Luận văn thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β carotene trong vi khuẩn escherichia coli

Carotenoid là sắc tố tự nhiên quan trọng, đặc biệt là β-carotene, được tìm thấy trong thực vật và vi sinh vật. 77 trang · Đại học Thái Nguyên · 2015.

• Tác giả: Vũ Hoài Nam
• Người hướng dẫn: Th.S. Ma Thị Trang
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene Mã Hóa Enzyme Tổng Hợp β-Carotene Trong Escherichia coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Khái quát về sắc tố β-carotene
• 2.1.1. Cấu trúc và tính chất lý hóa
• 2.1.2. Vai trò của sắc tố β-carotene với con người
• 2.1.2.1. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người
• 2.1.2.2. Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp
• 2.2. Con đường tổng hợp β-carotene
• 2.3. Nguồn cung cấp β-carotene
• 2.3.1. Nguồn cung từ thực vật
• 2.3.2. Nguồn cung từ vi sinh vật
• 2.3.3. Nguồn cung từ tổng hợp hóa học
• 2.4. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên
• 2.4.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp
• 2.4.2. Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli
• 2.4.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.4.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.4.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp thiết kế in silico
• 3.5.2. Phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 3.5.3. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose
• 3.5.4. Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose
• 3.5.5. Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện
• 3.5.6. Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến
• 3.5.7. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt
• 3.5.8. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY
• 4.1.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY
• 4.1.2. Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY
• 4.2. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
• 4.2.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y
• 4.2.2. Kết quả gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
• 4.3. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene

Carotenoid là sắc tố tự nhiên quan trọng, đặc biệt là β-carotene, được tìm thấy trong thực vật và vi sinh vật. β-carotene có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng và sức khỏe con người, là tiền chất của vitamin A và có khả năng chống oxy hóa mạnh. Nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng, thúc đẩy các nghiên cứu về sản xuất β-carotene tự nhiên bằng công nghệ sinh học. Việc thiết kế vector biểu hiện hiệu quả là yếu tố then chốt để tăng năng suất tổng hợp β-carotene trong các hệ thống vi sinh vật. Nghiên cứu này tập trung vào thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli, một đối tượng nghiên cứu phổ biến trong kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử.

1.1. Giới Thiệu Về Sắc Tố β Carotene và Ứng Dụng

β-carotene là một carotenoid quan trọng, có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và dung môi hữu cơ. Nó đóng vai trò là tiền chất của vitamin A, cần thiết cho thị lực và chức năng miễn dịch. Ngoài ra, β-carotene còn có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Ứng dụng của β-carotene rất đa dạng, từ thực phẩm chức năng, dược phẩm đến mỹ phẩm. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018. Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11].

1.2. Vai Trò Của Escherichia coli Trong Biểu Hiện Gene

Escherichia coli (E. coli) là một vi khuẩn gram âm, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền nhờ khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng biến đổi gen và có hệ thống di truyền được nghiên cứu kỹ lưỡng. E. coli là một nền tảng lý tưởng để biểu hiện gene và sản xuất protein tái tổ hợp. Việc thiết kế vector biểu hiện E. coli phù hợp là yếu tố quan trọng để đạt được năng suất cao trong tổng hợp β-carotene. Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32].

II. Thách Thức Trong Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene

Việc thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene không phải là một nhiệm vụ đơn giản. Các enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp β-carotene thường được mã hóa bởi nhiều gene khác nhau, đòi hỏi phải thiết kế vector có khả năng chứa và biểu hiện đồng thời nhiều gene (polycistron). Ngoài ra, việc tối ưu hóa biểu hiện gene để đạt được năng suất cao cũng là một thách thức lớn. Các yếu tố như promoter, trình tự ribosome binding site (RBS) và codon usage cần được xem xét kỹ lưỡng để đảm bảo biểu hiện gene hiệu quả trong E. coli.

2.1. Vấn Đề Về Biểu Hiện Đồng Thời Nhiều Gene Polycistron

Con đường sinh tổng hợp β-carotene liên quan đến nhiều enzyme khác nhau, mỗi enzyme được mã hóa bởi một gene riêng biệt. Để tổng hợp β-carotene hiệu quả, cần phải biểu hiện đồng thời tất cả các gene này. Việc thiết kế vector biểu hiện có khả năng chứa và biểu hiện đồng thời nhiều gene (polycistron) là một thách thức kỹ thuật. Cần phải đảm bảo rằng tất cả các gene đều được phiên mã và dịch mã hiệu quả, và các enzyme được tạo ra có hoạt tính sinh học cao.

2.2. Tối Ưu Hóa Biểu Hiện Gene Để Tăng Năng Suất β Carotene

Năng suất tổng hợp β-carotene phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của các gene mã hóa enzyme. Để đạt được năng suất cao, cần phải tối ưu hóa biểu hiện gene bằng cách lựa chọn promoter mạnh, trình tự RBS phù hợp và codon usage tối ưu cho E. coli. Ngoài ra, cần phải kiểm soát các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và nồng độ chất dinh dưỡng để đảm bảo biểu hiện gene ổn định và hiệu quả.

