Luận văn thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β carotene trong vi khuẩn escherichia coli

Chuyên khảo phân tích Luận văn thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Vũ Hoài Nam
• Người hướng dẫn: Th.S. Ma Thị Trang
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene Mã Hóa Enzyme Tổng Hợp β-Carotene Trong Escherichia coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Khái quát về sắc tố β-carotene
• 2.1.1. Cấu trúc và tính chất lý hóa
• 2.1.2. Vai trò của sắc tố β-carotene với con người
• 2.1.2.1. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người
• 2.1.2.2. Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp
• 2.2. Con đường tổng hợp β-carotene
• 2.3. Nguồn cung cấp β-carotene
• 2.3.1. Nguồn cung từ thực vật
• 2.3.2. Nguồn cung từ vi sinh vật
• 2.3.3. Nguồn cung từ tổng hợp hóa học
• 2.4. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên
• 2.4.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp
• 2.4.2. Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli
• 2.4.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.4.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.4.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp thiết kế in silico
• 3.5.2. Phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 3.5.3. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose
• 3.5.4. Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose
• 3.5.5. Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện
• 3.5.6. Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến
• 3.5.7. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt
• 3.5.8. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY
• 4.1.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY
• 4.1.2. Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY
• 4.2. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
• 4.2.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y
• 4.2.2. Kết quả gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
• 4.3. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene

Carotenoid là sắc tố tự nhiên quan trọng, đặc biệt là β-carotene, được tìm thấy trong thực vật và vi sinh vật. β-carotene có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng và sức khỏe con người, là tiền chất của vitamin A và có khả năng chống oxy hóa mạnh. Nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng, thúc đẩy các nghiên cứu về sản xuất β-carotene tự nhiên bằng công nghệ sinh học. Việc thiết kế vector biểu hiện hiệu quả là yếu tố then chốt để tăng năng suất tổng hợp β-carotene trong các hệ thống vi sinh vật. Nghiên cứu này tập trung vào thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli, một đối tượng nghiên cứu phổ biến trong kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử.

1.1. Giới Thiệu Về Sắc Tố β Carotene và Ứng Dụng

β-carotene là một carotenoid quan trọng, có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và dung môi hữu cơ. Nó đóng vai trò là tiền chất của vitamin A, cần thiết cho thị lực và chức năng miễn dịch. Ngoài ra, β-carotene còn có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Ứng dụng của β-carotene rất đa dạng, từ thực phẩm chức năng, dược phẩm đến mỹ phẩm. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018. Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11].

1.2. Vai Trò Của Escherichia coli Trong Biểu Hiện Gene

Escherichia coli (E. coli) là một vi khuẩn gram âm, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền nhờ khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng biến đổi gen và có hệ thống di truyền được nghiên cứu kỹ lưỡng. E. coli là một nền tảng lý tưởng để biểu hiện gene và sản xuất protein tái tổ hợp. Việc thiết kế vector biểu hiện E. coli phù hợp là yếu tố quan trọng để đạt được năng suất cao trong tổng hợp β-carotene. Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32].

II. Thách Thức Trong Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene

Việc thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene không phải là một nhiệm vụ đơn giản. Các enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp β-carotene thường được mã hóa bởi nhiều gene khác nhau, đòi hỏi phải thiết kế vector có khả năng chứa và biểu hiện đồng thời nhiều gene (polycistron). Ngoài ra, việc tối ưu hóa biểu hiện gene để đạt được năng suất cao cũng là một thách thức lớn. Các yếu tố như promoter, trình tự ribosome binding site (RBS) và codon usage cần được xem xét kỹ lưỡng để đảm bảo biểu hiện gene hiệu quả trong E. coli.

2.1. Vấn Đề Về Biểu Hiện Đồng Thời Nhiều Gene Polycistron

Con đường sinh tổng hợp β-carotene liên quan đến nhiều enzyme khác nhau, mỗi enzyme được mã hóa bởi một gene riêng biệt. Để tổng hợp β-carotene hiệu quả, cần phải biểu hiện đồng thời tất cả các gene này. Việc thiết kế vector biểu hiện có khả năng chứa và biểu hiện đồng thời nhiều gene (polycistron) là một thách thức kỹ thuật. Cần phải đảm bảo rằng tất cả các gene đều được phiên mã và dịch mã hiệu quả, và các enzyme được tạo ra có hoạt tính sinh học cao.

2.2. Tối Ưu Hóa Biểu Hiện Gene Để Tăng Năng Suất β Carotene

Năng suất tổng hợp β-carotene phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của các gene mã hóa enzyme. Để đạt được năng suất cao, cần phải tối ưu hóa biểu hiện gene bằng cách lựa chọn promoter mạnh, trình tự RBS phù hợp và codon usage tối ưu cho E. coli. Ngoài ra, cần phải kiểm soát các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và nồng độ chất dinh dưỡng để đảm bảo biểu hiện gene ổn định và hiệu quả.

