Thiết Kế Vector Biểu Hiện Các Gene Mã Hóa Enzyme Xúc Tác Con Đường Tổng Hợp β-Carotene Trong Vi Khuẩn Escherichia coli

• Tác giả: Vũ Hoài Nam
• Người hướng dẫn: Th.S. Ma Thị Trang
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene Mã Hóa Enzyme Tổng Hợp β-Carotene Trong Escherichia coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Khái quát về sắc tố β-carotene
• 2.1.1. Cấu trúc và tính chất lý hóa
• 2.1.2. Vai trò của sắc tố β-carotene với con người
• 2.1.2.1. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người
• 2.1.2.2. Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp
• 2.2. Con đường tổng hợp β-carotene
• 2.3. Nguồn cung cấp β-carotene
• 2.3.1. Nguồn cung từ thực vật
• 2.3.2. Nguồn cung từ vi sinh vật
• 2.3.3. Nguồn cung từ tổng hợp hóa học
• 2.4. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên
• 2.4.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp
• 2.4.2. Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli
• 2.4.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.4.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.4.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp thiết kế in silico
• 3.5.2. Phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 3.5.3. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose
• 3.5.4. Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose
• 3.5.5. Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện
• 3.5.6. Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến
• 3.5.7. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt
• 3.5.8. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY
• 4.1.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY
• 4.1.2. Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY
• 4.2. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
• 4.2.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y
• 4.2.2. Kết quả gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY
• 4.3. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene

Carotenoid là sắc tố tự nhiên quan trọng, đặc biệt là β-carotene, được tìm thấy trong thực vật và vi sinh vật. β-carotene có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng và sức khỏe con người, là tiền chất của vitamin A và có khả năng chống oxy hóa mạnh. Nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng, thúc đẩy các nghiên cứu về sản xuất β-carotene tự nhiên bằng công nghệ sinh học. Việc thiết kế vector biểu hiện hiệu quả là yếu tố then chốt để tăng năng suất tổng hợp β-carotene trong các hệ thống vi sinh vật. Nghiên cứu này tập trung vào thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli, một đối tượng nghiên cứu phổ biến trong kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử.

1.1. Giới Thiệu Về Sắc Tố β Carotene và Ứng Dụng

β-carotene là một carotenoid quan trọng, có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và dung môi hữu cơ. Nó đóng vai trò là tiền chất của vitamin A, cần thiết cho thị lực và chức năng miễn dịch. Ngoài ra, β-carotene còn có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Ứng dụng của β-carotene rất đa dạng, từ thực phẩm chức năng, dược phẩm đến mỹ phẩm. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018. Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11].

1.2. Vai Trò Của Escherichia coli Trong Biểu Hiện Gene

Escherichia coli (E. coli) là một vi khuẩn gram âm, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền nhờ khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng biến đổi gen và có hệ thống di truyền được nghiên cứu kỹ lưỡng. E. coli là một nền tảng lý tưởng để biểu hiện gene và sản xuất protein tái tổ hợp. Việc thiết kế vector biểu hiện E. coli phù hợp là yếu tố quan trọng để đạt được năng suất cao trong tổng hợp β-carotene. Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32].

II. Thách Thức Trong Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene

Việc thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene không phải là một nhiệm vụ đơn giản. Các enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp β-carotene thường được mã hóa bởi nhiều gene khác nhau, đòi hỏi phải thiết kế vector có khả năng chứa và biểu hiện đồng thời nhiều gene (polycistron). Ngoài ra, việc tối ưu hóa biểu hiện gene để đạt được năng suất cao cũng là một thách thức lớn. Các yếu tố như promoter, trình tự ribosome binding site (RBS) và codon usage cần được xem xét kỹ lưỡng để đảm bảo biểu hiện gene hiệu quả trong E. coli.

2.1. Vấn Đề Về Biểu Hiện Đồng Thời Nhiều Gene Polycistron

Con đường sinh tổng hợp β-carotene liên quan đến nhiều enzyme khác nhau, mỗi enzyme được mã hóa bởi một gene riêng biệt. Để tổng hợp β-carotene hiệu quả, cần phải biểu hiện đồng thời tất cả các gene này. Việc thiết kế vector biểu hiện có khả năng chứa và biểu hiện đồng thời nhiều gene (polycistron) là một thách thức kỹ thuật. Cần phải đảm bảo rằng tất cả các gene đều được phiên mã và dịch mã hiệu quả, và các enzyme được tạo ra có hoạt tính sinh học cao.

2.2. Tối Ưu Hóa Biểu Hiện Gene Để Tăng Năng Suất β Carotene

Năng suất tổng hợp β-carotene phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của các gene mã hóa enzyme. Để đạt được năng suất cao, cần phải tối ưu hóa biểu hiện gene bằng cách lựa chọn promoter mạnh, trình tự RBS phù hợp và codon usage tối ưu cho E. coli. Ngoài ra, cần phải kiểm soát các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và nồng độ chất dinh dưỡng để đảm bảo biểu hiện gene ổn định và hiệu quả.

