Luận văn thạc sĩ về sàng lọc thực khuẩn thể điều trị bệnh trên cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long

• Tác giả: Mai Hoàng Yến
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Anh Hoàng
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Sàng Lọc Và Tuyến Chọn Thực Khuẩn Thể Nhằm Trị Bệnh Trên Cá Tra Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam
• 1.2. Cá tra (Pangasianodon hypopthalmus)
• 1.3. Dịch bệnh trên cá tra
• 1.4. Bệnh gan thận mủ
• 1.5. Các phương pháp phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra
• 1.5.1. Sử dụng thuốc kháng sinh
• 1.5.2. Sử dụng VACCINE
• 1.6. Thực khuẩn thể (bacteriophage)
• 1.6.1. Lịch sử phát hiện thực khuẩn thể
• 1.6.2. Phân loại thực khuẩn thể
• 1.6.3. Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn
• 1.6.4. Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất và môi trường
• 2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Thu và xử lý mẫu
• 2.3.2. Tăng sinh và phân lập thực khuẩn thể
• 2.3.3. Khảo sát chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size)
• 2.3.4. Khảo sát thời gian ức chế vi khuẩn trong môi trường chuẩn
• 2.3.5. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong môi trường nước ao
• 2.3.6. Khảo sát phổ xâm nhiễm của thực khuẩn thể
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIÊN LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập thực khuẩn thể
• 3.2. Kết quả tạo stock thực khuẩn thể
• 3.3. Chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size)
• 3.4. Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng thực khuẩn thể riêng lẻ
• 3.5. Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể
• 3.6. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong môi trường nước ao
• 3.7. Khảo sát phổ xâm nhiễm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

I. Tổng quan về bệnh gan thận mủ trên cá tra

Bệnh gan thận mủ là một trong những bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất trong ngành nuôi cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long. Nguyên nhân chính gây ra bệnh này là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, có thể gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá. Bệnh này có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn nuôi và có tỷ lệ hao hụt lên đến 90%. Việc điều trị bệnh chủ yếu dựa vào kháng sinh, tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả hơn là rất cần thiết. Liệu pháp thực khuẩn thể (bacteriophage therapy) đã được nghiên cứu như một giải pháp tiềm năng để thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra.

1.1. Tình hình dịch bệnh và tác động

Tình hình dịch bệnh trên cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long đang ngày càng gia tăng, gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi. Theo thống kê, bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra đã trở thành một trong những nguyên nhân chính dẫn đến thiệt hại kinh tế lớn. Việc sử dụng kháng sinh không còn mang lại hiệu quả cao, bên cạnh đó còn gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng cho môi trường và sức khỏe con người. Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong điều trị bệnh gan thận mủ là một hướng đi mới, có thể giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị.

II. Phương pháp nghiên cứu và phân lập thực khuẩn thể

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các thực khuẩn thể có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri từ mẫu gan-thận cá tra. 29 mẫu gan-thận được thu thập từ các trang trại cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long đã được sử dụng để phân lập thực khuẩn thể. Kết quả phân lập cho thấy có ba chủng thực khuẩn thể pGA1, pGA2 và pGA3. Các chủng này đã được khảo sát hoạt tính xâm nhiễm với hai thông số quan trọng là chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân. Chu kỳ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể này nằm trong khoảng 55-65 phút, trong khi hệ số nhân dao động từ 18-77. Những kết quả này cho thấy tiềm năng của các thực khuẩn thể trong việc điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra.

2.1. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn

Khả năng ức chế vi khuẩn của các thực khuẩn thể được khảo sát trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn và trong nước ao nuôi cá tra. Kết quả cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn của các thực khuẩn thể được thể hiện rõ ràng trong khoảng thời gian 13-14 giờ trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và 51 giờ trong nước ao nuôi. Điều này chứng tỏ rằng liệu pháp thực khuẩn thể có thể là một giải pháp hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh gan thận mủ, đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản.

III. Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp những thông tin quan trọng về khả năng ứng dụng của thực khuẩn thể trong điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả hơn. Việc ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể có thể giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc, đồng thời bảo vệ sức khỏe môi trường và con người. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong bối cảnh ngành nuôi trồng thủy sản đang phải đối mặt với nhiều thách thức từ dịch bệnh và kháng thuốc.