III. Phương Pháp Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene Hiệu Quả

Để giải quyết các thách thức trên, nghiên cứu này sử dụng phương pháp thiết kế vector biểu hiện dựa trên công nghệ DNA tái tổ hợp. Các gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene được khuếch đại bằng PCR, sau đó được gắn vào vector biểu hiện phù hợp. Vector biểu hiện được thiết kế để chứa promoter mạnh, trình tự RBS tối ưu và các marker chọn lọc. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được chọn lọc và kiểm tra khả năng biểu hiện gene.

3.1. Sử Dụng Công Nghệ DNA Tái Tổ Hợp Để Tạo Vector

Công nghệ DNA tái tổ hợp là một công cụ mạnh mẽ để thiết kế vector biểu hiện gene. Các gene mong muốn được khuếch đại bằng PCR, sau đó được cắt và gắn vào vector bằng enzyme giới hạn và enzyme ligase. Vector tái tổ hợp được thiết kế để chứa các yếu tố cần thiết cho biểu hiện gene, như promoter, RBS và terminator.

3.2. Lựa Chọn Vector Biểu Hiện Phù Hợp Cho Escherichia coli

Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp là rất quan trọng để đạt được năng suất cao trong tổng hợp β-carotene. Các vector biểu hiện E. coli có sẵn trên thị trường có nhiều đặc điểm khác nhau, như số lượng bản sao, promoter và marker chọn lọc. Cần phải lựa chọn vector phù hợp với mục tiêu nghiên cứu và đặc điểm của các gene cần biểu hiện.

3.3. Tối Ưu Hóa Trình Tự Promoter và Ribosome Binding Site RBS

Promoter và RBS là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện gene. Promoter quyết định tần suất phiên mã, trong khi RBS quyết định hiệu quả dịch mã. Cần phải tối ưu hóa trình tự promoter và RBS để đạt được mức độ biểu hiện gene cao nhất. Các công cụ sinh học phân tử có sẵn có thể giúp dự đoán và tối ưu hóa trình tự promoter và RBS.

IV. Ứng Dụng Vector Biểu Hiện Gene β Carotene Trong E

Các vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene được tạo ra trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để sản xuất β-carotene tái tổ hợp trong E. coli. β-carotene tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, như thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. Ngoài ra, các vector này cũng có thể được sử dụng để nghiên cứu con đường sinh tổng hợp β-carotene và tối ưu hóa quá trình sản xuất β-carotene.

4.1. Sản Xuất β Carotene Tái Tổ Hợp Trong Escherichia coli

Các vector biểu hiện được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu để biểu hiện gene. β-carotene được tích lũy trong tế bào vi khuẩn, sau đó được chiết xuất và tinh sạch. Năng suất tổng hợp β-carotene được đánh giá bằng các phương pháp phân tích hóa học.

4.2. Ứng Dụng β Carotene Tái Tổ Hợp Trong Công Nghiệp

β-carotene tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, như thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. β-carotene được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên, chất chống oxy hóa và tiền chất của vitamin A. Việc sản xuất β-carotene tái tổ hợp có thể giúp giảm chi phí và tăng tính bền vững của nguồn cung β-carotene.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Thiết Kế Thành Công Vector Biểu Hiện

Nghiên cứu đã thiết kế thành công hai vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY và trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene cho thấy tiềm năng ứng dụng của các vector này trong sản xuất β-carotene.

5.1. Tạo Vector Tái Tổ Hợp pR iEIBY và pET22 iEIBY

Quá trình thiết kế bao gồm nhiều bước, từ lựa chọn vector nền, khuếch đại gene bằng PCR, cắt và gắn gene vào vector, đến kiểm tra sự có mặt và chiều gắn của gene. Các vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY đã được xác nhận bằng điện di và phân tích trình tự.

5.2. Kiểm Tra Hoạt Động Của Gene Trong Vector Biểu Hiện

Các vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được nuôi cấy để kiểm tra khả năng biểu hiện gene. Kết quả cho thấy các gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY được biểu hiện trong E. coli, cho thấy tiềm năng sản xuất β-carotene.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Thiết Kế Vector Biểu Hiện

Nghiên cứu này đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene trong E. coli. Các vector được tạo ra có thể được sử dụng để sản xuất β-carotene tái tổ hợp và nghiên cứu con đường sinh tổng hợp β-carotene. Hướng phát triển tiếp theo là tối ưu hóa quá trình biểu hiện gene và tăng năng suất tổng hợp β-carotene.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Đóng Góp

Nghiên cứu đã cung cấp các vector biểu hiện hữu ích cho việc sản xuất β-carotene tái tổ hợp. Các vector này có thể được sử dụng bởi các nhà nghiên cứu khác để tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp sản xuất β-carotene hiệu quả hơn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai và Ứng Dụng Tiềm Năng

Hướng nghiên cứu tương lai bao gồm tối ưu hóa quá trình biểu hiện gene, tăng năng suất tổng hợp β-carotene và phát triển các phương pháp chiết xuất và tinh sạch β-carotene hiệu quả hơn. Các ứng dụng tiềm năng của β-carotene tái tổ hợp rất đa dạng, từ thực phẩm chức năng đến dược phẩm và mỹ phẩm.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Sắc tố carotenoid là nhóm hợp chất tự nhiên đóng vai trò then chốt trong chuỗi cung ứng công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm toàn cầu. Theo báo cáo từ tổ chức nghiên cứu thị trường BCC Research, quy mô thị trường carotenoid toàn cầu đã đạt 1,2 tỷ USD vào năm 2010 và đạt mốc 1,4 tỷ USD vào năm 2018 với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm (CAGR) là 1,8%. Trong cơ cấu đó, $\beta$-carotene chiếm tỷ trọng thương mại lớn nhất với giá trị 262 triệu USD (chiếm 21,8% tổng thị phần) vào năm 2010 và mở rộng lên 334 triệu USD vào năm 2018.

       CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP CAROTENOID TRONG VI SINH VẬT
       
  Pyruvate + Glyceraldehyde-3-phosphate (Con đường MEP/DOXP)
               GGPP (C20 Diterpenoid)
               Phytoene (C40 Hydrocarbon)
               Lycopene (C40 Đỏ)
             β-Carotene (C40 Vàng/Cam)

Nhu cầu ứng dụng $\beta$-carotene tăng nhanh nhờ vào khả năng chống oxy hóa vượt trội, dọn dẹp các gốc oxy phản ứng (ROS - Reactive Oxygen Species), ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), phòng ngừa xơ vữa động mạch và ngăn chặn các đột biến tế bào gây ung thư. Đặc biệt, $\beta$-carotene là tiền chất trực tiếp của vitamin A (provitamin A). Dưới sự xúc tác của enzyme 15,15'-dioxygenase, một phân tử $\beta$-carotene được phân cắt thành hai phân tử retinal, chuyển hóa tiếp thành retinol nhằm duy trì sắc tố Rhodopsin tại võng mạc mắt, giải quyết tình trạng thiếu hụt vitamin A đang ảnh hưởng đến hàng triệu trẻ em theo thống kê của WHO/FAO.

Tuy nhiên, nguồn cung $\beta$-carotene hiện nay đang đối mặt với những thách thức nghiêm trọng:

• Chiết xuất từ thực vật tự nhiên (cà rốt, quả gấc, cọ dầu): Giá thành cao ($1.000 - $2.000/kg), phụ thuộc chặt chẽ vào mùa vụ, điều kiện thổ nhưỡng, hiệu suất chiết xuất thấp và quy trình tinh chế dung môi hữu cơ phức tạp.
• Tổng hợp hóa học (công nghệ BASF, Roche): Giá thành cạnh tranh hơn ($400 - $800/kg) nhưng chỉ chứa một đồng phân lập thể trans duy nhất, sử dụng hóa chất độc hại trong phản ứng Wittig/Grignard và có nguy cơ gây biến đổi nhiễm sắc thể khi sử dụng liều cao dài ngày. Sản phẩm tự nhiên chứa hỗn hợp các đồng phân $\alpha$-, $\beta$-, $\gamma$-carotene mang hoạt tính sinh học cao hơn 10%.

Nhằm giải quyết triệt để bài toán nguyên liệu, đề tài tập trung vào phương pháp kỹ thuật điều hướng trao đổi chất (Metabolic Engineering) và công nghệ DNA tái tổ hợp để biểu hiện nhân tạo con đường sinh tổng hợp $\beta$-carotene trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Thiết kế và tối ưu hóa cấu trúc vector biểu hiện mang cụm polycistron gồm 5 gene (idi - crtE - crtI - crtB - crtY) trên nền tảng vector có số bản sao cao pRSET-A (200-500 copies/cell), tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY.
2. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang cụm polycistron 5 gene (idi - crtE - crtI - crtB - crtY) trên nền tảng vector có số bản sao thấp/trung bình pET22b(+) (15-20 copies/cell), loại bỏ trình tự tín hiệu tiết pelB, tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY.
3. Kiểm tra định tính và định lượng sự hiện diện, chiều đọc mở (ORF) của các gene chèn bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn (Restriction Mapping) và đánh giá khả năng sinh tổng hợp sắc tố $\beta$-carotene tái tổ hợp trong tế bào chủ E. coli BL21 (DE3).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí đánh giá	Chiết xuất thực vật (Gấc, Cà rốt)	Tổng hợp hóa học (BASF / Roche)	Sinh tổng hợp vi sinh tái tổ hợp (E. coli)
Hoạt tính sinh học	Cao (Chứa đồng phân $\alpha, \beta, \gamma$)	Thấp hơn 10% (Chỉ có đồng phân trans)	Rất cao (Tương đương hoặc vượt trội tự nhiên)
Tính ổn định nguồn cung	Kém (Phụ thuộc mùa vụ, khí hậu)	Cao (Chủ động quy mô hóa chất)	Rất cao (Lên men công nghiệp liên tục quanh năm)
Chi phí sản xuất	$1.000 - $2.000 / kg	$400 - $800 / kg	Dự kiến tối ưu: $300 - $500 / kg
Mức độ an toàn thực phẩm	Tuyệt đối an toàn	Nguy cơ tồn dư dung môi, hóa chất	An toàn sinh học cao (Non-toxic)
Tác động môi trường	Chiếm dụng diện tích đất nông nghiệp	Phát thải dung môi hữu cơ nặng	Thân thiện môi trường, kinh tế tuần hoàn

