ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc giảm đau, chống viêm không steroid (NSAIDs) là nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi cho người cũng như trong thú y. Chúng có tác dụng giảm đau, chống viêm và hạ sốt [16]. Do có hiệu quả tốt trong chăn nuôi nên nhóm thuốc này thường hay bị lạm dụng và sử dụng bừa bãi từ đó có thể gây ra dư lượng thuốc ở trong thực phẩm. Đây là một vấn đề vô cùng quan trọng về an toàn thực phẩm nếu những thực phẩm chứa dư lượng thuốc đi vào chuỗi thức ăn.
Nồng độ dư lượng thuốc đo được trong thực phẩm có thể làm tăng mức độ phơi nhiễm của con người trong phạm vi microgam mỗi ngày, thấp hơn ít nhất ba đến bốn bậc so với mức cần thiết để tạo ra tác dụng dược lý. Do đó, rủi ro phát sinh từ phơi nhiễm cấp tính có thể được coi là khó xảy ra. Tuy nhiên, chúng thường có khả năng phân hủy sinh học thấp, có thể tích lũy đạt tới lượng có thể phát hiện được và gây ra độc tính với cơ thể người như: tổn thương hệ thống tiêu hóa, tổn thương thận, độc tính với gan… Vì lý do này, việc giám sát dư lượng các thuốc nhóm NSAIDs trong thực phẩm có nguồn gốc động vật là một nhiệm vụ quan trọng. Năm 2010, Liên minh châu Âu (EU) đã quy định mức giới hạn tối đa (MRLs) trong thực phẩm của một số thuốc nhóm NSAIDs.
Các quốc gia phát triển khác như Nhật, Mỹ, Trung Quốc cũng đã đưa nhóm thuốc NSAIDs vào chương trình giám sát dư lượng trong thực phẩm [11]. Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm NSAIDs trong trong thịt lợn, thịt bò, sữa và thực phẩm bảo vệ sức khỏe như sắc ký khí khối phổ GC-MS [8], quang phổ tử ngoại tỷ đối [3] và sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS [13], [14], [17], [19]. Các nghiên cứu đã công bố chủ yếu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS do có thể phân tích đồng thời được nhiều chất với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian phân tích ngắn. Hiện nay, Việt Nam chưa có quy định về mức giới hạn tối đa của nhóm NSAIDs trong thực phẩm [1] cũng như chưa có phương pháp phân tích đồng thời các chất này.
Do đó, đề tài “Xây dựng phương pháp xác định tồn dư NSAIDs trong mẫu thịt bằng LC-MS/MS” được thực hiện với các mục tiêu: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs (diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid) trong thịt động vật sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số thuốc nhóm NSAIDs trong thịt động vật. Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu 1.
Giới thiệu chung Nhóm NSAIDs được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học. Trong đó các NSAIDs phổ biến là dẫn xuất chính của acid salicylic, acid acetic, acid enolic, acid anthranilic hoặc acid propionic [18]. Một số NSAIDs điển hình thường sử dụng cho động vật chăn nuôi bao gồm: diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid… 1. Diclofenac - Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2 (M = 296,2) [24].
- Tên khoa học: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid [24]. - Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy xác định (283oC - 285oC). Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 4,5 cho nên diclofenac rất ít tan trong nước, dễ tan trong methanol [24]. - Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 4,0) [24].
Dạng dược dụng thường được sử dụng là diclofenac natri. Flunixin - Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: C14H11F3N2O2 (M = 296,2) [22]. - Tên khoa học: 2-[2-methyl-3-(trifluoromethyl)anilino]pyridin-3-carboxylic acid [22]. - Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy xác định (226oC - 228oC).
Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 4,1 cho nên flunixin rất ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi kém phân cực [22]. 2 - Tính chất hóa học: Tính acid yếu. Dạng dược dụng thường được sử dụng là dạng muối kết hợp với meglumin. Meloxicam - Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: C14H13N3O4S2 (M = 351,4) [21].
- Tên khoa học: 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2- benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxid [21]. - Tính chất vật lý: Bột màu vàng nhạt, đa hình, nhiệt độ nóng chảy xác định (254oC - 256oC) [21]. Thực tế không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, rất khó tan trong ethanol 96% [2]. - Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 4,1) [21].
Tolfenamic acid - Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: C14H12ClNO2 (M = 261,7) [20]. - Tên khoa học: 2-[(3-chloro-2-methylphenyl)amino]benzoic acid [20]. - Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh, nhiệt độ nóng chảy xác định (207oC - 207,5oC). Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 5,2 cho nên tolfenamic acid rất ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi kém phân cực [20].
- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 5,1) [20]. