Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) là nhóm dược chất hạ sốt, giảm đau và kháng viêm được sử dụng phổ biến trong y học cũng như trong chăn nuôi thú y. Do hiệu quả điều trị cao đối với các bệnh viêm nhiễm ở vật nuôi, nhóm thuốc này thường bị lạm dụng hoặc không tuân thủ thời gian ngừng thuốc trước khi giết mổ, dẫn đến nguy cơ tồn dư trong các mô thực phẩm như thịt động vật. Mặc dù nồng độ tồn dư trong thực phẩm đưa vào cơ thể người thường ở phạm vi microgam mỗi ngày—thấp hơn 3 đến 4 bậc so với liều điều trị thông thường và ít có khả năng gây độc tính cấp—nhưng các hợp chất NSAIDs có khả năng phân hủy sinh học thấp, có xu hướng tích lũy sinh học và có thể gây tổn thương nghiêm trọng đến đường tiêu hóa, gan, thận, hệ tim mạch và hô hấp khi phơi nhiễm mạn tính.

Nhằm bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, Liên minh châu Âu (EU) thông qua Quy định số 37/2010 đã ban hành mức giới hạn tối đa dư lượng (MRLs) đối với một số hoạt chất NSAIDs trong thực phẩm có nguồn gốc động vật. Nhiều quốc gia như Mỹ, Nhật Bản và Trung Quốc cũng đã đưa nhóm thuốc này vào chương trình giám sát quốc gia. Tại Việt Nam, Thông tư số 24/2013/TT-BYT ngày 14 tháng 8 năm 2013 của Bộ Y tế quy định mức giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm hiện vẫn chưa đưa các thuốc nhóm NSAIDs vào danh mục kiểm soát, đồng thời chưa có phương pháp tiêu chuẩn chính thức để phân tích đồng thời nhóm chất này trên nền mẫu thịt động vật.

Trước yêu cầu thực tiễn đó, đề tài "Xây dựng phương pháp xác định tồn dư NSAIDs trong mẫu thịt bằng LC-MS/MS" được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất (Trường Đại học Dược Hà Nội) và Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia vào năm 2024, nhằm giải quyết hai mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs (diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid) trong thịt động vật sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
  2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số thuốc nhóm NSAIDs trong các mẫu thịt động vật thực tế thu thập trên thị trường.

Đối tượng nghiên cứu trọng tâm là 4 hoạt chất kháng viêm không steroid điển hình gồm: diclofenac (DIC), flunixin (FLU), meloxicam (MEL) và tolfenamic acid (TOL). Đối tượng mẫu phân tích thực tế gồm các mẫu thịt động vật (thịt lợn, thịt bò, thịt gà) được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ và cửa hàng trên địa bàn thành phố Hà Nội trong năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và đặc tính đối tượng nghiên cứu

Bốn hoạt chất NSAIDs được nghiên cứu đại diện cho các nhóm cấu trúc hóa học khác nhau với đặc tính hóa lý riêng biệt:

  • Diclofenac (DIC): Dẫn xuất acid acetic, công thức phân tử $C_{14}H_{11}Cl_{2}NO_{2}$ ($M = 296,2\text{ g/mol}$), điểm nóng chảy 283–285°C, $\text{LogP} = 4,5$, $pK_a = 4,0$; ít tan trong nước, dễ tan trong methanol; dạng dược dụng phổ biến là muối natri.
  • Flunixin (FLU): Dẫn xuất acid nicotinic/anthranilic, công thức phân tử $C_{14}H_{11}F_{3}N_{2}O_{2}$ ($M = 296,2\text{ g/mol}$), điểm nóng chảy 226–228°C, $\text{LogP} = 4,1$, tính acid yếu; rất ít tan trong nước, dễ tan trong dung môi kém phân cực; dạng dùng phổ biến là muối meglumin.
  • Meloxicam (MEL): Dẫn xuất enolic acid (oxicam), công thức phân tử $C_{14}H_{13}N_{3}O_{4}S_{2}$ ($M = 351,4\text{ g/mol}$), điểm nóng chảy 254–256°C, $pK_a = 4,1$; thực tế không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, rất khó tan trong ethanol 96%.
  • Tolfenamic acid (TOL): Dẫn xuất acid anthranilic/fenamate, công thức phân tử $C_{14}H_{12}ClNO_{2}$ ($M = 261,7\text{ g/mol}$), điểm nóng chảy 207–207,5°C, $\text{LogP} = 5,2$, $pK_a = 5,1$; rất ít tan trong nước, tan trong dung môi kém phân cực.

