Luận văn thạc sĩ hay xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật pcr và realtime pcr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Phạm Quỳnh Trang
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Long
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Quy trình phát hiện Microsporidia trong bệnh viêm loét giác mạc bằng PCR và Realtime PCR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. DANH MỤC HÌNH
• 2. DANH MỤC BẢNG
• 3. DANH MỤC VIẾT TẮT
• 4. MỞ ĐẦU
• 4.1. Nội dung nghiên cứu
• 4.2. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc
• 4.3. Màng đáy và màng Bowmann
• 4.4. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc
• 4.5. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc
• 4.5.1. Triệu chứng cơ năng
• 4.5.2. Triệu chứng thực thể
• 4.6. Giới thiệu chung
• 4.7. Bệnh học và nguy cơ
• 4.8. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia
• 4.9. Chẩn đoán viêm loét giác mạc
• 4.10. Các phương pháp phát hiện Microsporidia
• 4.11. Chẩn đoán phân biệt
• 4.12. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam
• 4.13. Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam hiện nay
• 4.14. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam
• 5. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
• 5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 5.2. Hóa chất, thiết bị
• 5.3. Phương pháp nghiên cứu
• 5.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
• 5.3.2. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
• 5.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 5.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic
• 5.4. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và Realtime PCR
• 5.4.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR
• 6. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 6.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR
• 6.2. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR
• 6.2.1. Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR
• 6.2.2. Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR
• 6.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia
• 6.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình phát hiện Microsporidia trong bệnh viêm loét giác mạc

Viêm loét giác mạc là một trong những bệnh lý nghiêm trọng về mắt, có thể dẫn đến mù lòa nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Microsporidia là một trong những tác nhân gây bệnh này, và việc phát hiện chính xác chúng là rất quan trọng. Quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR đã được nghiên cứu và áp dụng để nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong chẩn đoán.

1.1. Đặc điểm của Microsporidia và tác động đến sức khỏe mắt

Microsporidia là ký sinh trùng nội bào, có thể gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng ở mắt. Chúng thường gây viêm loét giác mạc, dẫn đến giảm thị lực và các biến chứng khác. Việc hiểu rõ về đặc điểm của Microsporidia giúp nâng cao khả năng chẩn đoán và điều trị.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm Microsporidia

Phát hiện sớm Microsporidia giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, từ đó giảm thiểu nguy cơ biến chứng. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại như PCR và Realtime PCR là cần thiết để nâng cao hiệu quả chẩn đoán.

II. Thách thức trong việc phát hiện Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán, việc phát hiện Microsporidia vẫn gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp truyền thống như nhuộm soi không đủ độ nhạy và độ đặc hiệu. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán sai và điều trị không hiệu quả.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp như kính hiển vi điện tử và nhuộm miễn dịch huỳnh quang thường tốn kém và yêu cầu kỹ thuật cao. Điều này làm cho chúng không khả thi trong thực hành lâm sàng hàng ngày.

2.2. Tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán

Việc áp dụng kỹ thuật PCR và Realtime PCR đã chứng minh khả năng tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu trong phát hiện Microsporidia. Điều này giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

III. Phương pháp phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện Microsporidia. Quy trình này bao gồm nhiều bước từ tách chiết ADN đến khuếch đại gen mục tiêu. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.

3.1. Quy trình tách chiết ADN từ mẫu bệnh phẩm

Quy trình tách chiết ADN từ mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ tinh khiết và nồng độ ADN đạt yêu cầu cho phản ứng PCR.

3.2. Điều kiện tối ưu hóa phản ứng PCR

Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR như nồng độ mồi, nhiệt độ phản ứng và thời gian khuếch đại là rất quan trọng để đạt được độ nhạy cao trong phát hiện Microsporidia.

IV. Ứng dụng Realtime PCR trong phát hiện Microsporidia

Realtime PCR là một bước tiến mới trong việc phát hiện Microsporidia. Kỹ thuật này cho phép theo dõi quá trình khuếch đại ADN theo thời gian thực, từ đó cung cấp thông tin chính xác về nồng độ của Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm.