III. Phương Pháp Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene Hiệu Quả

Để giải quyết các thách thức trên, nghiên cứu này sử dụng phương pháp thiết kế vector biểu hiện dựa trên công nghệ DNA tái tổ hợp. Các gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene được khuếch đại bằng PCR, sau đó được gắn vào vector biểu hiện phù hợp. Vector biểu hiện được thiết kế để chứa promoter mạnh, trình tự RBS tối ưu và các marker chọn lọc. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được chọn lọc và kiểm tra khả năng biểu hiện gene.

3.1. Sử Dụng Công Nghệ DNA Tái Tổ Hợp Để Tạo Vector

Công nghệ DNA tái tổ hợp là một công cụ mạnh mẽ để thiết kế vector biểu hiện gene. Các gene mong muốn được khuếch đại bằng PCR, sau đó được cắt và gắn vào vector bằng enzyme giới hạn và enzyme ligase. Vector tái tổ hợp được thiết kế để chứa các yếu tố cần thiết cho biểu hiện gene, như promoter, RBS và terminator.

3.2. Lựa Chọn Vector Biểu Hiện Phù Hợp Cho Escherichia coli

Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp là rất quan trọng để đạt được năng suất cao trong tổng hợp β-carotene. Các vector biểu hiện E. coli có sẵn trên thị trường có nhiều đặc điểm khác nhau, như số lượng bản sao, promoter và marker chọn lọc. Cần phải lựa chọn vector phù hợp với mục tiêu nghiên cứu và đặc điểm của các gene cần biểu hiện.

3.3. Tối Ưu Hóa Trình Tự Promoter và Ribosome Binding Site RBS

Promoter và RBS là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện gene. Promoter quyết định tần suất phiên mã, trong khi RBS quyết định hiệu quả dịch mã. Cần phải tối ưu hóa trình tự promoter và RBS để đạt được mức độ biểu hiện gene cao nhất. Các công cụ sinh học phân tử có sẵn có thể giúp dự đoán và tối ưu hóa trình tự promoter và RBS.

IV. Ứng Dụng Vector Biểu Hiện Gene β Carotene Trong E

Các vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene được tạo ra trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để sản xuất β-carotene tái tổ hợp trong E. coli. β-carotene tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, như thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. Ngoài ra, các vector này cũng có thể được sử dụng để nghiên cứu con đường sinh tổng hợp β-carotene và tối ưu hóa quá trình sản xuất β-carotene.

4.1. Sản Xuất β Carotene Tái Tổ Hợp Trong Escherichia coli

Các vector biểu hiện được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu để biểu hiện gene. β-carotene được tích lũy trong tế bào vi khuẩn, sau đó được chiết xuất và tinh sạch. Năng suất tổng hợp β-carotene được đánh giá bằng các phương pháp phân tích hóa học.

4.2. Ứng Dụng β Carotene Tái Tổ Hợp Trong Công Nghiệp

β-carotene tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, như thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. β-carotene được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên, chất chống oxy hóa và tiền chất của vitamin A. Việc sản xuất β-carotene tái tổ hợp có thể giúp giảm chi phí và tăng tính bền vững của nguồn cung β-carotene.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Thiết Kế Thành Công Vector Biểu Hiện

Nghiên cứu đã thiết kế thành công hai vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY và trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene cho thấy tiềm năng ứng dụng của các vector này trong sản xuất β-carotene.

5.1. Tạo Vector Tái Tổ Hợp pR iEIBY và pET22 iEIBY

Quá trình thiết kế bao gồm nhiều bước, từ lựa chọn vector nền, khuếch đại gene bằng PCR, cắt và gắn gene vào vector, đến kiểm tra sự có mặt và chiều gắn của gene. Các vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY đã được xác nhận bằng điện di và phân tích trình tự.

5.2. Kiểm Tra Hoạt Động Của Gene Trong Vector Biểu Hiện

Các vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được nuôi cấy để kiểm tra khả năng biểu hiện gene. Kết quả cho thấy các gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY được biểu hiện trong E. coli, cho thấy tiềm năng sản xuất β-carotene.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Thiết Kế Vector Biểu Hiện

Nghiên cứu này đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene trong E. coli. Các vector được tạo ra có thể được sử dụng để sản xuất β-carotene tái tổ hợp và nghiên cứu con đường sinh tổng hợp β-carotene. Hướng phát triển tiếp theo là tối ưu hóa quá trình biểu hiện gene và tăng năng suất tổng hợp β-carotene.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Đóng Góp

Nghiên cứu đã cung cấp các vector biểu hiện hữu ích cho việc sản xuất β-carotene tái tổ hợp. Các vector này có thể được sử dụng bởi các nhà nghiên cứu khác để tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp sản xuất β-carotene hiệu quả hơn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai và Ứng Dụng Tiềm Năng