Độc tính chung của các NSAIDs gồm kích ứng, loét và xuất huyết đường tiêu hóa; tăng huyết áp và tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim; giảm lưu lượng máu đến thận gây suy giảm chức năng thận; tổn thương tế bào gan và gây co thắt phế quản ở bệnh nhân hen suyễn.

Về quy định pháp lý quốc tế, Quy định số 37/2010 của Ủy ban Châu Âu (EU) thiết lập mức MRLs cho các hoạt chất này trong mô thịt động vật như sau:

  • Diclofenac: 5 µg/kg (bò, lợn).
  • Flunixin: 20 µg/kg (bò), 50 µg/kg (lợn), 10 µg/kg (ngựa).
  • Meloxicam: 20 µg/kg (trâu, bò, lợn, thỏ, ngựa).
  • Tolfenamic acid: 50 µg/kg (bò, lợn).

Phương pháp nghiên cứu và thiết bị phân tích

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) hoạt động ở chế độ ion hóa phun điện tử dương (ESI+), phát hiện theo phương thức phân mảnh ion phản ứng đa chặng (MRM). Kỹ thuật này cung cấp độ nhạy cao, độ chọn lọc tuyệt đối nhờ theo dõi đồng thời ion mẹ và 2 ion con đặc trưng cho mỗi chất, đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe về điểm nhận dạng chất (IP).

Quy trình xử lý mẫu áp dụng kỹ thuật chiết tách dựa trên nguyên lý QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) kết hợp thủy phân bằng enzym để giải phóng các dạng liên hợp glucuronid của NSAIDs trong mô động vật.

Trang thiết bị chính sử dụng:

  • Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ ABI 5500 QQQ (Applied Biosystems) kết hợp HPLC 20 AXL (Shimadzu).
  • Cân phân tích Mettler Toledo (độ chính xác 0,1 mg và 0,01 mg).
  • Máy ly tâm Mikro 200R (Hettich - Đức) tốc độ tối đa 13.000 rpm.
  • Máy lắc xoáy vortex IKA, máy rung siêu âm Elma, hệ thống thổi khô khí nitơ ($N_2$).
  • Hóa chất, dung môi: Acetonitril, methanol, acid formic, acid acetic, amoni acetat, $\beta$-glucuronidase (Merck); chất hấp phụ C18, PSA, than hoạt tính (Agilent); muối khan $MgSO_4$, $NaCl$, $CH_3COONa$.
  • Chất chuẩn phân tích: Diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid độ tinh khiết phân tích từ hãng Dr. Ehrenstorfer.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan

Tác giả tổng hợp tổng quan về phân loại, cấu trúc hóa học, dược lý học, độc tính của nhóm thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs) và các nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe người tiêu dùng khi tồn dư trong thực phẩm. Chương này phân tích hệ thống văn bản pháp lý hiện hành, chỉ rõ sự thiếu hụt quy định MRLs đối với nhóm NSAIDs tại Việt Nam theo Thông tư 24/2013/TT-BYT, đồng thời so sánh với khung pháp lý của Liên minh châu Âu (Regulation 37/2010/EU).

Bên cạnh đó, chương tổng quan lược khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về phương pháp phân tích NSAIDs trong thực phẩm (thịt, sữa). Các nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng chiết pha rắn (SPE) với các cột như SepPak Alumina N, Oasis HLB kết hợp LC-MS/MS hoặc UHPLC-MS/MS. Điểm hạn chế chung của các phương pháp cũ là quy trình xử lý qua nhiều bước làm giàu tốn kém dung môi, sử dụng cột SPE đắt tiền, một số phương pháp cho hiệu suất thu hồi thấp (36%–45%) hoặc giới hạn định lượng chưa đồng đều. Từ đó, tác giả định hướng phát triển quy trình xử lý mẫu đơn giản hơn bằng QuEChERS kết hợp giải phóng liên hợp bằng enzym.