               MA TRẬN ƯU TIÊN YÊU CẦU KỸ THUẬT (MoSCoW)

Thiết kế hệ thống

Toàn bộ con đường chuyển hóa từ tiền chất đường phân đến $\beta$-carotene đòi hỏi sự tham gia đồng bộ của 5 enzyme chủ chốt:

• idi (Isopentenyl diphosphate isomerase): Xúc tác chuyển hóa thuận nghịch giữa Isopentenyl pyrophosphate (IPP) và Dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP), điểm nút điều hòa tốc độ (rate-limiting step). Bổ sung gene idi làm tăng sản lượng carotenoid từ 33 mg/L lên 135 mg/L (tăng gấp 4 lần theo nghiên cứu của Yoon et al.).
• crtE (GGPP synthase): Ngưng tụ DMAPP với 3 phân tử IPP tạo Geranylgeranyl pyrophosphate ($C_{20}$ - GGPP).
• crtB (Phytoene synthase - 930 bp): Ngưng tụ 2 phân tử GGPP tạo Phytoene ($C_{40}$).
• crtI (Phytoene desaturase): Khử hydro 4 lần liên tiếp biến đổi Phytoene không màu thành Lycopene màu đỏ.
• crtY (Lycopene cyclase - 1161 bp): Đóng vòng hai đầu phân tử Lycopene tạo thành $\beta$-carotene ($C_{40}H_{56}$) màu vàng cam.

       CẤU TRÚC VẬN HÀNH CỦA POLYCISTRON TRÊN VECTOR BIỂU HIỆN
       
              
Backbone 1: pRSET-A (2.9 kb, pUC ori: 200-500 copies/cell, bla gene, N-terminal His-tag)
Backbone 2: pET22b(+) (5.4 kb, pBR322 ori: 15-20 copies/cell, bla gene, lacI repressor, pelB excised)

                 SO SÁNH BẢN ĐỒ CẤU TRÚC HAI HỆ THỐNG VECTOR
 
      Vector pRSET-A (~2.9 kb)                  Vector pET22b(+) (~5.4 kb)

Methodology

Quy trình phát triển và kiểm chứng tuân thủ các quy chuẩn sinh học phân tử chuẩn hóa:

1. Thiết kế in silico: Mô phỏng vị trí cắt giới hạn, phân tích khung đọc mở (ORF), kiểm tra điểm tương thích enzyme giới hạn bằng phần mềm chuyên dụng Vector NTI phiên bản 11.5 (Invitrogen).
2. Kỹ thuật cắt và nối DNA: Sử dụng các enzyme giới hạn nhiệt độ ổn định (EcoRI, HindIII, XbaI, KpnI, NcoI) cùng đệm Tango buffer 2X (Thermo Scientific). Gắn nối phân tử bằng T4 DNA Ligase tại 22°C trong 60 phút.
3. Tinh sạch phân tử: Điện di gel agarose 1.0% trong đệm TAE 1X (Tris-Acetate-EDTA), nhuộm Ethidium Bromide ($30,\mu\text{g/L}$), thu hồi phân đoạn DNA quan tâm qua cột silica bằng bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).
4. Biến nạp di truyền: Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến $\text{CaCl}_2$ (Hanahan, 1983). Thực hiện sốc nhiệt chính xác tại 42°C trong 90 giây, ủ phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 37°C trong 30 phút, sàng lọc trên đĩa thạch LB bổ sung Ampicillin ($100,\mu\text{g/mL}$).
5. Tách chiết và kiểm tra: Tách chiết DNA plasmid theo nguyên lý biến tính kiềm SDS-NaOH (Sambrook et al., 1989), kiểm tra bản đồ giới hạn giải phóng đoạn chèn.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình lắp ráp chuỗi 5 gene được chia thành hai nhánh độc lập ứng với hai hệ vector đích:

                            QUY TRÌNH THIẾT KẾ VÀ DÒNG HÓA
                            
         [Nhánh 1: pR-iEIBY]                           [Nhánh 2: pET22-iEIBY]
         
   pLUG-Y (crtY: 1161 bp)                        pLUG-Y (crtY: 1161 bp)
   Gắn vào pR-iEI (EcoRI/HindIII)                Gắn vào pET22b(+) (EcoRI/HindIII)
       Vector pR-iEIY                                Vector pET22-Y
    Vector pR-iEIBY (Hoàn chỉnh)                  Vector pET22-iEIBY (Hoàn chỉnh)

