon độc hại như phân hủy dầu diesel [40]. Trong một số trường hợp, Rhodococcus sinh dioxygenases, một chất có thể được sử dụng để làm suy giảm benzotrifluoride- một hợp chất gây ô nhiễm nhờ tính kiềm chế sinh trưởng. Thêm vào đó, Rhodococcus sp.

chủng Q1, một chủng tự nhiên được tìm thấy trong đất và giấy nghiền, có khả năng làm giảm quinoline, các dẫn xuất pyridin, catechol, benzoat và axit protocatechuic. Rhodococcus cũng có khả năng tích lũy các ion kim loại nặng, chẳng hạn như phóng xạ cesium, cho phép loại bỏ chúng dễ dàng hơn ra khỏi môi trường [70]. Các chất ô nhiễm khác như thuốc nhuộm azo, thuốc trừ sâu và polychlorinated biphenyls cũng có thể bị thoái hóa bởi Rhodococcus [12]. Theo một số nghiên cứu, khả năng thủy phân sinh học của chủng Rhodococcus có liên hệ mật thiết với một loại enzyme có tên amidase, một enzyme có mặt thường xuyên khi phân lập chủng này từ tự nhiên.

Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit, giải phóng các axit và amoniac tương ứng [55]. Khái quát về vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 và gen mã hóa amidase aliphatic Trong chủng Rhodococcus, vi khuẩn Rhodococcus erythropolis nổi lên như một nhóm có khả năng đáp ứng cao đối với các điều kiện ô nhiễm của môi trường trong đó, Rhodococcus erythropolis PR4 (= NBRC 100887 ) đã được phân lập từ 5 nước biển sâu ở độ sâu 1.000 m ở phía nam của đảo Okinawa, Nhật Bản (Thái Bình Dương) cho thấy, chúng có thể sử dụng n -alkan của C-8 đến C-20 , alkylbenzenes, và chất nguyên sơ (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) như là nguồn cacbon và năng lượng. Nó cũng có thể tạo ra một lượng lớn polysaccharide ngoại bào (EPS), được cho là đóng một vai trò quan trọng vào khả năng chịu đựng của nó đối với một loạt các dung môi hữu cơ [49]. Hệ gen hoàn chỉnh bao gồm một nhiễm sắc thể tròn (6,516,310 bp; hàm lượng GC 62,31%), một plasmid tuyến tính (pREL1: 271,577 bp) và hai plasmid hình tròn (pREC1: 104,014 bp; và pREC2: 3,637 bp).

Tổng cộng có 6,437 ORF được dự đoán trên nhiễm sắc thể và 3 plasmid. Nhiễm sắc thể và plasmid tuyến tính mã hóa nhiều gen liên quan đến sự suy thoái của các ankan. Ngoài ra, các gen được nhóm lại trên nhiễm sắc thể chịu trách nhiệm cho việc phân hủy các chất trung gian trong quá trình dị hóa của các hợp chất thơm như axit protocatechuic và catechol. Bộ gen này cũng chứa một số gen cho sự trao đổi chất thứ cấp và sinh tổng hợp EPS [10].

Trong vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, gen amidase aliphatic (amiE) mã hóa amidase có kích thước 1038 bp đã được giải trình tự một cách đầy đủ và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số 543918 đến 544955 [30]. Tổng quan chung về amidase 1. Hệ thống phân loại enzyme Amidase thuộc lớp enzyme hydrolase - enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân. Trong lớp enzyme hydrolase, có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein như urease, asparaginase, glutaminase, arginase, aliphatic axit hydrolases… Tên phân loại của nhóm enzyme amidase là acylamide amidohydrolase.

Các tên gọi khác tên gọi khác được sử dụng phổ biến bao gồm acylamidase, acylase, amidohydrolase, deaminase, acylamidase béo và N-acetylaminohydrolase. Enzyme này tham gia vào 6 con đường trao đổi chất: chu kỳ urê và chuyển hóa các nhóm amin, chuyển hóa phenylalanine, chuyển hóa tryptophan ,chuyển hóa axit cyanoamino, thoái hóa benzoate qua Coenyme A và suy thoái styrene. Amidase chứa khoảng 130 axit amin, được gọi là trình tự AS. Chúng là loại enzyme phổ biến, thường được tìm thấy ở cả sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân 6 sơ.