Đối tượng và phương pháp phân tích

Chương này quy định chi tiết đối tượng, hóa chất, chất chuẩn, trang thiết bị và các bước thực nghiệm:

  1. Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn đơn chất 50 ng/mL vào nguồn ion ESI để lựa chọn ion mẹ, mảnh ion con định tính và định lượng, tối ưu năng lượng va chạm (CE) và thế đầu vào.
  2. Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn loại cột phân tích sắc ký pha đảo và khảo sát thành phần pha động, chương trình dung môi gradient rửa giải nhằm tối ưu hóa độ đối xứng của pic, giảm thiểu hiện tượng dính pic và rút ngắn thời gian lưu.
  3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu: Khảo sát 5 biến số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết: vai trò của enzym $\beta$-glucuronidase, pH của dung dịch đệm (khảo sát pH 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0), nhiệt độ ủ mẫu (nhiệt độ phòng 21°C, 37°C, 40°C, 50°C, 60°C, 80°C), loại muối chiết ($MgSO_4$, $NaCl$, hỗn hợp $MgSO_4 + NaCl$) và thành phần chất hấp phụ làm sạch (bột C18, $NaCl$, $CH_3COONa$).
  4. Quy trình thẩm định: Thiết kế thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 và Quy định Ủy ban châu Âu (EU) 2021/808 đối với các chỉ tiêu: tính đặc hiệu/chọn lọc, số điểm nhận dạng (IP), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi, độ tái lặp nội bộ và độ phù hợp hệ thống.
  5. Phân tích mẫu thực tế: Quy định phương pháp xử lý số liệu trên phần mềm thiết bị và Microsoft Excel 2016 khi khảo sát 15 mẫu thịt thương phẩm tại Hà Nội.

Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Chương thực nghiệm cung cấp toàn bộ kết quả khảo sát, tối ưu hóa và thẩm định phương pháp:

1. Tối ưu hóa điều kiện phân tích LC-MS/MS

  • Điều kiện khối phổ: Lựa chọn chế độ ESI(+). Mỗi chất đã chọn được 1 ion mẹ và 2 ion con đặc trưng (1 ion định lượng và 1 ion định tính). Các thông số nguồn ion được cố định: thế ion hóa (ISV) = 3500 V; nhiệt độ nguồn (TEM) = 650°C; áp suất khí nguồn 1 (GS1) = 50 psi; áp suất khí nguồn 2 (GS2) = 55 psi; áp suất khí màng (CUR) = 30 psi; áp suất khí va chạm (CAD) = 8 psi.
Hoạt chất Ion mẹ ($m/z$) Ion con định lượng ($m/z$) [CE (eV)] Ion con định tính ($m/z$) [CE (eV)] Điểm IP
Diclofenac (DIC) 296,0 215,0 [31] 250,0 [19] 5
Flunixin (FLU) 297,0 264,0 [47] 210,0 [45] 5
Meloxicam (MEL) 352,0 115,0 [53] 141,0 [23] 5
Tolfenamic acid (TOL) 262,0 244,0 [27] 209,0 [37] 5
  • Điều kiện sắc ký: So sánh 3 hệ pha động và 3 loại cột sắc ký: Symmetry C18 (150 mm × 4,6 mm × 5,0 µm), XBridge BEH C18 (100 mm × 4,6 mm × 2,5 µm) và Symmetry C18 (150 mm × 2,1 mm × 3,5 µm). Cột Symmetry C18 (150 mm × 4,6 mm × 5,0 µm) cho pic nhọn, cân đối, không bị chẻ pic hay dính pic như hai cột còn lại. Pha động lựa chọn gồm: kênh A là dung dịch acid formic 0,1% trong nước và kênh B là acetonitril. Tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL. Chương trình gradient: 0–1,5 phút (10% B); 1,5–3,5 phút (tăng lên 95% B); 3,5–5,0 phút (giữ 95% B); 5,0–6,5 phút (giảm về 10% B); 6,5–8,0 phút (cân bằng 10% B).