3.1. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo

Để tiếp tục phát triển và hoàn thiện liệu pháp thực khuẩn thể, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các thực khuẩn thể, cũng như khả năng tương tác của chúng với các vi khuẩn gây bệnh khác. Ngoài ra, việc thử nghiệm trên quy mô lớn hơn và trong điều kiện thực tế sẽ giúp đánh giá chính xác hơn hiệu quả của liệu pháp này trong việc điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra.

Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi cá tra tại Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) đóng góp quan trọng vào kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam, với diện tích nuôi đạt khoảng 3.000 ha và sản lượng thu hoạch ước đạt 346.000 tấn trong 5 tháng đầu năm 2015. Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá tra, đặc biệt là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, đang ngày càng gia tăng và gây thiệt hại nghiêm trọng với tỷ lệ hao hụt có thể lên đến 70-90%. Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh này không còn hiệu quả do tình trạng kháng thuốc ngày càng phổ biến, đồng thời gây ra nhiều tác hại môi trường và sức khỏe cộng đồng.

Trong bối cảnh đó, liệu pháp thực khuẩn thể (bacteriophage therapy) được xem là giải pháp thay thế tiềm năng, an toàn và đặc hiệu trong phòng và trị bệnh trên cá tra. Luận văn tập trung vào việc sàng lọc và tuyển chọn các thực khuẩn thể có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri từ mẫu gan-thận cá tra tại ĐBSCL, khảo sát hoạt tính xâm nhiễm và khả năng ức chế vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng chuẩn cũng như môi trường nước ao nuôi cá tra. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ tháng 2/2017 đến tháng 1/2018, nhằm cung cấp dữ liệu khoa học làm cơ sở cho việc ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong thực tế, góp phần nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh gan thận mủ, giảm thiểu sử dụng kháng sinh và tăng năng suất nuôi cá tra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Lý thuyết về thực khuẩn thể (bacteriophage): Thực khuẩn thể là virus xâm nhiễm vi khuẩn, có khả năng nhân lên trong tế bào vi khuẩn chủ và phá hủy tế bào này thông qua chu kỳ xâm nhiễm gồm các giai đoạn hấp phụ, xâm nhập, tổng hợp, trưởng thành và phóng thích. Các thông số quan trọng đánh giá hoạt tính thực khuẩn thể là chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size).

• Mô hình liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh thủy sản: Liệu pháp này tận dụng tính đặc hiệu cao của thực khuẩn thể đối với từng chủng vi khuẩn, hạn chế sự đề kháng kháng sinh, có khả năng tự nhân lên và giảm dân số vi khuẩn gây bệnh hiệu quả trong môi trường nuôi.

• Khái niệm về hoạt tính xâm nhiễm: Bao gồm chu kỳ xâm nhiễm (thời gian từ khi thực khuẩn thể xâm nhập đến khi tế bào vi khuẩn bị phá hủy) và hệ số nhân (số lượng thực khuẩn thể được giải phóng sau một chu kỳ).

• Khái niệm về khả năng ức chế vi khuẩn: Đánh giá qua sự giảm mật độ vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy hoặc nước ao khi bổ sung thực khuẩn thể, được đo bằng giá trị hấp thụ quang học OD600nm và đếm số lượng thực khuẩn thể (PFU/mL).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 29 mẫu gan-thận cá tra được thu thập từ các ao nuôi cá tra tại Đồng bằng Sông Cửu Long. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được sử dụng làm chủng đích trong các thí nghiệm.

• Phương pháp phân lập thực khuẩn thể: Sử dụng kỹ thuật Plaque Assay để phát hiện và tinh sạch thực khuẩn thể từ mẫu gan-thận. Các thực khuẩn thể được phân lập gồm pGA1, pGA2 và pGA3.

• Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm: Xác định chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân của từng thực khuẩn thể bằng cách đo số lượng thực khuẩn thể giải phóng theo thời gian sau khi xâm nhiễm vi khuẩn chủ.

• Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn: Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường dinh dưỡng chuẩn (TSB) và môi trường nước ao nuôi cá tra đã tiệt trùng, với MOI = 2. Đo biến thiên OD600nm và số lượng thực khuẩn thể theo thời gian để đánh giá hiệu quả ức chế.

• Khảo sát phổ xâm nhiễm: Thực hiện phương pháp drop plaque assay để đánh giá khả năng xâm nhiễm của các thực khuẩn thể trên các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khác nhau và một số vi khuẩn gây bệnh thủy sản khác.

• Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 20 và Excel 2010 để phân tích dữ liệu, đảm bảo tính chính xác và khoa học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thực khuẩn thể: Từ 29 mẫu gan-thận cá tra, đã phân lập thành công 3 thực khuẩn thể pGA1, pGA2 và pGA3 có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Vòng sinh tan trên đĩa thạch có đặc điểm trong suốt với vòng ngoài mờ, chứng tỏ hoạt tính ly giải tế bào vi khuẩn rõ rệt.

2. Chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân:

   • pGA1 có chu kỳ xâm nhiễm khoảng 70 phút, hệ số nhân (burst size) là 18,23.
   • pGA2 có chu kỳ xâm nhiễm 65 phút, burst size cao nhất đạt 77,63.
   • pGA3 có chu kỳ xâm nhiễm khoảng 65-70 phút, burst size đạt 55.
     Sự khác biệt này cho thấy pGA2 có hoạt tính xâm nhiễm mạnh nhất, phù hợp cho ứng dụng điều trị.

3. Khả năng ức chế vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng chuẩn:
   Các thực khuẩn thể duy trì khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong khoảng 13-14 giờ, thể hiện qua sự giảm mạnh giá trị OD600nm và nồng độ vi khuẩn. Sau thời gian này, vi khuẩn bắt đầu kháng lại thực khuẩn thể, làm môi trường nuôi cấy đục trở lại.

4. Khả năng ức chế trong môi trường nước ao nuôi cá tra:
   Thực khuẩn thể duy trì khả năng ức chế vi khuẩn trong suốt 51 giờ khảo sát, cho thấy hiệu quả kéo dài hơn trong điều kiện thực tế nuôi cá. Đây là kết quả quan trọng, minh chứng cho tiềm năng ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong môi trường tự nhiên.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập thực khuẩn thể từ mẫu gan-thận cá tra cho thấy nguồn thực khuẩn thể đặc hiệu có thể thu nhận trực tiếp từ mô cá bệnh, do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khu trú chủ yếu trong gan và thận. Việc không phân lập được thực khuẩn thể từ mẫu nước ao nuôi cá tra phản ánh đặc điểm sinh thái của vi khuẩn và thực khuẩn thể trong môi trường tự nhiên.

Chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân của các thực khuẩn thể phân lập tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thực khuẩn thể trên vi khuẩn gây bệnh thủy sản, đồng thời cho thấy pGA2 có hoạt tính mạnh nhất, phù hợp cho việc phát triển liệu pháp điều trị.

Khả năng duy trì ức chế vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và nước ao nuôi cá tra cho thấy thực khuẩn thể có thể hoạt động hiệu quả trong điều kiện nuôi cá thực tế. Sự xuất hiện vi khuẩn kháng thực khuẩn thể sau thời gian dài ức chế là hiện tượng phổ biến, có thể được khắc phục bằng cách sử dụng cocktail thực khuẩn thể hoặc kết hợp các phương pháp điều trị khác.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ biến thiên OD600nm và nồng độ thực khuẩn thể theo thời gian, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả ức chế và hoạt tính xâm nhiễm của từng thực khuẩn thể.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển liệu pháp thực khuẩn thể ứng dụng trong nuôi cá tra:
   Tiến hành thử nghiệm in vivo sử dụng thực khuẩn thể pGA2 và cocktail pGA1, pGA2, pGA3 nhằm đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra trong điều kiện ao nuôi thực tế trong vòng 12 tháng.

2. Xây dựng quy trình sản xuất và bảo quản thực khuẩn thể:
   Thiết lập quy trình sản xuất thực khuẩn thể với nồng độ cao (10^9 PFU/mL), bảo quản ổn định ở 4°C và kiểm soát chất lượng định kỳ để đảm bảo hiệu quả sử dụng lâu dài.

3. Khảo sát phổ xâm nhiễm và cơ chế kháng phage của vi khuẩn:
   Nghiên cứu chi tiết cấu trúc thụ thể bề mặt vi khuẩn và cơ chế kháng thực khuẩn thể để thiết kế cocktail phage đa dạng, hạn chế sự xuất hiện vi khuẩn kháng phage trong quá trình điều trị.