III. Phương Pháp Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gene β Carotene Hiệu Quả

Để giải quyết các thách thức trên, nghiên cứu này sử dụng phương pháp thiết kế vector biểu hiện dựa trên công nghệ DNA tái tổ hợp. Các gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene được khuếch đại bằng PCR, sau đó được gắn vào vector biểu hiện phù hợp. Vector biểu hiện được thiết kế để chứa promoter mạnh, trình tự RBS tối ưu và các marker chọn lọc. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được chọn lọc và kiểm tra khả năng biểu hiện gene.

3.1. Sử Dụng Công Nghệ DNA Tái Tổ Hợp Để Tạo Vector

Công nghệ DNA tái tổ hợp là một công cụ mạnh mẽ để thiết kế vector biểu hiện gene. Các gene mong muốn được khuếch đại bằng PCR, sau đó được cắt và gắn vào vector bằng enzyme giới hạn và enzyme ligase. Vector tái tổ hợp được thiết kế để chứa các yếu tố cần thiết cho biểu hiện gene, như promoter, RBS và terminator.

3.2. Lựa Chọn Vector Biểu Hiện Phù Hợp Cho Escherichia coli

Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp là rất quan trọng để đạt được năng suất cao trong tổng hợp β-carotene. Các vector biểu hiện E. coli có sẵn trên thị trường có nhiều đặc điểm khác nhau, như số lượng bản sao, promoter và marker chọn lọc. Cần phải lựa chọn vector phù hợp với mục tiêu nghiên cứu và đặc điểm của các gene cần biểu hiện.

3.3. Tối Ưu Hóa Trình Tự Promoter và Ribosome Binding Site RBS

Promoter và RBS là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện gene. Promoter quyết định tần suất phiên mã, trong khi RBS quyết định hiệu quả dịch mã. Cần phải tối ưu hóa trình tự promoter và RBS để đạt được mức độ biểu hiện gene cao nhất. Các công cụ sinh học phân tử có sẵn có thể giúp dự đoán và tối ưu hóa trình tự promoter và RBS.

IV. Ứng Dụng Vector Biểu Hiện Gene β Carotene Trong E

Các vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene được tạo ra trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để sản xuất β-carotene tái tổ hợp trong E. coli. β-carotene tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, như thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. Ngoài ra, các vector này cũng có thể được sử dụng để nghiên cứu con đường sinh tổng hợp β-carotene và tối ưu hóa quá trình sản xuất β-carotene.

4.1. Sản Xuất β Carotene Tái Tổ Hợp Trong Escherichia coli

Các vector biểu hiện được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu để biểu hiện gene. β-carotene được tích lũy trong tế bào vi khuẩn, sau đó được chiết xuất và tinh sạch. Năng suất tổng hợp β-carotene được đánh giá bằng các phương pháp phân tích hóa học.

4.2. Ứng Dụng β Carotene Tái Tổ Hợp Trong Công Nghiệp

β-carotene tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, như thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. β-carotene được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên, chất chống oxy hóa và tiền chất của vitamin A. Việc sản xuất β-carotene tái tổ hợp có thể giúp giảm chi phí và tăng tính bền vững của nguồn cung β-carotene.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Thiết Kế Thành Công Vector Biểu Hiện

Nghiên cứu đã thiết kế thành công hai vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY và trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene cho thấy tiềm năng ứng dụng của các vector này trong sản xuất β-carotene.

5.1. Tạo Vector Tái Tổ Hợp pR iEIBY và pET22 iEIBY

Quá trình thiết kế bao gồm nhiều bước, từ lựa chọn vector nền, khuếch đại gene bằng PCR, cắt và gắn gene vào vector, đến kiểm tra sự có mặt và chiều gắn của gene. Các vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY đã được xác nhận bằng điện di và phân tích trình tự.

5.2. Kiểm Tra Hoạt Động Của Gene Trong Vector Biểu Hiện

Các vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, và các dòng vi khuẩn mang vector được nuôi cấy để kiểm tra khả năng biểu hiện gene. Kết quả cho thấy các gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY được biểu hiện trong E. coli, cho thấy tiềm năng sản xuất β-carotene.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Thiết Kế Vector Biểu Hiện

Nghiên cứu này đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện gene mã hóa enzyme tổng hợp β-carotene trong E. coli. Các vector được tạo ra có thể được sử dụng để sản xuất β-carotene tái tổ hợp và nghiên cứu con đường sinh tổng hợp β-carotene. Hướng phát triển tiếp theo là tối ưu hóa quá trình biểu hiện gene và tăng năng suất tổng hợp β-carotene.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Đóng Góp

Nghiên cứu đã cung cấp các vector biểu hiện hữu ích cho việc sản xuất β-carotene tái tổ hợp. Các vector này có thể được sử dụng bởi các nhà nghiên cứu khác để tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp sản xuất β-carotene hiệu quả hơn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai và Ứng Dụng Tiềm Năng

Hướng nghiên cứu tương lai bao gồm tối ưu hóa quá trình biểu hiện gene, tăng năng suất tổng hợp β-carotene và phát triển các phương pháp chiết xuất và tinh sạch β-carotene hiệu quả hơn. Các ứng dụng tiềm năng của β-carotene tái tổ hợp rất đa dạng, từ thực phẩm chức năng đến dược phẩm và mỹ phẩm.