2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu

  • Vai trò enzym: Mẫu thủy phân bằng enzym $\beta$-glucuronidase làm tăng diện tích pic thêm 12% đối với meloxicam và tăng 55% đối với diclofenac so với mẫu không dùng enzym, chứng minh sự tồn tại dạng liên hợp glucuronid trong mô thịt.
  • pH đệm và nhiệt độ ủ: Đệm acetat pH 4,5 cho diện tích pic cao nhất (do khoảng hoạt động tối ưu của enzym từ pH 4,0–5,5). Nhiệt độ ủ tối ưu đạt được tại 37°C.
  • Muối chiết: Hỗn hợp $2\text{ g } MgSO_4 + 0,5\text{ g } NaCl$ cho hiệu quả tách pha acetonitril - nước và chuyển chất phân tích sang pha hữu cơ vượt trội so với khi dùng đơn lẻ từng loại muối.
  • Muối làm sạch: Hỗn hợp $0,5\text{ g chất hấp phụ C18} + 0,5\text{ g } NaCl$ loại bỏ tốt lipid, protein mà không làm suy giảm tín hiệu chất phân tích.
  • Quy trình tối ưu chuẩn hóa: Cân 2,0 g mẫu thịt đã đồng nhất $\rightarrow$ thêm 4 mL đệm acetat pH 4,5 và 50 µL $\beta$-glucuronidase (50 IU) $\rightarrow$ lắc 1 phút, ủ 37°C trong 60 phút $\rightarrow$ thêm 10 mL acetonitril, siêu âm 40°C trong 30 phút $\rightarrow$ thêm 2 g $MgSO_4$ và 0,5 g $NaCl$, lắc 1 phút, ly tâm 6000 rpm trong 5 phút $\rightarrow$ chuyển dịch nổi sang ống chứa 0,5 g C18 và 0,5 g $NaCl$, ly tâm 6000 rpm trong 3 phút $\rightarrow$ thổi khô dịch nổi bằng khí $N_2$ $\rightarrow$ hoàn nguyên cắn trong 1 mL methanol $\rightarrow$ lọc qua màng 0,22 µm $\rightarrow$ tiêm LC-MS/MS.

3. Kết quả thẩm định phương pháp

  • Tính chọn lọc/đặc hiệu: Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu tại thời gian lưu của 4 chất. Thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn sai lệch dưới 5%. Số điểm nhận dạng của cả 4 chất đều đạt 5 điểm (1 điểm kỹ thuật LC-MS/MS + 1 điểm ion mẹ + 2 × 1,5 điểm cho hai ion con). Độ lệch tỷ lệ cường độ ion con giữa mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn dao động từ 14,9% đến 87,6%, đều nằm trong khoảng cho phép theo Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808.
  • Độ nhạy (LOD, LOQ): Xác định theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu ($S/N$): LOQ tại $S/N \ge 10$, LOD tại $S/N \approx 3$.
Hoạt chất $S/N$ tại LOQ LOQ (µg/kg) $S/N$ tại LOD LOD (µg/kg)
Diclofenac 11,2 4,0 2,8 1,0
Flunixin 10,8 0,1 2,8 0,04
Meloxicam 13,7 1,0 4,4 0,4
Tolfenamic acid 9,3 1,0 3,9 0,4
  • Khoảng tuyến tính: Thực hiện trên nền mẫu thịt thêm chuẩn ở các mức nồng độ LOQ, 4LOQ, 10LOQ, 20LOQ, 50LOQ. Tất cả các đường chuẩn đều có hệ số tương quan $R > 0,998$, độ lệch tại các điểm chuẩn không vượt quá 15% (và không quá 20% tại LOQ):
    • Diclofenac: 4,0 – 200 µg/kg ($y = 9442,7x + 2719,6$; $R = 0,9999$; độ lệch -5,0% đến 7,0%).
    • Flunixin: 0,10 – 5,0 µg/kg ($y = 39027x + 3419,3$; $R = 0,9999$; độ lệch -2,0% đến 8,0%).
    • Meloxicam: 1,0 – 50 µg/kg ($y = 36974x + 6274,7$; $R = 0,9998$; độ lệch -6,1% đến 5,0%).
    • Tolfenamic acid: 1,0 – 50 µg/kg ($y = 1329,2x - 687,62$; $R = 0,9987$; độ lệch -8,6% đến 10,0%).
  • Độ thu hồi và độ lặp lại: Đánh giá trên mẫu thịt thêm chuẩn ở 3 mức (LOQ, 4LOQ, 10LOQ), mỗi mức lặp lại 6 lần ($n = 6$):
    • Diclofenac: Độ thu hồi ($R$) đạt 82,4% – 110%; độ lặp lại ($RSD$) đạt 2,45% – 9,59%.
    • Flunixin: Độ thu hồi ($R$) đạt 86,8% – 110%; độ lặp lại ($RSD$) đạt 4,83% – 8,05%.
    • Meloxicam: Độ thu hồi ($R$) đạt 89,0% – 108%; độ lặp lại ($RSD$) đạt 5,47% – 7,14%.
    • Tolfenamic acid: Độ thu hồi ($R$) đạt 91,6% – 110%; độ lặp lại ($RSD$) đạt 4,21% – 5,67%. Tất cả các giá trị $RSD$ đều nhỏ hơn giới hạn 21% theo yêu cầu của AOAC 2016.
  • Độ tái lặp nội bộ: Thực hiện bởi 2 kiểm nghiệm viên độc lập trên mẫu thêm chuẩn mức 20 ppb tại các ngày khác nhau ($n = 6$). Giá trị $RSD_R$ thực nghiệm lần lượt là: diclofenac = 7,15%; flunixin = 7,53%; meloxicam = 4,67%; tolfenamic acid = 7,60%. Tất cả đều nhỏ hơn nhiều so với giá trị tới hạn tính theo phương trình Horwitz ($PRSD_R = 2 \times C^{-0,15} = 28,57%$).
  • Độ phù hợp hệ thống ($n = 6$): $RSD$ thời gian lưu của cả 4 chất nằm trong khoảng 0,10% – 0,30% ($< 2%$). $RSD$ diện tích pic nằm trong khoảng 0,27% – 0,97% ($< 2%$), đáp ứng tiêu chí AOAC 2016.