4.1. Nguyên lý hoạt động của Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng đầu dò huỳnh quang để theo dõi sự khuếch đại ADN trong quá trình phản ứng. Điều này giúp xác định nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của Microsporidia.

4.2. Lợi ích của Realtime PCR trong chẩn đoán

Realtime PCR không chỉ tăng cường độ nhạy mà còn giảm thời gian chẩn đoán. Điều này rất quan trọng trong việc điều trị kịp thời cho bệnh nhân bị viêm loét giác mạc do Microsporidia.

V. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng kỹ thuật PCR và Realtime PCR trong phát hiện Microsporidia mang lại kết quả khả quan. Các mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân viêm loét giác mạc đã được phân tích và cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

5.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR và Realtime PCR trong phát hiện Microsporidia đạt trên 90%, cho thấy tính khả thi của phương pháp này trong thực hành lâm sàng.

5.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh viêm loét giác mạc

Việc phát hiện sớm Microsporidia giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu biến chứng cho bệnh nhân.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu Microsporidia

Việc phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR đã mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh viêm loét giác mạc. Nghiên cứu này không chỉ có giá trị trong việc nâng cao chất lượng chẩn đoán mà còn góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn trong tương lai.

6.1. Tương lai của nghiên cứu Microsporidia

Nghiên cứu về Microsporidia cần được tiếp tục mở rộng để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

6.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu lâm sàng để xác định rõ hơn về tần suất và tác động của Microsporidia trong bệnh viêm loét giác mạc, từ đó cải thiện quy trình chẩn đoán và điều trị.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm loét giác mạc (VLGM) là một trong những bệnh lý phổ biến nhất về mắt, chiếm tỷ lệ từ 17% đến 36% trong các trường hợp viêm loét giác mạc nói chung trên toàn cầu. Ở các quốc gia có khí hậu nóng ẩm như Việt Nam, tỷ lệ này còn cao hơn, với khoảng 0,4% các trường hợp viêm giác mạc do vi sinh vật gây ra là do Microsporidia. Microsporidia là ký sinh trùng nội bào bắt buộc, có kích thước nhỏ, được phát hiện lần đầu cách đây hơn 100 năm, có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan, trong đó có viêm loét giác mạc. Việc phát hiện chính xác Microsporidia đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán, lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và Real-time PCR, nhằm nâng cao độ nhạy và đặc hiệu trong chẩn đoán, góp phần cải thiện hiệu quả điều trị. Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu bệnh phẩm thu thập từ Bệnh viện Mắt Trung ương và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 trong giai đoạn 2016-2017. Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc giảm thiểu thời gian chẩn đoán, tăng khả năng phát hiện sớm tác nhân gây bệnh, từ đó giảm thiểu biến chứng và chi phí điều trị cho bệnh nhân.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR và Real-time PCR trong phát hiện vi sinh vật. Hai kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc khuếch đại ADN đặc hiệu, giúp phát hiện chính xác và định lượng vi sinh vật trong mẫu bệnh phẩm.

Ba khái niệm chính được áp dụng gồm:

• Microsporidia: Ký sinh trùng nội bào bắt buộc, có chu kỳ phát triển gồm pha tăng sinh (merogony) và pha tạo bào tử (sporogony), gây viêm loét giác mạc.
• PCR (Polymerase Chain Reaction): Kỹ thuật khuếch đại ADN đặc hiệu, gồm các bước biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi, giúp nhân bản đoạn gen mục tiêu.
• Real-time PCR: Phiên bản nâng cao của PCR, cho phép phát hiện và định lượng ADN khuếch đại trong thời gian thực nhờ tín hiệu huỳnh quang từ probe TaqMan.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 30 mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc được thu thập từ Bệnh viện Mắt Trung ương và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 trong giai đoạn 2016-2017. Ngoài ra, các chủng nấm (Aspergillus sp, Fusarium sp), vi khuẩn (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) và mẫu dương tính với virus HSV, CMV được sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Tách chiết ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm bằng dung dịch ly giải tế bào, kết hợp ly tâm và kết tủa ADN.
• Đo nồng độ và độ tinh sạch ADN bằng máy quang phổ (tỉ số OD260/OD280 > 1,8).
• Khuếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA đặc hiệu Microsporidia bằng PCR sử dụng cặp mồi MF1 & MF2.
• Xác định trình tự ADN sản phẩm PCR bằng máy giải trình tự CEQ 8800.
• Phát hiện và định lượng ADN Microsporidia bằng Real-time PCR với cặp mồi MSRT1 & MSRT2 và probe MSRT.
• Đánh giá độ nhạy bằng cách pha loãng ADN chuẩn dương theo thang 1000 lần.
• Đánh giá độ đặc hiệu bằng cách thử trên các mẫu vi sinh vật không phải Microsporidia.
• Tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia bằng kỹ thuật cloning vào vector pTZ57R/T để làm chuẩn đối chứng.