# Mô phỏng thuật toán kiểm tra in silico bản đồ giới hạn bằng Python (BioPython concept)
class RestrictionVerifier:
    def __init__(self, plasmid_name, size_bp, restriction_sites):
        self.plasmid_name = plasmid_name
        self.size_bp = size_bp
        self.restriction_sites = restriction_sites  # Dict: {'Enzyme': [positions]}

    def simulate_double_digest(self, enzyme1, enzyme2):
        cuts = sorted(self.restriction_sites.get(enzyme1, []) + self.restriction_sites.get(enzyme2, []))
        if len(cuts) < 2:
            return [self.size_bp]
        fragments = []
        for i in range(len(cuts)):
            next_pos = cuts[(i + 1) % len(cuts)]
            if next_pos > cuts[i]:
                fragments.append(next_pos - cuts[i])
            else:
                fragments.append((self.size_bp - cuts[i]) + next_pos)
        return sorted(fragments, reverse=True)

# Khởi tạo mô hình plasmid pR-iEIBY
pr_ieiby = RestrictionVerifier("pR-iEIBY", 8500, {"EcoRI": [1200], "HindIII": [2361], "NcoI": [3291]})
print(f"Sản phẩm cắt dự kiến pR-iEIBY (EcoRI/HindIII): {pr_ieiby.simulate_double_digest('EcoRI', 'HindIII')} bp")

Testing và validation

1. Lắp ráp và chọn lọc vector pR-iEIY & pR-iEIBY

• Biến nạp sản phẩm nối pR-iEI + gene crtY vào E. coli DH5α thu được 768 khuẩn lạc kháng ampicillin.
• Tách chiết plasmid từ 10 dòng khuẩn lạc ngẫu nhiên. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1.0% cho thấy cả 10 dòng đều có kích thước lớn hơn đáng kể so với vector đối chứng ban đầu pR-iEI, tồn tại ở hai dạng cấu hình: siêu xoắn (supercoiled) và vòng giãn (relaxed circle).
• Phản ứng cắt kiểm tra bằng enzyme kép EcoRI và HindIII giải phóng chính xác phân đoạn băng DNA kích thước 1161 bp tương ứng với gene crtY. Cắt kiểm tra chiều chèn ORF bằng EcoRI và KpnI xác nhận gene gắn đúng chiều phiên mã xuôi của T7 promoter.
• Tiếp tục đưa gene crtB (930 bp) từ pLUG-B vào pR-iEIY bằng vị trí cắt EcoRI và KpnI. Cắt kiểm tra cấu trúc pR-iEIBY bằng EcoRI và NcoI giải phóng băng kích thước chuẩn 930 bp, hoàn thiện tổ hợp 5 gene liên tục trên nền tảng pRSET-A.

2. Lắp ráp và chọn lọc vector pET22-Y & pET22-iEIBY

• Gene crtY được mở dòng gắn vào vị trí EcoRI - HindIII trên pET22b(+), tạo vector trung gian pET22-Y.
• Cắt giải phóng toàn bộ cụm 4 gene (idi - crtE - crtI - crtB) kích thước xấp xỉ 4,5 kb từ pR-iEIBY bằng enzyme kép XbaI và EcoRI. Đồng thời, xử lý pET22-Y bằng XbaI/EcoRI nhằm mở vòng vector và loại bỏ triệt để đoạn tín hiệu tiết pelB (vị trí nucleotide 224-289).
• Phản ứng nối phân tử tạo thành vector pET22-iEIBY. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt với XbaI và EcoRI xuất hiện hai băng rõ nét: băng vector pET22-Y (~6,5 kb) và băng cụm gene chèn (~4,5 kb).

               KẾT QUẢ ĐIỆN DI MÔ PHỎNG SẢN PHẨM CẮT KIỂM TRA
  Lane M: Thang DNA chuẩn 1kb | Lane 1: pR-iEIY (EcoRI/HindIII) | Lane 2: pET22-iEIBY (XbaI/EcoRI)
  
      Lane M            Lane 1 (pR-iEIY)         Lane 2 (pET22-iEIBY)

Kết quả đạt được

• Hoàn thành 100% mục tiêu dòng hóa: Tạo dựng thành công hai cấu trúc biểu hiện polycistron 5 gene hoàn chỉnh gồm pR-iEIBY và pET22-iEIBY.
• Đánh giá biểu hiện kiểu hình: Biến nạp hai vector tái tổ hợp vào chủng biểu hiện chuyên dụng E. coli BL21 (DE3). Dưới điều kiện cảm ứng với IPTG ($0,5,\text{mM}$) ở 30°C trong 12 giờ, dịch nuôi cấy vi khuẩn chuyển từ màu trắng đục nguyên thủy sang màu vàng da cam đặc trưng của sắc tố $\beta$-carotene, chứng minh chuỗi 5 enzyme ngoại lai phiên mã và dịch mã với hoạt tính sinh học hoàn chỉnh.
• Tương quan số lượng bản sao: Hệ vector số bản sao thấp pET22-iEIBY (15-20 bản sao) cho thấy khả năng duy trì sinh khối tế bào ổn định hơn, giảm thiểu áp lực trao đổi chất (metabolic burden) và hạn chế tối đa hiện tượng tạo thể vùi (inclusion bodies) so với hệ số bản sao cao pR-iEIBY (200-500 bản sao).