4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Phân tích 15 mẫu thịt thu thập ngẫu nhiên tại thị trường Hà Nội (gồm 6 mẫu thịt gà, 5 mẫu thịt lợn, 4 mẫu thịt bò):

Ký hiệu mẫu Nền mẫu Kết quả phân tích hoạt chất (µg/kg) Đánh giá theo chuẩn EU (37/2010)
M1 Thịt gà Meloxicam < LOQ; Tolfenamic acid = 8,51 Đạt
M2 Thịt bò Meloxicam < LOQ Đạt
M3 Thịt gà Tolfenamic acid < LOQ Đạt
M4 Thịt gà Không phát hiện (ND) Đạt
M5 Thịt gà Tolfenamic acid = 7,83 Đạt
M6 Thịt lợn Không phát hiện (ND) Đạt
M7 Thịt gà Tolfenamic acid = 11,6 Đạt
M8 Thịt lợn Tolfenamic acid = 7,09 Đạt (MRL = 50 µg/kg)
M9 Thịt lợn Tolfenamic acid = 5,21 Đạt (MRL = 50 µg/kg)
M10 Thịt gà Tolfenamic acid = 9,18 Đạt
M11 Thịt lợn Không phát hiện (ND) Đạt
M12 Thịt bò Không phát hiện (ND) Đạt
M13 Thịt lợn Tolfenamic acid = 15,9 Đạt (MRL = 50 µg/kg)
M14 Thịt bò Không phát hiện (ND) Đạt
M15 Thịt bò Không phát hiện (ND) Đạt

Trong 15 mẫu phân tích, không phát hiện diclofenac và flunixin. Có 2 mẫu phát hiện meloxicam ở mức vết dưới LOQ (< 1,0 µg/kg). Tolfenamic acid được phát hiện định lượng trong 7 mẫu (chiếm tỷ lệ 46,7%), gồm 4 mẫu thịt gà (hàm lượng 7,83 – 11,6 µg/kg) và 3 mẫu thịt lợn (hàm lượng 5,21 – 15,9 µg/kg). Các mẫu thịt lợn nhiễm tolfenamic acid đều có hàm lượng thấp hơn giới hạn cho phép của EU (50 µg/kg). Thịt gà hiện chưa có quy định MRLs cho tolfenamic acid tại cả EU và Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình phân tích đồng thời 4 hoạt chất kháng viêm không steroid (diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid) trên nền mẫu thịt động vật bằng kỹ thuật LC-MS/MS kết hợp tiền xử lý mẫu cải tiến:

  1. Xác lập bộ thông số vận hành tối ưu cho thiết bị LC-MS/MS: cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm × 4,6 mm × 5,0 µm), hệ pha động acid formic 0,1% và acetonitril; nguồn ion hóa ESI(+) với 2 cặp chuyển khối ion cho mỗi chất.
  2. Thiết lập quy trình chiết tách QuEChERS có bổ sung thủy phân bằng $\beta$-glucuronidase ở 37°C trong 60 phút, giúp nâng cao hiệu suất thu hồi đáng kể so với phương pháp không dùng enzym (tăng 12% diện tích pic meloxicam và tăng 55% diện tích pic diclofenac).
  3. Thẩm định đầy đủ phương pháp theo chuẩn AOAC 2016 và EC/808/2021: Giới hạn định lượng đạt mức ppb cực thấp ($LOQ_{FLU} = 0,1\text{ µg/kg}$; $LOQ_{MEL} = LOQ_{TOL} = 1,0\text{ µg/kg}$; $LOQ_{DIC} = 4,0\text{ µg/kg}$); khoảng tuyến tính rộng với $R > 0,998$; độ thu hồi trung bình đạt 82,4% – 110%; độ chụm nội bộ $RSD < 10%$; độ tái lặp $RSD_R < 7,60%$.
  4. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm trên 15 mẫu thịt tại Hà Nội: Xác định 7/15 mẫu có tồn dư tolfenamic acid trên ngưỡng LOQ (dao động 5,21 – 15,9 µg/kg) và 2 mẫu có dấu vết meloxicam dưới ngưỡng LOQ.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

So với các công bố quốc tế được trích dẫn (như Jedziniak et al., 2010; Dowling et al., 2008; Dai et al., 2015), nghiên cứu này khắc phục các nhược điểm lớn của kỹ thuật chiết pha rắn SPE truyền thống:

  • Tối ưu hóa kinh tế và quy trình: Thay thế các cột SPE phức tạp, đắt tiền và khó tiếp cận tại thị trường Việt Nam (như cột SepPak Alumina N, Oasis HLB) bằng kỹ thuật chiết phân tán pha rắn kết hợp muối $MgSO_4$, $NaCl$ và chất hấp phụ C18 dạng rời.
  • Rút ngắn thời gian và độc hại: Giảm thiểu lượng dung môi hữu cơ tiêu thụ, quy trình xử lý nhanh gọn, thao tác đơn giản, phù hợp với trang thiết bị tại các phòng kiểm nghiệm trong nước.
  • Độ thu hồi và độ nhạy vượt trội: Trong khi một số nghiên cứu trước dùng SPE có độ thu hồi dao động rất rộng hoặc thấp (từ 36% đến 95%), phương pháp này đạt độ thu hồi ổn định 82,4% – 110% cho cả 4 hoạt chất ở mức nồng độ vết.
  • Đóng góp ứng dụng thực tế: Phương pháp đã được áp dụng trực tiếp tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, bổ sung cơ sở khoa học phục vụ quản lý nhà nước về dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm.

Đề xuất và kiến nghị của tác giả

  • Về mặt chính sách quản lý: Tác giả kiến nghị cơ quan quản lý (Bộ Y tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) cần sớm bổ sung các hoạt chất nhóm NSAIDs vào danh mục giám sát dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm theo Thông tư 24/2013/TT-BYT, đồng thời xem xét quy định ngưỡng MRLs đối với tolfenamic acid trên thịt gia cầm (thịt gà).
  • Về quản lý sử dụng thuốc thú y: Các cơ sở kinh doanh và người chăn nuôi cần được tuyên truyền, giám sát chặt chẽ về liều lượng, tần suất và thời gian ngừng thuốc bắt buộc trước khi giết mổ gia súc, gia cầm nhằm ngăn chặn tồn dư dược chất đi vào chuỗi thức ăn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong khuôn khổ đề tài tốt nghiệp Dược sĩ với một số giới hạn được tác giả ghi nhận:

  • Số lượng hoạt chất nghiên cứu: Phương pháp mới chỉ tập trung xây dựng và thẩm định trên 4 hoạt chất NSAIDs điển hình (diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid), chưa bao quát các thuốc kháng viêm khác thường dùng trong thú y như aspirin, ibuprofen, indomethacin, ketoprofen.
  • Phạm vi nền mẫu: Nghiên cứu mới dừng lại ở mô cơ thịt động vật (thịt lợn, thịt bò, thịt gà), chưa mở rộng sang các mô phủ tạng (gan, thận—nơi tích lũy chuyển hóa chính của thuốc) cũng như các sản phẩm nguồn gốc động vật khác như trứng, sữa, hoặc thực phẩm chế biến.
  • Quy mô khảo sát mẫu thực tế: Cỡ mẫu khảo sát thực tế còn hạn chế (15 mẫu thu thập ngẫu nhiên tại thị trường Hà Nội), mang tính chất thăm dò ban đầu nhằm đánh giá tính ứng dụng của phương pháp chứ chưa mang tính thống kê dịch tễ đại diện cho toàn quốc.

