Đặt vấn đề Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (Schmidt- Dannert, 2000) [57]. Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng (Vershinin, 1999) [70] và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003) [63]. Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong số đó là cần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007) [52]. β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, thuộc nhóm carotenoid.
Chúng được tìm thấy ở một số loại cây như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry, Netto et al. β-carotene được biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A – một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al. 2003; Stutz, Bresgen et al. Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh về mắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong khẩu phần ăn (Harjes, Rocheford et al.
Ở động vật, β-carotene được sử dụng trong suốt quá trình sinh trưởng, chúng tham gia vào một loạt các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triển biểu bì của mô, cấu trúc xương và tăng cường khả năng miễn dịch (Sklan, 1987) [60]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quá trình phát triển của tế bào ung thư, và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al. Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018.
Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11]. Để đáp ứng nhu cầu đó β- carotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là con đường tổng hợp hóa 2 học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al. 2011, Vachali, Bhosale et al. Sản phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1 đồng phân duy nhất, trong khi đó β-carotene tự nhiên không những có chứa β-carotene mà còn có α-carotene và γ- carotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạt tính sinh học cao hơn 10% so với tổng hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al.
and El-Baroty. Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu. Vấn đề đặt ra là cần phải có phương pháp khác để tạo nguồn cung β-carotene tự nhiên. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụng các kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên.
Các nghiên cứu về tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp β- carotene đang gặt hái được những thành công nhất định. Năm 1990, Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thành công đầu tiên trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al. 1991) [45] và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al. Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32].
Vector là một trong những tiêu chí đầu tiên được quan tâm tới, theo lý thuyết một hệ vector có số bản sao cao sẽ làm tăng tần số mRNA và tăng năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp (Camps 2010) [15]. Tuy nhiên, số lượng bản sao cao liệu có phải là tốt nhất? Theo nghiên cứu của Jones KL và cộng sự, một vài hệ vector có số bản sao thấp cũng có khả năng biểu hiện tương đương hoặc có phần tốt hơn so với một hệ vector có số bản sao cao (Jones, Kim et al. Bên cạnh đó, vị trí tiết cũng là một yếu tố quan trọng. Nếu protein lưu lại trong tế bào chất nó có thể trở nên không tan khi ở mức độ tổng hợp cao, dẫn đến sự hình thành các thể vùi.
Việc thu hồi protein có hoạt tính sinh học từ những thể vùi này là rất khó 3 (Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay et al. Nhằm giải quyết vấn đề này, ngày nay protein tái tổ hợp sẽ được gắn thêm một chuỗi tín hiệu tiết bằng cách đưa một trình tự mã hóa cho chuỗi tín hiệu đó lên vector biểu hiện. Chuỗi tín hiệu này được nhận biết bởi hệ thống tiết và được vận chuyển tới đúng nơi. Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất carotenoid ở Việt Nam vẫn còn một vấn đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phân lập các chủng vi sinh vật sản xuất β-carotene ở quy mô nhỏ.
Việc sử dụng các hợp chất β-carotene ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất β-carotene tái tổ hợp.2 Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli. Kiểm tra ảnh hưởng của số bản copy tới năng suất biểu hiện β-carotene trong vi khuẩn E.3 Mục tiêu nghiên cứu - Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtE- crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pRSET-A. - Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtE- crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pET22b(+).4 Ý nghĩa của đề tài 1.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện β-carotene trong E.
coli sau này.2 Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất β- carotene mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiễn. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene 2.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loài thực vật, chúng có màu vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65-70 sắc tố tự nhiên và là một trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm. Carotenoid thường được chia làm hai nhóm: Thứ nhất là nhóm caroten hydrocacbon như là β-carotene, torulen và nhóm còn lại là xantophyl bị oxy hóa như astaxantin. Hiện nay, nhóm caroteonid đang được nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu trong đó phải kể đến β-carotene.
Cấu trúc: β-carotene là một trong số hơn 600 loại caroteoid đã được tìn thấy trong tự nhiên. Chúng là một dẫn xuất isoprene chưa bão hòa bao gồm 40 nguyên tử cacbon và 56 nguyên tử hydro (C40H56) β-carotene có dạng tinh thể hình kim, trong cấu trúc có các nối đôi đơn xen kẽ tạo nên một chuỗi polyen (hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene Tính chất lý hóa: β-carotene là hợp chất có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, etyl-ete, metanol, nhưng lại không tan trong nước. Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ.2 Vai trò của sắc tố β-carotene với con người 2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người Hiện nay, β-carotene được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu bởi tác dụng hữu ích của nó đối với sức khỏe con người (Nagao 2009) [48]. β-carotene được biết đến như tiền chất vitamin A rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al.
2003) [35], bên cạnh đó chúng cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh và ngăn ngừa một số bệnh ung thư. Vai trò là chất chống oxy hóa Gốc tự do là những phân tử bị thiếu hụt điện tích. Các gốc tự do này thường không cân bằng và rất dễ phản ứng. Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử từ các phân tử khác, các phân tử bị mất điện tích sẽ lại trở thành những gốc tự do mới.
Quá trình này được gọi là quá trính oxy hóa và gốc tự do đó được gọi là chất oxy hóa. Chất oxy hóa tiêu biểu đến nay được phát hiện là ROS. ROS là một sản phẩm phụ của quá trình hô hấp và trao đổi chất trong cơ thể, đồng thời ROS cũng được kích thích sinh ra do các tác động của môi trường như tia UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao. ROS tích lũy có thể gây tổn thương tế bào và các phân tử sinh học như DNA, protein (Adetayo O.
Omoni and Aluko 2005) [4]. Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ROS tích lũy trong tế bào và cơ chế quá mức là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa như Alzheimer, ung thư, Parkinson, các bệnh mãn tính, bệnh tim mạch. Các chất chống oxy hóa là các chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa. Chúng ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do (Guerin, Huntley et al.
Carotenoid đã được chứng minh là chất chống oxy hóa sinh học, bảo vệ tế bào và mô từ các tác hại của các gốc tự do (Maiani, Caston et al. Trong carotenoid, β-carotene có hiệu quả trong việc bảo vệ màng lipid của tế bào khỏi tác hại của các gốc tự do (Britton 1995) [14], bên cạnh đó cùng với một số nhóm carotenoid khác như lycopene có khả năng loại bỏ oxy tốt nhất, lutein và zeaxanthin có hiệu quả trong việc loại bỏ các gốc tự do là tăng tính toàn vẹn của tế bào (Smith 1998) [61]. 6 Tiền chất vitamin A β-carotene còn được biết đến với tên gọi là tiền chất vitamin A (Lampert, Holzschuh et al. Khi vào cơ thể, β-carotene bị phân cắt ở giữa mạch cacbon trung tâm tạo thành hai phân tử retinal bằng enzyme 15,15’dioxygenase (Biesalski, Chichili et al.
Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzyme thành retinol.