---

Đổi mới và đóng góp

1. Tích hợp cụm Polycistron 5 gene đồng bộ: Thay vì sử dụng nhiều plasmid mang các gene riêng lẻ (gây áp lực chọn lọc kháng sinh đa tầng và bất ổn định phân bào), nghiên cứu đã tích hợp toàn bộ con đường 5 enzyme vào một operon nhân tạo duy nhất dưới sự điều khiển của promoter cực mạnh T7.
2. Khắc phục điểm nghẽn bằng gene idi: Đưa trực tiếp gene mã hóa IPP isomerase vào cấu trúc, giúp tăng cường 300% - 400% nguồn tiền chất DMAPP/IPP nội bào, loại bỏ nút thắt chuyển hóa lớn nhất trong sinh tổng hợp isoprenoid ở vi khuẩn.
3. Loại bỏ chính xác trình tự tín hiệu tiết pelB: Thiết kế kỹ thuật cắt chọn lọc XbaI - EcoRI để loại bỏ chuỗi pelB trên pET22b(+), đảm bảo các enzyme kỵ nước của con đường carotenoid lưu giữ và tương tác tối ưu tại màng sinh chất tế bào chất.

Thông số so sánh	Phương pháp truyền thống (Tách chiết thực vật)	Phương pháp hóa học (Tổng hợp hữu cơ)	Cải tiến đề tài (pR-iEIBY / pET22-iEIBY)
Thời gian sản xuất	3 - 6 tháng (Theo vụ mùa)	48 - 72 giờ phản ứng	16 - 24 giờ lên men vi sinh
Năng suất tối ưu	< 0.1% khối lượng khô	Hiệu suất phản ứng 60-70%	Biểu hiện tích lũy cao trong sinh khối
Độ phức tạp tinh sạch	Rất phức tạp (Tạp chất diệp lục)	Phức tạp (Tách phụ phẩm đồng phân)	Đơn giản (Ly tâm thu sinh khối, trích ly dung môi)
Độ tinh sạch sinh học	Lẫn sáp và lipid thực vật	Tồn dư kim loại nặng/xúc tác	Tinh khiết cao, an toàn sinh học

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

              SƠ ĐỒ QUY TRÌNH TRIỂN KHAI VÀ THƯƠNG MẠI HÓA
              
   [E. coli BL21(DE3) Mang Vector pET22-iEIBY]
            [Thu nhận sinh khối vi khuẩn]
         [Trích ly bằng Acetone / Hexane / Siêu tới hạn CO2]
 [Dược phẩm & Thực phẩm]    [Thức ăn chăn nuôi / Thủy sản]
 • Viên nang Provitamin A    • Phụ gia tạo màu lòng đỏ trứng
 • Hợp chất chống oxy hóa    • Tăng cường miễn dịch tôm, cá hồi

Chiến lược mở rộng quy mô (Scale-up)

• Hệ thống nuôi cấy: Chuyển đổi từ bình tam giác rung lắc phòng thí nghiệm (Shaker flask) sang hệ thống bioreactor lên men nạp mẻ liên tục (Fed-batch fermentation) kiểm soát chặt chẽ $pO_2$ (>30%), pH (6.8 - 7.2) và nhiệt độ (28°C - 30°C).
• Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit): Ước tính chi phí sản xuất vi sinh đạt khoảng $350/kg $\beta$-carotene thành phẩm ở quy mô pilot 500L, mang lại biên lợi nhuận ròng trên 45% so với giá bán $\beta$-carotene tự nhiên trên thị trường ($1.000 - $1.500/kg), thời gian hoàn vốn đầu tư ước tính 18-24 tháng.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Hệ thống vẫn phụ thuộc vào kháng sinh ampicillin để duy trì áp lực chọn lọc plasmid trong quá trình nuôi cấy dài ngày.
• Hiện tượng rò rỉ biểu hiện promoter T7 ở pha sinh trưởng theo hàm mũ có thể làm giảm mật độ tế bào cực đại của chủng E. coli.

Hướng phát triển tiếp theo

• Sử dụng kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 hoặc tái tổ hợp tương đồng $\lambda$-Red recombineering để tích hợp trực tiếp cụm 5 gene vào hệ gen (nhiễm sắc thể) của E. coli, tạo chủng ổn định không cần bổ sung kháng sinh.
• Tối ưu hóa vị trí liên kết ribosome (RBS - Ribosome Binding Site) cho từng gene thành phần để cân bằng chính xác tỷ lệ các enzyme, hạn chế sự tích lũy các chất trung gian như Phytoene hay Lycopene.

---

Đối tượng hưởng lợi

                   ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI VÀ GIÁ TRỊ MANG LẠI
                   

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để biến nạp và biểu hiện hai vector này là gì?

Hệ vector pR-iEIBY và pET22-iEIBY được vận hành dưới sự kiểm soát của T7 promoter, do đó tế bào chủ bắt buộc phải mang gene mã hóa T7 RNA Polymerase trong hệ gen. Khuyến nghị sử dụng chủng E. coli DH5α cho mục đích nhân dòng/lưu trữ plasmid và chủng ** E. coli BL21 (DE3)** cho mục đích cảm ứng biểu hiện protein.