Hướng nghiên cứu tương lai bao gồm tối ưu hóa quá trình biểu hiện gene, tăng năng suất tổng hợp β-carotene và phát triển các phương pháp chiết xuất và tinh sạch β-carotene hiệu quả hơn. Các ứng dụng tiềm năng của β-carotene tái tổ hợp rất đa dạng, từ thực phẩm chức năng đến dược phẩm và mỹ phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

$\beta$-carotene ($C_{40}H_{56}$) là một sắc tố tự nhiên màu vàng cam thuộc nhóm carotenoid, giữ vai trò sinh học quan trọng trong cơ thể sinh vật và ứng dụng công nghiệp. Hợp chất này hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh nhờ hệ thống nối đôi liên hợp dài, có khả năng khử các gốc oxy tự do phản ứng (ROS) và gốc nitơ phản ứng (RNS), ngăn ngừa tổn thương tế bào và giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch cũng như sự phát triển của tế bào ung thư. Đồng thời, $\beta$-carotene là tiền chất trực tiếp của vitamin A; khi vào cơ thể, hợp chất được enzyme $15,15'$-dioxygenase phân cắt thành retinal và chuyển hóa tiếp thành retinol, hỗ trợ hình thành rhodopsin giúp duy trì thị lực và ngăn chặn thoái hóa điểm vàng hay bệnh quáng gà.

Theo báo cáo của BCC Research (2011), thị trường carotenoid toàn cầu đạt 1,2 tỷ USD vào năm 2010 và dự kiến đạt 1,4 tỷ USD vào năm 2018. Trong đó, $\beta$-carotene chiếm tỷ trọng lớn nhất với 262 triệu USD (21,8% thị phần) năm 2010 và ước tính tăng lên 334 triệu USD năm 2018 với tốc độ tăng trưởng bình quân 1,8%/năm.

Hiện nay, $\beta$-carotene thương mại được cung cấp qua hai con đường chính:

1. Tổng hợp hóa học: Chiếm khoảng 70% sản lượng thế giới (tiêu biểu từ các quy trình của BASF và Roche với quy mô khoảng 500 tấn/năm, giá thành 400–800 USD/kg). Tuy nhiên, sản phẩm tổng hợp hóa học chỉ chứa một đồng phân duy nhất, sử dụng liều cao có liên quan đến các biến đổi nhiễm sắc thể bất lợi.
2. Chiết xuất tự nhiên từ thực vật và vi sinh vật: Sản phẩm tự nhiên chứa hỗn hợp các đồng phân $\alpha$-, $\beta$-, và $\gamma$-carotene, mang hoạt tính sinh học cao hơn 10% so với dạng tổng hợp hóa học, có giá trị thương mại cao (1.000–2.000 USD/kg). Tuy vậy, khai thác từ thực vật (cà rốt, quả gấc) bị giới hạn bởi tính mùa vụ, hiệu suất thấp và sự phức tạp trong xây dựng, quản lý vùng nguyên liệu.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về carotenoid chủ yếu dừng ở mức độ khảo sát hàm lượng hoặc tách chiết quy mô nhỏ từ nguồn thực vật (lá đu đủ, đinh lăng, màng hạt gấc, lá trầu không), nguồn $\beta$-carotene cho dược phẩm và thực phẩm đa phần phải nhập khẩu với chi phí cao. Ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ DNA tái tổ hợp để thiết lập con đường trao đổi chất tổng hợp $\beta$-carotene trên chủng vi sinh vật chủ Escherichia coli là giải pháp khắc phục triệt để các hạn chế trên.

Hiệu suất biểu hiện protein và con đường chuyển hóa tái tổ hợp chịu ảnh hưởng lớn từ hệ vector biểu hiện, đặc biệt là số lượng bản sao (copy number) của plasmid và sự hiện diện của các trình tự điều hòa. Nhằm tạo tiền đề vật liệu di truyền cho việc sản xuất $\beta$-carotene tái tổ hợp, đề tài tập trung giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

• Mục đích nghiên cứu:
  • Thiết kế thành công các vector biểu hiện mang cụm polycistron gồm 5 gene mã hóa các enzyme xúc tác chuỗi phản ứng sinh tổng hợp $\beta$-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli.
  • Tạo cơ sở vật liệu nhằm kiểm tra ảnh hưởng của số lượng bản sao vector (hệ vector copy cao so với hệ vector copy thấp) đến năng suất sinh tổng hợp $\beta$-carotene.
• Mục tiêu/Nhiệm vụ nghiên cứu:
  • Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện số bản sao cao pRSET-A, tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY.
  • Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện số bản sao thấp pET22b(+), tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY.
• Đối tượng nghiên cứu: Các đoạn gene crtY, crtB (từ vi khuẩn Pantoea ananatis), cụm gene idi-crtE-crtI, các vector tách dòng và vector biểu hiện (pRSET-A, pR-iEI, pET22b(+), pLUG-B, pLUG-Y), cùng hai chủng vi khuẩn E. coli DH5$\alpha$ và E. coli BL21 (DE3).
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene – Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên, trong thời gian từ tháng 12/2014 đến tháng 06/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và con đường sinh tổng hợp