Timeline nghiên cứu kéo dài từ 2016 đến 2017, với các bước thực hiện tuần tự từ thu thập mẫu, tách chiết ADN, PCR, Real-time PCR đến phân tích dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng PCR và Real-time PCR:

   • PCR sử dụng cặp mồi MF1 & MF2 khuếch đại thành công đoạn gen SSU rRNA dài khoảng 254 bp đặc trưng cho Microsporidia.
   • Real-time PCR với cặp mồi MSRT1 & MSRT2 và probe MSRT cũng phát hiện chính xác đoạn gen này trên mẫu chuẩn dương.

2. Độ nhạy của phương pháp:

   • PCR phát hiện được ADN Microsporidia ở nồng độ pha loãng tới khoảng ngµ/L (theo ước tính).
   • Real-time PCR có độ nhạy cao hơn, phát hiện được ADN ở mức pha loãng thấp hơn so với PCR truyền thống, cho thấy khả năng phát hiện sớm hơn.

3. Độ đặc hiệu của phương pháp:

   • Cả PCR và Real-time PCR không khuếch đại ADN từ các chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và mẫu dương tính với HSV, CMV, chứng tỏ độ đặc hiệu cao.
   • Kết quả này giúp loại trừ các tác nhân gây viêm loét giác mạc khác, tăng tính chính xác trong chẩn đoán.

4. Ứng dụng trên mẫu bệnh phẩm thực tế:

   • Trên 30 mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc, PCR và Real-time PCR phát hiện Microsporidia với tỷ lệ cao hơn so với phương pháp nhuộm soi truyền thống.
   • Kết quả giải trình tự xác nhận đoạn gen khuếch đại thuộc chủng Vittaforma corneae với độ tương đồng 99% so với dữ liệu ngân hàng gen thế giới.

Thảo luận kết quả

Kỹ thuật PCR và Real-time PCR đã chứng minh được hiệu quả vượt trội trong phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc so với các phương pháp truyền thống như nhuộm soi hay nuôi cấy. Độ nhạy và đặc hiệu cao giúp phát hiện sớm tác nhân gây bệnh, từ đó hỗ trợ bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị chính xác và kịp thời.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả phù hợp với báo cáo về khả năng phát hiện Microsporidia bằng PCR trên các mẫu lâm sàng, đồng thời mở rộng ứng dụng Real-time PCR với ưu điểm định lượng và rút ngắn thời gian xét nghiệm. Việc xác định chính xác chủng Vittaforma corneae cũng góp phần làm rõ cơ chế bệnh sinh và dịch tễ học tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh tỷ lệ phát hiện Microsporidia giữa các phương pháp nhuộm soi, PCR và Real-time PCR, cũng như bảng thể hiện độ nhạy và đặc hiệu của từng kỹ thuật trên các mẫu đối chứng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng rộng rãi kỹ thuật PCR và Real-time PCR trong chẩn đoán viêm loét giác mạc do Microsporidia

   • Mục tiêu: Tăng tỷ lệ phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh.
   • Thời gian: Triển khai trong 1-2 năm tại các bệnh viện mắt lớn.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng xét nghiệm sinh học phân tử tại bệnh viện.

2. Đào tạo chuyên sâu cho kỹ thuật viên và bác sĩ nhãn khoa về kỹ thuật sinh học phân tử

   • Mục tiêu: Nâng cao năng lực chẩn đoán và xử lý mẫu bệnh phẩm.
   • Thời gian: Tổ chức các khóa đào tạo định kỳ hàng năm.
   • Chủ thể thực hiện: Trường đại học, bệnh viện chuyên khoa.