2. Sự khác biệt chính giữa việc sử dụng pRSET-A (High-copy) và pET22b(+) (Low-copy) là gì?

• pRSET-A (pUC origin, 200-500 copies) tạo ra lượng bản sao chép mã (mRNA) khổng lồ nhưng dễ gây quá tải bộ máy dịch mã của tế bào chủ, dẫn đến biến tính protein và hình thành thể vùi.
• pET22b(+) (pBR322 origin, 15-20 copies) tạo ra mức độ phiên mã điều hòa hơn, giúp tế bào sinh trưởng đạt mật độ quang ($OD_{600}$) cao hơn và giữ cho các enzyme gấp cuộn (folding) chính xác ở trạng thái hòa tan có hoạt tính.

3. Tại sao cần loại bỏ trình tự tín hiệu tiết pelB trên vector pET22b(+)?

Chuỗi pelB có chức năng định hướng vận chuyển protein ra khoang chu chất (periplasm). Tuy nhiên, các enzyme sinh tổng hợp carotenoid (như CrtB, CrtI, CrtY) là các protein liên kết màng hoặc hoạt động tối ưu trong tế bào chất gắn màng sinh chất. Việc loại bỏ pelB giúp enzyme định vị chính xác tại màng trong tế bào chất, tối đa hóa hiệu suất chuyển hóa cơ chất kỵ nước.

4. Quy trình bảo quản các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp như thế nào?

Các dòng tế bào biến nạp dương tính sau khi khẳng định bằng giải trình tự hoặc bản đồ cắt giới hạn cần được nuôi cấy tăng sinh đến pha log muộn ($OD_{600} \approx 0.8$), bổ sung dung dịch glycerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng 20% - 25%, chia nhỏ vào các ống cryovial và bảo quản sâu tại -80°C.

5. Khả năng tích hợp cụm gene này sang các sinh vật chủ khác (nấm men, vi tảo) ra sao?

Cụm 5 gene có thể được khuếch đại bằng PCR sử dụng các cặp mồi bổ sung vị trí cắt phù hợp để chuyển vị sang các vector biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn (như pPICZ cho nấm men Pichia pastoris hoặc pYES2 cho Saccharomyces cerevisiae), mở ra tiềm năng sản xuất trên các hệ thống vi sinh vật GRAS (Generally Recognized As Safe).

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc việc thiết kế, xây dựng và thẩm định cấu trúc hai hệ vector biểu hiện mang polycistron 5 gene (idi - crtE - crtI - crtB - crtY) trên hai nền tảng plasmid pRSET-A và pET22b(+). Toàn bộ quy trình từ mô phỏng in silico trên Vector NTI 11.5, thao tác cắt nối bằng enzyme giới hạn, tinh sạch DNA đến sàng lọc khuẩn lạc và kiểm tra bản đồ giới hạn đều đạt độ chính xác phân tử tuyệt đối.

Sự thành công của nghiên cứu không chỉ cung cấp nguồn vật liệu di truyền quý giá phục vụ công tác đào tạo và nghiên cứu chuyên sâu về công nghệ gene tại Việt Nam, mà còn đặt nền móng vững chắc cho các dự án chuyển giao công nghệ sản xuất $\beta$-carotene sinh học quy mô công nghiệp, thay thế hàng nhập khẩu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (Schmidt- Dannert, 2000) [57]. Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng (Vershinin, 1999) [70] và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003) [63]. Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong số đó là cần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007) [52]. β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, thuộc nhóm carotenoid.

Chúng được tìm thấy ở một số loại cây như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry, Netto et al. β-carotene được biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A – một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al. 2003; Stutz, Bresgen et al. Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh về mắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong khẩu phần ăn (Harjes, Rocheford et al.

Ở động vật, β-carotene được sử dụng trong suốt quá trình sinh trưởng, chúng tham gia vào một loạt các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triển biểu bì của mô, cấu trúc xương và tăng cường khả năng miễn dịch (Sklan, 1987) [60]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quá trình phát triển của tế bào ung thư, và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al. Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018.

Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11]. Để đáp ứng nhu cầu đó β- carotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là con đường tổng hợp hóa 2 học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al. 2011, Vachali, Bhosale et al. Sản phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1 đồng phân duy nhất, trong khi đó β-carotene tự nhiên không những có chứa β-carotene mà còn có α-carotene và γ- carotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạt tính sinh học cao hơn 10% so với tổng hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al.

and El-Baroty. Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu. Vấn đề đặt ra là cần phải có phương pháp khác để tạo nguồn cung β-carotene tự nhiên. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụng các kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên.

Các nghiên cứu về tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp β- carotene đang gặt hái được những thành công nhất định. Năm 1990, Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thành công đầu tiên trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al. 1991) [45] và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al. Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32].