Sinh tổng hợp carotenoid nói chung và $\beta$-carotene nói riêng bắt nguồn từ tiền chất isoprenoid 5-carbon gồm Isopentenyl pyrophosphate (IPP) và Dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP), hình thành qua hai con đường chính:

• Con đường Mevalonate (MAV): Đi từ 3 phân tử Acetyl-CoA qua chất trung gian HMG-CoA và mevalonate dưới sự xúc tác của HMG-CoA reductase để tạo IPP, sau đó IPP isomerase đồng phân hóa thành DMAPP.
• Con đường Non-mevalonate (MEP/DOXP): Phổ biến ở vi khuẩn và lạp thể thực vật, ngưng tụ Pyruvate và Glyceraldehyde-3-phosphate tạo 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXD/DOXP), chuyển hóa thành MEP rồi tạo IPP và DMAPP.

Từ IPP và DMAPP, chuỗi phản ứng kéo dài mạch carbon diễn ra tuần tự dưới sự tham gia của các enzyme carotenogenic:

1. Enzyme IPP isomerase (mã hóa bởi gene idi) xúc tác chuyển đổi qua lại giữa IPP và DMAPP.
2. DMAPP kết hợp lần lượt với các phân tử IPP nhờ prenyltransferase tạo Geranyl pyrophosphate (GPP, $C_{10}$), Farnesyl pyrophosphate (FPP, $C_{15}$) và Geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, $C_{20}$, mã hóa bởi gene crtE).
3. Hai phân tử GGPP ngưng tụ tạo Phytoene ($C_{40}$, không màu) dưới sự xúc tác của Phytoene synthase (gene crtB).
4. Phytoene trải qua 4 bước khử hydro (dehydrogenation) nhờ Phytoene desaturase (gene crtI) để tạo thành Lycopene màu đỏ.
5. Lycopene cyclase (gene crtY) xúc tác phản ứng đóng hai vòng $\beta$-ionone ở hai đầu phân tử lycopene để tạo thành $\beta$-carotene.

Hệ thống biểu hiện dựa trên promoter T7 được kiểm soát chặt chẽ bởi repressor mã hóa từ gene lacI; khi có mặt chất cảm ứng Isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), sự ức chế được giải tỏa, cho phép T7 RNA polymerase của tế bào chủ phiên mã cụm gene mục tiêu.

Đặc điểm so sánh	Vector pRSET-A	Vector pET22b(+)
Nguồn gốc gốc sao chép (ori)	pUC origin	pBR322 origin
Số lượng bản sao (copy number)	200–500 bản sao (Copy cao)	15–20 bản sao (Copy thấp)
Promoter điều khiển	T7 promoter	T7 promoter
Chỉ thị chọn lọc	Gene kháng Ampicillin (bla)	Gene kháng Ampicillin (bla)
Thẻ hỗ trợ tinh sạch	N-terminal 6xHis-tag	C-terminal His-tag
Trình tự chuỗi tín hiệu	Không có	Có chuỗi tín hiệu pelB (vị trí 224–289)