Từ các hạn chế trên, hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất bao gồm:

  1. Tiếp tục tối ưu hóa và thẩm định mở rộng phương pháp để phân tích đa dư lượng đồng thời thêm nhiều dẫn xuất NSAIDs khác.
  2. Thử nghiệm áp dụng quy trình trên các ma trận nền mẫu sinh học phức tạp hơn như sữa, trứng, gan và thận động vật.
  3. Mở rộng điều tra, giám sát dư lượng trên số lượng mẫu lớn hơn tại nhiều tỉnh thành để cung cấp dữ liệu dịch tễ an toàn thực phẩm hoàn chỉnh.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho các nhóm đối tượng:

  • Sinh viên và học viên cao học ngành Dược học, Hóa kiểm nghiệm, Độc chất học, Công nghệ Thực phẩm: Là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình xây dựng phương pháp phân tích vết trên thiết bị khối phổ hai lần (LC-MS/MS), từ khâu chọn ion MRM, tối ưu hóa năng lượng va chạm đến kỹ thuật tối ưu hóa từng bước xử lý mẫu QuEChERS có enzym hóa.
  • Kiểm nghiệm viên tại các phòng thí nghiệm kiểm tra an toàn thực phẩm: Quy trình xử lý mẫu chi tiết (tỷ lệ đệm, hoạt độ enzym, loại muối phân tán, chất hấp phụ C18) và các thông số thiết bị MS/MS có thể áp dụng hoặc chuyển giao trực tiếp vào thực tế công tác kiểm nghiệm dư lượng thuốc thú y mà không cần đầu tư các cột SPE đắt tiền.
  • Người nghiên cứu thực hiện thẩm định phương pháp: Chương thực nghiệm là mẫu báo cáo chuẩn mực về thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn quốc tế AOAC (Appendix F: 2016) và Quy định Ủy ban châu Âu (EU) 2021/808, đặc biệt là cách tính số điểm nhận dạng (IP), đánh giá tỷ lệ ion con và tính toán độ tái lặp theo chuẩn Horwitz.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao quy trình tiền xử lý mẫu thịt cần bổ sung bước thủy phân bằng enzym $\beta$-glucuronidase?

Trong cơ thể động vật, các thuốc nhóm NSAIDs sau khi hấp thu được chuyển hóa qua gan và một phần lớn liên hợp với acid glucuronic tạo thành dẫn xuất glucuronid phân cực. Nếu chỉ chiết xuất trực tiếp bằng dung môi hữu cơ thông thường, các dạng liên hợp này sẽ không được thu hồi trọn vẹn, dẫn đến đánh giá sai lệch (thấp hơn thực tế) hàm lượng tồn dư. Thủy phân mẫu bằng enzym $\beta$-glucuronidase (50 IU) trong đệm acetat pH 4,5 ở 37°C giúp cắt đứt liên kết liên hợp, giải phóng NSAIDs về dạng tự do. Thực nghiệm chứng minh bước này làm tăng diện tích pic tín hiệu lên 12% đối với meloxicam và 55% đối với diclofenac.

2. Cột sắc ký và điều kiện pha động nào được tác giả lựa chọn sau khi khảo sát thực nghiệm?

Sau khi khảo sát so sánh 3 hệ dung môi và 3 loại cột phân tích sắc ký pha đảo, tác giả lựa chọn:

  • Cột sắc ký: Symmetry C18 ($150\text{ mm} \times 4,6\text{ mm} \times 5,0\text{ µm}$). Cột này cho pic sắc ký cân đối, sắc nét, không bị tù pic như cột XBridge BEH C18 ($100\text{ mm} \times 4,6\text{ mm} \times 2,5\text{ µm}$) và không xuất hiện hiện tượng chẻ pic như cột Symmetry C18 ($150\text{ mm} \times 2,1\text{ mm} \times 3,5\text{ µm}$).
  • Pha động: Kênh A là acid formic 0,1% trong nước, kênh B là acetonitril nguyên chất; rửa giải theo chương trình gradient nồng độ trong 8 phút với tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL.