4. Tuyên truyền và đào tạo người nuôi cá:
   Tổ chức các khóa tập huấn về sử dụng liệu pháp thực khuẩn thể, hướng dẫn kỹ thuật áp dụng và quản lý dịch bệnh nhằm nâng cao nhận thức và hiệu quả phòng trị bệnh trong cộng đồng nuôi cá tra.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Thủy sản:
   Cung cấp kiến thức chuyên sâu về thực khuẩn thể, phương pháp phân lập và ứng dụng trong phòng trị bệnh thủy sản.

2. Chuyên gia và cán bộ kỹ thuật trong ngành nuôi trồng thủy sản:
   Hỗ trợ phát triển các giải pháp điều trị thay thế kháng sinh, nâng cao hiệu quả quản lý dịch bệnh trong nuôi cá tra.

3. Doanh nghiệp sản xuất và cung cấp thuốc thú y thủy sản:
   Tham khảo để phát triển sản phẩm liệu pháp thực khuẩn thể, mở rộng thị trường và đa dạng hóa sản phẩm điều trị bệnh thủy sản.

4. Người nuôi cá tra tại Đồng bằng Sông Cửu Long:
   Áp dụng các giải pháp phòng trị bệnh hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại do bệnh gan thận mủ, nâng cao năng suất và chất lượng cá tra.

Câu hỏi thường gặp

1. Thực khuẩn thể là gì và tại sao lại được sử dụng thay thế kháng sinh?
   Thực khuẩn thể là virus đặc hiệu xâm nhiễm và phá hủy vi khuẩn. Chúng có tính đặc hiệu cao, không gây hại cho vật chủ và môi trường, đồng thời hạn chế sự đề kháng vi khuẩn như kháng sinh.

2. Chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân của thực khuẩn thể có ý nghĩa gì?
   Chu kỳ xâm nhiễm là thời gian từ khi thực khuẩn thể xâm nhập đến khi tế bào vi khuẩn bị phá hủy; hệ số nhân là số lượng thực khuẩn thể được giải phóng. Hai chỉ số này đánh giá hiệu quả và tốc độ hoạt động của thực khuẩn thể.

3. Liệu liệu pháp thực khuẩn thể có thể áp dụng trong điều kiện nuôi cá thực tế không?
   Kết quả nghiên cứu cho thấy thực khuẩn thể duy trì khả năng ức chế vi khuẩn trong môi trường nước ao nuôi cá tra đến 51 giờ, cho thấy tiềm năng ứng dụng thực tế cao.

4. Vi khuẩn có thể kháng lại thực khuẩn thể không?
   Có, vi khuẩn có thể thay đổi cấu trúc thụ thể bề mặt để tránh bị thực khuẩn thể xâm nhiễm. Giải pháp là sử dụng cocktail nhiều loại thực khuẩn thể khác nhau để hạn chế hiện tượng này.

5. Thời gian duy trì hiệu quả ức chế vi khuẩn của thực khuẩn thể là bao lâu?
   Trong môi trường dinh dưỡng chuẩn, thực khuẩn thể duy trì khả năng ức chế vi khuẩn khoảng 13-14 giờ; trong môi trường nước ao nuôi, thời gian này kéo dài đến 51 giờ.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 3 thực khuẩn thể pGA1, pGA2 và pGA3 có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri từ mẫu gan-thận cá tra tại ĐBSCL.
• Thực khuẩn thể pGA2 có hoạt tính xâm nhiễm mạnh nhất với hệ số nhân lên đến 77,63 và chu kỳ xâm nhiễm 65 phút.
• Khả năng ức chế vi khuẩn của các thực khuẩn thể duy trì khoảng 13-14 giờ trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và đến 51 giờ trong môi trường nước ao nuôi cá tra.
• Vi khuẩn có thể kháng lại thực khuẩn thể sau thời gian dài ức chế, cần nghiên cứu cocktail phage và cơ chế kháng phage để nâng cao hiệu quả điều trị.
• Nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho liệu pháp điều trị an toàn, hiệu quả thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra tại ĐBSCL.

Next steps: Tiến hành thử nghiệm in vivo, phát triển quy trình sản xuất thực khuẩn thể quy mô lớn và xây dựng hướng dẫn áp dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi cá tra.

Call to action: Các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và người nuôi cá tra nên hợp tác để phát triển và ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể, góp phần nâng cao hiệu quả nuôi trồng thủy sản bền vững.