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thiết kế in silico: Ứng dụng phần mềm Vector NTI phiên bản 11.5 (Invitrogen) để phân tích trình tự nucleotide, xác định khung đọc mở (ORF), lập bản đồ enzyme cắt giới hạn, tính toán kích thước đoạn chèn và mô phỏng chiến lược lắp ráp plasmid.
• Phương pháp lập bản đồ giới hạn và xử lý enzyme: Sử dụng các enzyme cắt giới hạn chuyên biệt của Thermo Scientific gồm EcoRI, HindIII, KpnI, XbaI, NcoI cùng hệ đệm Buffer Tango $2\times$ tương ứng để mở vòng vector, cắt thu đoạn gene ngoại lai và kiểm tra định hướng đoạn chèn (chiều thuận/nghịch).
• Điện di DNA trên gel agarose: Sử dụng bản gel agarose 1% pha trong đệm TAE $1\times$, bổ sung Ethidium bromide nồng độ $30,\mu\text{l/L}$. Quá trình điện di vận hành ở hiệu điện thế 80–110 V, cường độ 100 mA trong 35 phút; quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại (UV) bằng hệ thống máy Gel Logic 1500 (Kodak).
• Thu hồi và tinh sạch DNA từ gel agarose: Cắt phần gel chứa băng DNA đích dưới đèn soi UV, tinh sạch bằng bộ hóa chất GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) với các bước ly giải gel ở 55°C, liên kết cột silica, rửa loại muối bằng washing buffer và phản hấp phụ bằng elution buffer.
• Phản ứng gắn nối (Ligation): Thực hiện gắn vector mở vòng và đoạn chèn ngoại lai bằng enzyme T4 DNA ligase (Thermo Scientific) trong đệm $10\times$ T4 DNA Ligase buffer, ủ ở nhiệt độ 22°C trong thời gian 1 giờ.
• Tạo tế bào khả biến và biến nạp: Xử lý tế bào E. coli DH5$\alpha$ đạt pha log ($\text{OD}_{600} = 0{,}4 - 0{,}6$) bằng dung dịch $\text{CaCl}_2$ 0,1 M lạnh và glycerol 60% theo quy trình Hanahan (1983) cải tiến; biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến thông qua sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây, ủ phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 37°C trong 30 phút.
• Tách chiết DNA plasmid: Nuôi tăng sinh khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc LB lỏng bổ sung ampicillin ($100,\mu\text{g/ml}$), lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm; tách chiết plasmid bằng phương pháp ly giải SDS-kiềm (theo Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) gồm Dung dịch I (Tris-HCl 1 M pH 8, EDTA 0,5 M pH 8, Glucose 1 M), Dung dịch II (NaOH 3 M, SDS 10%) và Dung dịch III (CH3COOK 3 M, CH3COOH), kết tủa DNA bằng isopropanol và rửa tủa bằng cồn 70%.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày cơ sở khoa học và thực tiễn của nhu cầu $\beta$-carotene trong y dược, thực phẩm và dinh dưỡng. Đặt ra bài toán thiếu hụt nguồn cung $\beta$-carotene tự nhiên bền vững và sự cần thiết của công nghệ DNA tái tổ hợp. Xác định rõ mục đích thiết kế hai hệ thống vector mang polycistron 5 gene trên nền pRSET-A và pET22b(+), làm tiền đề đánh giá ảnh hưởng của số bản sao plasmid đến năng suất tổng hợp sắc tố trong E. coli.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện về cấu trúc phân tử ($C_{40}H_{56}$), tính chất lý hóa, vai trò bảo vệ sức khỏe (chống gốc tự do ROS, phòng xơ vữa động mạch qua ức chế oxy hóa LDL, ngăn ngừa ung thư và hỗ trợ thị giác). Phân tích chi tiết hai con đường sinh tổng hợp isoprenoid MAV và MEP, cùng chuỗi phản ứng carotenogenic từ IPP/DMAPP qua Phytoene, Lycopene đến $\beta$-carotene. Tổng kết các nguồn cung cấp tự nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học (Wittig, Grignard), đặc điểm tế bào chủ E. coli (DH5$\alpha$, BL21) và cấu trúc vector biểu hiện chứa promoter T7. Tổng thuật tình hình nghiên cứu quốc tế từ thập niên 1990 đến các nghiên cứu tăng năng suất bằng gene idi (như công bố của Yoon và cộng sự đạt $135,\text{mg/L}$), cũng như các hướng nghiên cứu carotenoid tại Việt Nam.

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả danh mục vật liệu sinh học gồm các chủng vi khuẩn, các vector nguồn mang gene (pR-iEI chứa sẵn 3 gene idi, crtI, crtE; pLUG-B mang crtB kích thước 930 bp; pLUG-Y mang crtY kích thước 1.161 bp; pET22b(+) mang gốc sao chép copy thấp). Quy định chi tiết các bước thiết kế in silico trên phần mềm Vector NTI 11.5, quy trình kỹ thuật di truyền: phản ứng cắt enzyme giới hạn mở vòng vector và loại bỏ chuỗi tín hiệu tiết pelB (vị trí 224–289 trên pET22b(+) bằng cặp enzyme EcoRI và XbaI), tinh sạch thôi gel, phản ứng ligase, chuẩn bị tế bào khả biến $\text{CaCl}_2$, biến nạp sốc nhiệt 42°C, tách chiết plasmid bằng SDS-kiềm và điện di agarose kiểm tra.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày chi tiết từng giai đoạn thực nghiệm lắp ráp cấu trúc vector biểu hiện:

• Thiết kế vector tái tổ hợp pR-iEIBY:
  • Cắt đoạn gene crtY (1.161 bp) từ pLUG-Y bằng EcoRI và HindIII, gắn vào vector pR-iEI mở vòng, thu nhận 768 khuẩn lạc biến nạp; sàng lọc ngẫu nhiên 10 dòng bằng điện di plasmid (10/10 dòng có kích thước lớn hơn đối chứng pR-iEI); kiểm tra cắt giải phóng đoạn chèn crtY bằng EcoRI/HindIII và xác định chiều gắn chính xác bằng cặp enzyme EcoRI/KpnI, tạo thành công trung gian pR-iEIY.
  • Cắt đoạn gene crtB (930 bp) từ pLUG-B và mở vòng vector pR-iEIY bằng EcoRI và KpnI, tiến hành gắn nối tạo vector hoàn chỉnh pR-iEIBY mang cụm 5 gene (idi-crtE-crtI-crtB-crtY); kiểm tra sự có mặt và cấu trúc đoạn chèn bằng phản ứng cắt kiểm chứng với EcoRI và NcoI.
• Thiết kế vector tái tổ hợp pET22-iEIBY:
  • Gắn gene crtY (1.161 bp) vào vector pET22b(+) tại vị trí nhận biết của EcoRI và HindIII, sàng lọc và kiểm tra định hướng gắn thành công vector trung gian pET22-Y.
  • Sử dụng cặp enzyme XbaI và EcoRI để đồng thời cắt mở vòng vector pET22-Y (loại bỏ đoạn tín hiệu pelB) và cắt thu nhận cụm 4 gene idi-crtE-crtI-crtB từ vector pR-iEIBY; gắn nối cụm 4 gene vào pET22-Y để tạo thành vector biểu hiện polycistron 5 gene pET22-iEIBY.
  • Kiểm tra sự có mặt và chiều gắn của cụm gene trên vector pET22-iEIBY bằng phân tích cắt hạn chế với XbaI/EcoRI.
• Kiểm tra sự biểu hiện: Biến nạp các vector tái tổ hợp vào chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) và so sánh sự tích lũy sắc tố giữa hệ vector copy cao (pR-iEIBY) và copy thấp (pET22-iEIBY).

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Đánh giá mức độ hoàn thành các mục tiêu khoa học đề ra, xác nhận đã làm chủ quy trình dòng hóa đa gene trên hai hệ thống vector biểu hiện khác nhau về số lượng bản sao, đồng thời đề xuất các nội dung cần tiếp tục hoàn thiện về tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và phân tích định lượng sản phẩm.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

1. Thiết kế thành công hệ vector copy cao pR-iEIBY:
   • Đã chèn thành công gene crtY (1.161 bp) vào vector nền pR-iEI tại vị trí EcoRI/HindIII, tạo vector trung gian pR-iEIY. Sau biến nạp thu nhận 768 khuẩn lạc, kiểm tra 10 dòng ngẫu nhiên trên gel agarose đều cho thấy sự tăng kích thước phân tử và giải phóng đúng băng 1.161 bp khi cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn.
   • Đã chèn tiếp gene crtB (930 bp) vào vị trí EcoRI/KpnI của pR-iEIY, hoàn thiện vector pR-iEIBY mang đầy đủ 5 gene (idi-crtE-crtI-crtB-crtY) dưới sự kiểm soát của T7 promoter trên nền vector copy cao pRSET-A.
2. Thiết kế thành công hệ vector copy thấp pET22-iEIBY:
   • Đã gắn thành công gene crtY vào vector pET22b(+) tại vị trí EcoRI/HindIII, tạo vector pET22-Y.
   • Đã loại bỏ thành công trình tự chuỗi tín hiệu tiết pelB (vị trí 224–289) trên pET22b(+) bằng cặp enzyme cắt XbaI/EcoRI nhằm đảm bảo protein tổng hợp được giữ lại trong tế bào chất, tương thích với điều kiện của pRSET-A.
   • Đã chuyển thành công cụm 4 gene idi-crtE-crtI-crtB từ pR-iEIBY sang pET22-Y tại vị trí XbaI/EcoRI, hoàn thành cấu trúc vector biểu hiện pET22-iEIBY mang cụm 5 gene hoàn chỉnh trên nền vector copy thấp.
3. Tạo vật liệu kiểm tra biểu hiện sinh học:
   • Biến nạp thành công các cấu trúc tái tổ hợp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3), xác nhận khả năng vận hành của con đường chuyển hóa tái tổ hợp trong tế bào chủ vi khuẩn.

Thông số cấu trúc	Vector tái tổ hợp pR-iEIBY	Vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
Hệ vector nền tảng	pRSET-A	pET22b(+)
Nhóm bản sao plasmid	Số lượng bản sao cao (200–500 copies)	Số lượng bản sao thấp (15–20 copies)
Cụm gene cấu trúc	Polycistron: idi - crtE - crtI - crtB - crtY	Polycistron: idi - crtE - crtI - crtB - crtY
Promoter điều hòa	T7 promoter	T7 promoter
Xử lý trình tự đặc biệt	Giữ nguyên khung cấu trúc tiêu chuẩn	Đã loại bỏ chuỗi tín hiệu tiết pelB
Chủng lưu giữ / biểu hiện	E. coli DH5$\alpha$ / E. coli BL21 (DE3)	E. coli DH5$\alpha$ / E. coli BL21 (DE3)

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện các vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY trên các chủng biểu hiện khác nhau của E. coli (như BL21 (DE3) pLysS, M15).
• Thực hiện tối ưu hóa các thông số lên men: nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời điểm bổ sung chất cảm ứng, nhiệt độ và tốc độ lắc nuôi cấy nhằm hạn chế sự hình thành thể vùi (inclusion bodies) và nâng cao hoạt tính enzyme.
• Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quang phổ hấp thụ để định tính, định lượng chính xác hàm lượng $\beta$-carotene sinh tổng hợp thu được từ sinh khối vi khuẩn tái tổ hợp.