3. Xây dựng quy trình chuẩn và hướng dẫn kỹ thuật xét nghiệm PCR, Real-time PCR cho Microsporidia

   • Mục tiêu: Đảm bảo tính đồng nhất và chất lượng kết quả xét nghiệm.
   • Thời gian: Hoàn thiện trong 6 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, các viện nghiên cứu.

4. Tăng cường nghiên cứu dịch tễ học và đa dạng chủng Microsporidia tại Việt Nam

   • Mục tiêu: Hiểu rõ hơn về nguồn lây, cơ chế bệnh sinh và đề xuất biện pháp phòng ngừa.
   • Thời gian: Nghiên cứu liên tục trong 3-5 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu, trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ nhãn khoa và chuyên gia y tế

   • Lợi ích: Nắm bắt kỹ thuật chẩn đoán hiện đại, nâng cao hiệu quả điều trị viêm loét giác mạc do Microsporidia.
   • Use case: Áp dụng kỹ thuật PCR, Real-time PCR trong chẩn đoán lâm sàng.

2. Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử

   • Lợi ích: Học hỏi quy trình tách chiết ADN, kỹ thuật PCR và Real-time PCR chuyên sâu.
   • Use case: Thực hiện xét nghiệm phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm.

3. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y học

   • Lợi ích: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong y học thực nghiệm.
   • Use case: Phát triển đề tài nghiên cứu liên quan đến vi sinh vật và bệnh lý mắt.

4. Cơ quan quản lý y tế và bệnh viện

   • Lợi ích: Xây dựng chính sách, quy trình xét nghiệm chuẩn, nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị.
   • Use case: Đưa kỹ thuật PCR, Real-time PCR vào quy trình xét nghiệm thường quy.

Câu hỏi thường gặp

1. PCR và Real-time PCR khác nhau như thế nào trong phát hiện Microsporidia?
   PCR khuếch đại ADN và phát hiện sản phẩm sau phản ứng, trong khi Real-time PCR phát hiện và định lượng ADN trong quá trình phản ứng, cho kết quả nhanh và chính xác hơn. Ví dụ, Real-time PCR có thể phát hiện nồng độ ADN thấp hơn PCR truyền thống.

2. Độ nhạy của kỹ thuật PCR và Real-time PCR trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
   Real-time PCR phát hiện được ADN Microsporidia ở mức pha loãng thấp hơn PCR truyền thống, cho thấy độ nhạy cao hơn, giúp phát hiện sớm hơn trên mẫu bệnh phẩm có tải lượng vi sinh thấp.

3. Tại sao cần tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia?
   Plasmid chuẩn dương dùng làm chuẩn đối chứng trong xét nghiệm PCR, giúp kiểm soát chất lượng và độ chính xác của phản ứng, đảm bảo kết quả xét nghiệm đáng tin cậy.

4. Phương pháp PCR và Real-time PCR có thể phân biệt các chủng Microsporidia không?
   Kỹ thuật PCR và Real-time PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu đoạn gen SSU rRNA có thể phát hiện và phân biệt một số chủng Microsporidia như Vittaforma corneae, giúp định danh chính xác tác nhân gây bệnh.

5. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu này trong điều trị viêm loét giác mạc là gì?
   Phát hiện sớm và chính xác Microsporidia giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, giảm thiểu biến chứng, hạn chế phẫu thuật ghép giác mạc và giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và Real-time PCR với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Kỹ thuật Real-time PCR cho phép phát hiện sớm và định lượng chính xác ADN Microsporidia, vượt trội hơn PCR truyền thống và phương pháp nhuộm soi.
• Phân tích trình tự gen xác nhận chủng Vittaforma corneae là tác nhân gây bệnh phổ biến tại Việt Nam.
• Nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị viêm loét giác mạc do Microsporidia, giảm thiểu biến chứng và chi phí điều trị.
• Khuyến nghị triển khai áp dụng kỹ thuật PCR và Real-time PCR rộng rãi tại các bệnh viện lớn, đồng thời tiếp tục nghiên cứu dịch tễ học và đa dạng chủng Microsporidia trong tương lai.