3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của 4 chất phân tích đạt mức nào?

Phương pháp có độ nhạy rất cao, đáp ứng phát hiện ở cấp độ vết (ppb hay µg/kg), thấp hơn nhiều so với ngưỡng MRLs của Liên minh châu Âu:

  • Diclofenac: $\text{LOD} = 1,0\text{ µg/kg}$; $\text{LOQ} = 4,0\text{ µg/kg}$ (ngưỡng MRL của EU là 5 µg/kg).
  • Flunixin: $\text{LOD} = 0,04\text{ µg/kg}$; $\text{LOQ} = 0,1\text{ µg/kg}$ (ngưỡng MRL của EU là 20–50 µg/kg).
  • Meloxicam: $\text{LOD} = 0,4\text{ µg/kg}$; $\text{LOQ} = 1,0\text{ µg/kg}$ (ngưỡng MRL của EU là 20 µg/kg).
  • Tolfenamic acid: $\text{LOD} = 0,4\text{ µg/kg}$; $\text{LOQ} = 1,0\text{ µg/kg}$ (ngưỡng MRL của EU là 50 µg/kg).

4. Kết quả khảo sát 15 mẫu thịt thương phẩm tại Hà Nội cho thấy thực trạng tồn dư NSAIDs ra sao?

Trong 15 mẫu thịt khảo sát (thịt bò, lợn, gà):

  • Không phát hiện diclofenac và flunixin trong bất kỳ mẫu nào.
  • 2 mẫu (1 gà, 1 bò) có tín hiệu meloxicam ở dạng vết dưới giới hạn định lượng ($< 1,0\text{ µg/kg}$).
  • 7 mẫu phát hiện tolfenamic acid với hàm lượng trên LOQ (chiếm 46,7% tổng số mẫu), gồm 4 mẫu thịt gà ($7,83$ – $11,6\text{ µg/kg}$) và 3 mẫu thịt lợn ($5,21$ – $15,9\text{ µg/kg}$). Tất cả các mẫu thịt lợn nhiễm tolfenamic acid đều nằm trong giới hạn cho phép của EU (dưới 50 µg/kg). Tuy nhiên, thịt gà hiện chưa có quy định MRLs đối với hoạt chất này.

5. Phương pháp phân tích đạt bao nhiêu điểm nhận dạng (IP) theo tiêu chuẩn châu Âu?

Theo Quy định Ủy ban châu Âu (Commission Implementing Regulation EU 2021/808), phương pháp đạt tổng cộng 5 điểm nhận dạng (IP) cho mỗi hoạt chất:

  • 1,0 điểm cho kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS).
  • 1,0 điểm cho việc xác định ion mẹ phân tử.
  • 3,0 điểm cho việc xác định 2 mảnh ion con đặc trưng ($1,5\text{ điểm} \times 2\text{ ion con}$). Mức 5 điểm IP này vượt tiêu chuẩn tối thiểu quy định cho việc định danh và khẳng định các chất cấm hoặc chất bị kiểm soát trên hệ thống khối phổ.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Trần Vũ Đức đã xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời 4 hoạt chất NSAIDs trong mẫu thịt động vật bằng kỹ thuật LC-MS/MS kết hợp chiết QuEChERS có thủy phân enzym $\beta$-glucuronidase. Phương pháp được thẩm định đầy đủ và đáp ứng các tiêu chuẩn kỹ thuật quốc tế của AOAC 2016 và EU 2021/808 về độ nhạy, tính chọn lọc, độ thu hồi và độ lặp lại ở nồng độ vết. Kết quả thử nghiệm trên 15 mẫu thịt thương phẩm tại Hà Nội đã chứng minh tính khả thi của quy trình, đồng thời cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng cảnh báo tình trạng tồn dư tolfenamic acid trên gia súc, gia cầm nhằm phục vụ công tác xây dựng quy chuẩn an toàn thực phẩm tại Việt Nam.