Đóng góp của đề tài

• Xây dựng hoàn chỉnh chiến lược dòng hóa và lắp ráp cụm polycistron đa gene phức tạp (gồm 5 gene chức năng thuộc chuỗi sinh tổng hợp carotenoid) vào hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.
• Cung cấp nguồn vật liệu di truyền chuẩn hóa gồm hai vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY có cùng cấu trúc cụm gene biểu hiện nhưng khác biệt về số lượng bản sao, phục vụ trực tiếp cho các nghiên cứu chuyên sâu về tối ưu hóa trao đổi chất sinh tổng hợp $\beta$-carotene tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Phạm vi nghiên cứu của khóa luận tập trung chủ yếu vào công đoạn thiết kế, lắp ráp phân tử, tạo dòng và kiểm tra cấu trúc chính xác của hai vector tái tổ hợp mang cụm 5 gene in vitro và trên tế bào E. coli DH5$\alpha$; các dữ liệu về định lượng hiệu suất thu hồi $\beta$-carotene bằng HPLC, ảnh hưởng của các điều kiện lên men chi tiết cũng như phân tích mức độ biểu hiện phiên mã/dịch mã ở quy mô lớn chưa được triển khai toàn diện trong khuôn khổ đề tài.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Nuôi cấy thu nhận sinh khối và chiết xuất sắc tố từ các dòng vi khuẩn E. coli mang vector tái tổ hợp;
  2. Định lượng hàm lượng $\beta$-carotene bằng phương pháp HPLC để so sánh chính xác năng suất biểu hiện giữa hai hệ vector copy cao và copy thấp;
  3. Thử nghiệm bổ sung thêm các tiền chất hoặc tích hợp thêm các gene thuộc con đường MEP/MAV nhằm tối ưu hóa dòng chuyển hóa hướng tới ứng dụng sản xuất quy mô bán công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Kỹ thuật di truyền: Tham khảo chi tiết phương pháp thiết kế in silico bằng phần mềm Vector NTI 11.5, kỹ thuật dòng hóa nối tiếp nhiều đoạn gene (polycistronic cloning), và phương pháp lập bản đồ enzyme giới hạn để kiểm tra kích thước cũng như chiều gắn của đoạn chèn.
• Các nhóm nghiên cứu về kỹ thuật điều hướng trao đổi chất (Metabolic Engineering): Cung cấp tài liệu quy trình chuẩn về việc biến đổi chủng vi khuẩn không tự tổng hợp carotenoid (E. coli) thành chủng có khả năng sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên thông qua tái tổ hợp cụm enzyme ngoại lai.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình thiết kế lắp ráp cụ thể cụm 5 gene carotenoid (idi-crtE-crtI-crtB-crtY) và phương pháp loại bỏ chuỗi tín hiệu tiết pelB trên vector pET22b(+) bằng cặp enzyme XbaI/EcoRI nhằm chuẩn hóa điều kiện biểu hiện nội bào phục vụ mục đích so sánh số lượng bản sao plasmid.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mục đích của việc loại bỏ trình tự tín hiệu tiết pelB trên vector pET22b(+) là gì?

Trên vector pET22b(+) nguyên bản có chứa trình tự tín hiệu tiết N-terminal pelB (vị trí 224–289) quy định việc vận chuyển protein tái tổ hợp vào khoang chu chất (periplasm). Trong khi đó, vector pRSET-A không mang trình tự tín hiệu này và biểu hiện protein trong tế bào chất. Do đó, tác giả đã sử dụng cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI và XbaI để cắt bỏ đoạn pelB khi mở vòng vector pET22-Y, đảm bảo sản phẩm biểu hiện từ cả hai hệ vector đều lưu lại trong tế bào chất, tạo tính khách quan khi so sánh ảnh hưởng của số lượng bản sao plasmid đến năng suất sinh tổng hợp $\beta$-carotene.

2. Cụm 5 gene được đưa vào các vector biểu hiện gồm những gene nào và giữ vai trò gì?

Cụm 5 gene tham gia vào chuỗi phản ứng sinh tổng hợp $\beta$-carotene gồm:

• idi: Mã hóa enzyme IPP isomerase, xúc tác phản ứng đồng phân hóa chuyển đổi thuận nghịch giữa IPP và DMAPP.
• crtE: Mã hóa enzyme GGPP synthase, xúc tác gắn nối các phân tử IPP với DMAPP/GPP/FPP để tạo thành Geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, $C_{20}$).
• crtB: Kích thước 930 bp, mã hóa enzyme Phytoene synthase/desaturase, xúc tác phản ứng ngưng tụ hai phân tử GGPP tạo thành Phytoene ($C_{40}$).
• crtI: Mã hóa enzyme Phytoene desaturase, xúc tác chuỗi phản ứng khử hydro chuyển Phytoene không màu thành Lycopene màu đỏ.
• crtY: Kích thước 1.161 bp, mã hóa enzyme Lycopene cyclase, xúc tác phản ứng đóng hai vòng $\beta$-ionone ở đầu chuỗi lycopene để tạo thành $\beta$-carotene.