Hành động tiếp theo là đào tạo nhân lực, xây dựng quy trình chuẩn và mở rộng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán các bệnh lý mắt do vi sinh vật gây ra.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc Viêm loét giác mạc (VLGM) là bệnh nhiễm trùng nặng ở mắt do vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, virut, kí sinh trùng.v… Bệnh viêm loét giác mạc thường tiến triển nặng, gây nhiều biến chứng và khi khỏi để lại sẹo dày ở giác mạc gây mờ đục giác mạc, làm giảm thị lực nghiêm trọng [1, 8]. Ở các nước phát triển như Mỹ, Tây Âu tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm chiếm khoảng 3% trong tổng số các nguyên nhân gây viêm loét giác mạc. Tỷ lệ này cao hơn ở các nước đang phát triển như: Ấn Độ, Nê-pan, Băng-la-đét.

Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt trung ương trong 10 năm (1998 - 2007) trong số 3210 bệnh nhân viêm loét giác mạc được điều trị nội trú thì viêm loét giác mạc chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 50,8% [1]. Có nhiều nguyên nhân gây ra viêm loét giác mạc như: vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh trùng, Microsporidia… Tỷ lệ gặp các tác nhân gây bệnh này thay đổi theo thời gian do có sự thay đổi về môi trường, kinh tế, các yếu tố nguy cơ và sự hiểu biết của người dân.Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu tại bệnh viện mắt Trung ương những năm 1991- 1996 thì tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm khá cao 42,11% nhưng vào năm 2004- 2005 thì tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm lại được ghi nhận nhiều hơn 59,8% trong khi vi khuẩn chỉ chiếm 29,4%. Điều trị viêm loét giác mạc tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh và mức độ trầm trọng của bệnh. Việc điều trị viêm loét giác mạc ở nước ta hiện nay tương đối hiệu quả.

Song tỉ lệ biến chứng sẹo thủng giác mạc, giảm thị lực thậm chí mù lòa tăng lên rất nhiều nếu việc chẩn đoán và điều trị không kịp thời. Nhất là khi điều kiện kĩ thuật giúp chẩn đoán ở các cơ sở chưa phát triển và bệnh nhân chưa ý tức được sự nguy hiểm của bệnh viêm loét giác mạc. Điều này không chỉ gây nên gánh nặng cho bản thân người bệnh mà còn làm tăng gánh nặng cho gia đình và toàn xã hội [2, 6, 7]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Giác mạc Giác mạc là một màng xơ trong suốt, không có mạch máu, chiếm 1/5 diện tích phía trước của vỏ nhãn cầu diện tích khoảng 123mm vuông. Bán kính độ cong giác mạc trung bình ở người Việt Nam trưởng thành là 7,71±0,24mm Đường kính ngang bằng 12mm, đường kính dọc bằng 11mm. Độ dày là 0,509mm ở trung tâm, 0,74mm ở sát vùng rìa. Ranh giới giữa giác mạc và củng mạc là vùng rìa giác mạc bề rộng của vùng rìa chừng 1mm.

Đây là vùng có cấu tạo giải phẫu rất đặc biệt và vai trò sinh lý rất quan trọng của nhãn cầu [1, 8, 19]. Giác mạc được cấu tạo gồm 5 lớp từ trước ra sau, bao gồm: - Lớp biểu mô giác mạc - Lớp màng Bowman - Lớp nhu mô - Lớp màng Descemet - Lớp nội mô Hình 1. Thiết đồ cắt dọc giác mạc 1. Biểu mô Biểu mô giác mạc là lớp ngoài cùng, liên tiếp với biểu mô của kết mạc nhãn cầu và dễ tách ra khỏi màng Bowmann ở dưới, dày khoảng 32-50 µm, gồm 5-7 hàng tế bào không sừng hoá, có dạng trụ ở lớp đáy, càng lên phía trước càng dẹt đi [1, 8].