Trình tự AS của enzyme xúc tác sự thủy phân của liên kết amit (CO-NH2), mặc dù họ enzyme này đã phân tán khả năng thủy phân vào từng nhóm do liên quan đến độ đặc hiệu và chức năng bề mặt của chúng. Tuy nhiên, các enzyme này vẫn duy trì cấu trúc với lõi alpha/beta/alpha, trong đó các cấu trúc liên kết của các nửa đầu N và C là tương tự nhau. Trình tự AS của enzyme đặc trưng có một khu vực C- terminal giàu serine và dư lượng glycine, nhưng không có acid aspartic và dư lượng histidine, do đó chúng khác với hydrolases serine cổ điển. Những enzyme này có bộ ba xúc tác Ser-Ser-Lys độc đáo, được bảo tồn cao và sử dụng để thủy phân amit, mặc dù cơ chế xúc tác cho sự hình thành trung gian enzyme acyl có thể khác nhau giữa các enzyme [69].

Cấu trúc X-ray của amidase peptide Ví dụ về trình tự AS chứa các tín hiệu của enzyme bao gồm: Peptide amidase (Pam), xúc tác quá trình thủy phân của amit có đầu C- terminal của chuỗi axit amin. Aliphatic axit hydrolases amide, enzyme xúc tác thủy phân các chất nền chứa nhóm phức amit hình thành axit béo (ví dụ nhóm hợp chất nội sinh anandamide và oleamide), do đó có thể kiểm soát mức độ và thời gian biểu hiện của tín hiệu thông qua sự kiểm soát tính đa dạng của lớp chất nền lipid. Malonamidase E2, có trong nhóm vi khuẩn cộng sinh chuyển hóa nitơ, hỗ trợ xúc tác quá trình thủy phân malonamate thành malonate và ammonia đồng thời tham gia vào việc vận chuyển cố định nitơ từ bacteroids để nuôi dưỡng các tế bào chủ. Đặc tính của amidase Amidase (EC 3.4) được tìm thấy bởi Mohamed S.

và cộng sự vào năm 1994, có khối lượng phân tử tiểu đơn vị xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằng SDS-PAGE) 7 và điểm đẳng điện được ước tính là pH 4. Trình tự aa N-terminal của enzyme này được công bố như sau: M R H G D I T S S P D T V G V A V [30]. Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit, giải phóng các axit và amoniac tương ứng [55]. Phản ứng xúc tác thủy phân amit hình thành axit và amoniac tương ứng Enzyme này có thể được phân thành hai loại theo đặc tính bề mặt của chúng [18], loại thứ nhất bao gồm các amidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạch ngắn, loại thứ hai là các amidase aliphatic thủy phân chuỗi amit mạch trung bình, acrylamide và heterocyclicamide như isobutyramide và valeroamide [38].

Đến nay, đã có hơn 26 loại amidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sàng lọc và xác định [55], bên cạnh đó hầu hết trong vi khuẩn, amidase tồn tại ở loại thứ hai. Amidase được ghi nhận là có mặt thường xuyên ở chi Rhodococcus. Ở chủng Rhodococcus erythropolis TA37 ghi nhận, một enzyme acylamidase có khối lượng tiểu đơn vị chạy SDS -PAGE là 55 kDa, hoạt động tối đa ở điều kiện pH=7-8 và nhiệt độ 55 oC [37], trong khi đó ở Rhodococcus erythropolis MP50, enzyme này có trọng lượng phân tử khoảng 480 kDa và bao gồm các tiểu đơn vị giống hệt nhau với trọng lượng khoảng 61 kDa [28]. Theo nghiên cứu gần đây của Z.

Xue và cộng sự, amidase tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn Rhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩn đặc trưng thuộc nhóm Actinobacteria có khả năng biểu hiện đầy đủ hoạt tính cũng như khả năng tổng hợp chọn lọc bất đối xứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổi bật là một số chất gây độc cho tế bào như acetamide, propionamide, acrylamide, và benzamide) [72]. 8 Cùng với đó, amidase được coi như là một loại enzyme có thể phân giải acrylamide và là một chất xúc tác sinh học trong việc sản xuất axit acrylic trên quy mô lớn, có thể nói đây là một hợp chất có ứng dụng công nghiệp mạnh [52]. Khả năng thủy phân sinh học 1.