Vector là một trong những tiêu chí đầu tiên được quan tâm tới, theo lý thuyết một hệ vector có số bản sao cao sẽ làm tăng tần số mRNA và tăng năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp (Camps 2010) [15]. Tuy nhiên, số lượng bản sao cao liệu có phải là tốt nhất? Theo nghiên cứu của Jones KL và cộng sự, một vài hệ vector có số bản sao thấp cũng có khả năng biểu hiện tương đương hoặc có phần tốt hơn so với một hệ vector có số bản sao cao (Jones, Kim et al. Bên cạnh đó, vị trí tiết cũng là một yếu tố quan trọng. Nếu protein lưu lại trong tế bào chất nó có thể trở nên không tan khi ở mức độ tổng hợp cao, dẫn đến sự hình thành các thể vùi.

Việc thu hồi protein có hoạt tính sinh học từ những thể vùi này là rất khó 3 (Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay et al. Nhằm giải quyết vấn đề này, ngày nay protein tái tổ hợp sẽ được gắn thêm một chuỗi tín hiệu tiết bằng cách đưa một trình tự mã hóa cho chuỗi tín hiệu đó lên vector biểu hiện. Chuỗi tín hiệu này được nhận biết bởi hệ thống tiết và được vận chuyển tới đúng nơi. Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất carotenoid ở Việt Nam vẫn còn một vấn đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phân lập các chủng vi sinh vật sản xuất β-carotene ở quy mô nhỏ.

Việc sử dụng các hợp chất β-carotene ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất β-carotene tái tổ hợp.2 Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli. Kiểm tra ảnh hưởng của số bản copy tới năng suất biểu hiện β-carotene trong vi khuẩn E.3 Mục tiêu nghiên cứu - Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtE- crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pRSET-A. - Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtE- crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pET22b(+).4 Ý nghĩa của đề tài 1.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện β-carotene trong E.

coli sau này.2 Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất β- carotene mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiễn. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene 2.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loài thực vật, chúng có màu vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65-70 sắc tố tự nhiên và là một trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm. Carotenoid thường được chia làm hai nhóm: Thứ nhất là nhóm caroten hydrocacbon như là β-carotene, torulen và nhóm còn lại là xantophyl bị oxy hóa như astaxantin. Hiện nay, nhóm caroteonid đang được nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu trong đó phải kể đến β-carotene.

Cấu trúc: β-carotene là một trong số hơn 600 loại caroteoid đã được tìn thấy trong tự nhiên. Chúng là một dẫn xuất isoprene chưa bão hòa bao gồm 40 nguyên tử cacbon và 56 nguyên tử hydro (C40H56) β-carotene có dạng tinh thể hình kim, trong cấu trúc có các nối đôi đơn xen kẽ tạo nên một chuỗi polyen (hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene Tính chất lý hóa: β-carotene là hợp chất có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, etyl-ete, metanol, nhưng lại không tan trong nước. Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ.2 Vai trò của sắc tố β-carotene với con người 2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người Hiện nay, β-carotene được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu bởi tác dụng hữu ích của nó đối với sức khỏe con người (Nagao 2009) [48]. β-carotene được biết đến như tiền chất vitamin A rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al.

2003) [35], bên cạnh đó chúng cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh và ngăn ngừa một số bệnh ung thư. Vai trò là chất chống oxy hóa Gốc tự do là những phân tử bị thiếu hụt điện tích. Các gốc tự do này thường không cân bằng và rất dễ phản ứng. Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử từ các phân tử khác, các phân tử bị mất điện tích sẽ lại trở thành những gốc tự do mới.

Quá trình này được gọi là quá trính oxy hóa và gốc tự do đó được gọi là chất oxy hóa. Chất oxy hóa tiêu biểu đến nay được phát hiện là ROS. ROS là một sản phẩm phụ của quá trình hô hấp và trao đổi chất trong cơ thể, đồng thời ROS cũng được kích thích sinh ra do các tác động của môi trường như tia UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao. ROS tích lũy có thể gây tổn thương tế bào và các phân tử sinh học như DNA, protein (Adetayo O.

Omoni and Aluko 2005) [4]. Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ROS tích lũy trong tế bào và cơ chế quá mức là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa như Alzheimer, ung thư, Parkinson, các bệnh mãn tính, bệnh tim mạch. Các chất chống oxy hóa là các chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa. Chúng ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do (Guerin, Huntley et al.

Carotenoid đã được chứng minh là chất chống oxy hóa sinh học, bảo vệ tế bào và mô từ các tác hại của các gốc tự do (Maiani, Caston et al. Trong carotenoid, β-carotene có hiệu quả trong việc bảo vệ màng lipid của tế bào khỏi tác hại của các gốc tự do (Britton 1995) [14], bên cạnh đó cùng với một số nhóm carotenoid khác như lycopene có khả năng loại bỏ oxy tốt nhất, lutein và zeaxanthin có hiệu quả trong việc loại bỏ các gốc tự do là tăng tính toàn vẹn của tế bào (Smith 1998) [61]. 6 Tiền chất vitamin A β-carotene còn được biết đến với tên gọi là tiền chất vitamin A (Lampert, Holzschuh et al. Khi vào cơ thể, β-carotene bị phân cắt ở giữa mạch cacbon trung tâm tạo thành hai phân tử retinal bằng enzyme 15,15’dioxygenase (Biesalski, Chichili et al.

Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzyme thành retinol.