Biểu mô giác mạc là lớp bảo vệ, ngăn không cho các vi sinh vật xâm nhập vào nhu mô giác mạc. Tuy nhiên, khi biểu mô toàn vẹn, các thuốc cũng rất khó thấm qua biểu mô, nhất là các thuốc không tan trong nước [1, 8]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Màng đáy và màng Bowmann Màng đáy là một màng rất mỏng nằm sát ngay dưới lớp tế bào đáy của biểu mô (thực chất do tế bào đáy tạo thành), dày khoảng 40-60 µm [1, 8].

Màng Bowmann là một màng trong suốt, dày khoảng 12µm và khá dai. Mặt trước có giới hạn rõ rệt, mặt sau khó phân tách với nhu mô giác mạc. Màng này khi bị tổn thương thì không có khả năng hồi phục, ở vùng tổn thương sẽ để lại sẹo mỏng [2, 19]. Nhu mô Nhu mô chiếm 90% bề dày giác mạc, cơ bản được tạo thành bởi các lá sợi collagen xếp song song nhau, các giác mạc bào (keratocytes) và các chất ngoại bào.

Ngoài ra trong nhu mô giác mạc còn có một số bạch cầu di động giữa các lá collagen và các sợi thần kinh không myelin xuất phát từ thần kinh mi (thuộc nhánh mắt của dây thần kinh số V) đi theo hình nan hoa vào lớp giữa nhu mô ở trung tâm giác mạc, sau đó chia nhánh theo kiểu phân đôi và đi lên các lớp nông giác mạc, qua màng Bowmann và tận cùng bằng các đầu tiếp nhận cảm giác ở giữa các tế bào biểu mô. Do đó tổn thương giác mạc càng nông thì các triệu chứng chủ quan của bệnh nhân càng mạnh [1, 8]. Khi nhu mô tổn thương sẽ để lại sẹo dày. Màng Descemet Màng Descemet được cấu tạo bởi các sợi collagen dạng lưới.

Màng Descemet chỉ dày 6µm, tách khỏi nhu mô dễ dàng và có thể được tái tạo bởi lớp nội mô. Màng Descemet rất dai, có tính đàn hồi cao nên khi bị rách hai mép dễ thun lại và tách rời nhau khỏi chỗ tổn thương [2]. Màng Descemet tương đối bền vững, có thể tồn tại kể cả khi giác mạc bị hoại tử gần hết nhu mô [1, 8]. Nội mô Nội mô gồm một hàng tế bào hình đa giác, đường kính khoảng 20 µm, dày 4 - 6 µm với một nhân lớn chiếm gần hết tế bào, liên kết với nhau bằng những liên kết chặt và liên kết dạng khe hở [1].

Tế bào nội mô không phân chia và số LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 lượng tế bào nội mô giảm dần theo tuổi tác: lúc sinh mật độ tế bào là 4000 tế bào/mm2, số lượng tế bào giảm xuống còn khoảng 1400 - 2500 tế bào/mm2 ở người trưởng thành. Khi mật độ tế bào chỉ còn 400 - 700 tế bào/mm2 hoặc thấp hơn thì các tế bào nội mô còn lại sẽ mất khả năng bù trừ. Giác mạc sẽ bị ngấm nước và trở nên phù đục mất đặc tính trong suốt [3, 8]. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc - Chấn thương: làm tổn thương một phần hay toàn bộ giác mạc.

+ Chấn thương nông nghiệp: là yếu tố thường gặp nhất, chủ yếu do các tác nhân thực vật (cành cây, gai, mảnh gỗ, hạt thóc, lá lúa,…). + Chấn thương công nghiệp: các dị vật bắn vào giác mạc (phoi tiện, mảnh sắt vụn, đá…. - Các bệnh mãn tính trên bề mặt nhãn cầu (hở mi, lông xiêu, lông quặm, viêm giác mạc do herpes…) làm khô giác mạc và xước giác mạc. - Liệt dây thần kinh số V: làm cho giác mạc mất cảm giác.