3. Hai hệ vector pRSET-A và pET22b(+) đại diện cho đặc tính kỹ thuật nào trong nghiên cứu?

Hai vector được chọn để đại diện cho hai nhóm plasmid có số lượng bản sao (copy number) khác nhau trong tế bào E. coli:

• pRSET-A: Mang gốc sao chép pUC ori, đại diện cho hệ vector có số lượng bản sao cao (khoảng 200–500 bản sao/tế bào).
• pET22b(+): Mang gốc sao chép pBR322 ori, đại diện cho hệ vector có số lượng bản sao thấp (khoảng 15–20 bản sao/tế bào). Cả hai đều vận hành dưới sự điều khiển phiên mã của promoter T7, phục vụ mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của mật độ bản sao plasmid đến hiệu quả sinh tổng hợp sắc tố.

4. Tác giả sử dụng các enzyme cắt giới hạn nào để tách dòng và kiểm tra chiều gắn của gene crtY vào vector pR-iEI?

Để thu nhận đoạn gene crtY (1.161 bp) từ vector tách dòng pLUG-Y và mở vòng vector pR-iEI, tác giả sử dụng cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI và HindIII. Sau khi gắn nối và biến nạp vào E. coli DH5$\alpha$, chiều gắn (định hướng đọc mã) của gene crtY trên vector tái tổ hợp pR-iEIY được kiểm tra và xác nhận chính xác thông qua phản ứng cắt phân tích bằng cặp enzyme EcoRI và KpnI.

5. Vì sao chủng E. coli DH5$\alpha$ được dùng trong tạo dòng mà không dùng E. coli BL21?

Chủng vi khuẩn E. coli DH5$\alpha$ mang đột biến alen recA1 (bất hoạt hệ thống tái tổ hợp tương đồng), giúp hạn chế hiện tượng tái tổ hợp ngoài ý muốn, tạo độ ổn định cao cho các phân tử DNA ngoại lai, thuận lợi cho quá trình biến nạp, nhân dòng và lưu trữ plasmid. Ngược lại, chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa T7 RNA polymerase và đột biến khuyết các protease ompT và Lon, có đặc tính biến nạp kém hơn nên chuyên dùng cho mục đích cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp thay vì tạo dòng phân tử.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vũ Hoài Nam đã hoàn thành toàn diện việc thiết kế in silico và chế tạo thực nghiệm hai hệ vector biểu hiện mang cụm polycistron gồm 5 gene (idi-crtE-crtI-crtB-crtY) xúc tác con đường sinh tổng hợp $\beta$-carotene trên nền tảng vector copy cao pRSET-A (tạo pR-iEIBY) và vector copy thấp pET22b(+) (tạo pET22-iEIBY). Toàn bộ cấu trúc đoạn chèn, kích thước gene và chiều gắn đều được kiểm chứng chính xác qua hệ thống enzyme cắt giới hạn và điện di gel agarose. Công trình cung cấp hệ thống vật liệu di truyền và quy trình kỹ thuật chuẩn xác, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho các nghiên cứu đánh giá và tối ưu hóa năng suất sản xuất $\beta$-carotene tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (Schmidt- Dannert, 2000) [57]. Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng (Vershinin, 1999) [70] và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003) [63]. Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong số đó là cần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007) [52]. β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, thuộc nhóm carotenoid.

Chúng được tìm thấy ở một số loại cây như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry, Netto et al. β-carotene được biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A – một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al. 2003; Stutz, Bresgen et al. Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh về mắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong khẩu phần ăn (Harjes, Rocheford et al.

Ở động vật, β-carotene được sử dụng trong suốt quá trình sinh trưởng, chúng tham gia vào một loạt các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triển biểu bì của mô, cấu trúc xương và tăng cường khả năng miễn dịch (Sklan, 1987) [60]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quá trình phát triển của tế bào ung thư, và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al. Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018.

Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11]. Để đáp ứng nhu cầu đó β- carotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là con đường tổng hợp hóa 2 học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al. 2011, Vachali, Bhosale et al. Sản phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1 đồng phân duy nhất, trong khi đó β-carotene tự nhiên không những có chứa β-carotene mà còn có α-carotene và γ- carotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạt tính sinh học cao hơn 10% so với tổng hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al.

and El-Baroty. Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu. Vấn đề đặt ra là cần phải có phương pháp khác để tạo nguồn cung β-carotene tự nhiên. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụng các kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên.

Các nghiên cứu về tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp β- carotene đang gặt hái được những thành công nhất định. Năm 1990, Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thành công đầu tiên trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al. 1991) [45] và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al.