Vì vậy, giác mạc không được bảo vệ bởi phản xạ nhắm mắt. - Các yếu tố nguy cơ khác: sử dụng kính tiếp xúc, phẫu thuật ở giác mạc và kết mạc, suy giảm miễn dịch, sử dụng thuốc kháng sinh và các thuốc corticosteroid mà không có sự kiểm soát của các bác sĩ chuyên khoa mắt, bệnh nhân có tiền sử mắc bệnh nấm ở da, niêm mạc, nội tạng… [8, 19]. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc Viêm loét giác mạc do kí sinh trùng có biểu hiện lâm sàng rất đa dạng. Tuy nhiên, bệnh có các triệu chứng đặc trưng.

Do đó, các triệu chứng có thể giúp định hướng chẩn đoán nguyên nhân trong trường hợp chưa có kết quả cận lâm sàng [1, 3, 19]. Triệu chứng cơ năng - Dấu hiệu kích thích mắt: sợ ánh sáng, cộm, chói, chảy nước mắt, co quắp mi. - Đau nhức: đau âm ỉ tại mắt, đau có thể lan ra xung quanh hốc mắt hoặc lan lên đầu. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 - Nhìn mờ: thị lực giảm nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ tổn thương trên giác mạc [19].

Triệu chứng thực thể Các dấu hiệu thường gặp: - Kết mạc cương tụ rìa hoặc toàn bộ. - Đặc điểm của ổ loét giác mạc: + Vị trí: có thể ở vùng rìa, cạnh trung tâm, trung tâm hoặc toàn bộ giác mạc. + Màu sắc: thường có màu trắng xám và giác mạc xung quanh mờ đục do phù nề. + Kích thước: từ những chấm nhỏ đến toàn bộ giác mạc.

+ Hình thái: * Bờ ổ loét: thâm nhiễm như lông hoặc dạng sợi, trong nhu mô giác mạc có những đường phân nhánh tỏa theo hình nan hoa từ bờ của ổ loét ra nhu mô xung quanh được gọi là thẩm lậu dạng ngón tay hay dấu hiệu chân giả. * Bề mặt ổ loét: bề mặt gồ cao, toàn bộ hoặc phần lớn đáy ổ loét cao hơn giác mạc xung quanh, không có hoại tử mềm mà thô ráp khô như một miếng màng cứng, dạng vảy. * Áp xe giác mạc: ổ áp xe đặc chiếm hết bề dày nhu mô và tiến triển vào tiền phòng. * Mảng nội mô: là mảng xuất tiết trắng, dày bám mặt sau nội mô, có thể xuất hiện trong trường hợp viêm loét giác mạc không phải do nấm.

Một số trường hợp biểu mô đã hàn gắn hoàn toàn nhưng mảng này vẫn còn tồn tại thì nghĩ nhiều đến nấm. * Vòng thâm nhiễm: hay còn gọi là vòng miễn dịch, là vòng trắng bao quanh ổ loét, thường có một khoảng giác mạc lành ngăn cách với ổ loét, có thể đây là đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh. * Tổn thương vệ tinh: ở cạnh ổ loét và có vẻ như tách rời ổ loét. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 + Phản ứng tiền phòng: biểu hiện của một phản ứng viêm nặng ở mắt, thường xuất hiện dấu hiệu Tyndall kèm theo nếp gấp ở màng Descemet.

* Mủ tiền phòng: là dấu hiệu thường gặp trong viêm loét giác mạc. Kí sinh trùng có thể xuyên qua màng Descemet vào tiền phòng ngay cả khi ổ loét giác mạc nhỏ. Có thể đó là mủ vô trùng do lắng đọng các tế bào viêm. Mủ có thể tái phát, tái xuất hiện nhanh sau khi rửa mủ tiền phòng [16, 19].

Giới thiệu chung Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử, kí sinh nội bào bắt buộc, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Microsporidia” không phải là một từ thuộc phân loại học, có liên hệ đến một vi sinh vật thuộc bộ Microsporida, ngành Microspora. Thuật ngữ về phân loại học của Microsporidia phức tạp và thay đổi. Có 14 loài thuộc 07 họ được báo cáo gây bệnh trực tiếp cho người (Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, Pleistophora, Vittaforma, Trachipleistophora và Brachiola).Trong đó chỉ có hai loài được công nhận gây bệnh trên mắt là Nosema, Vittaforma.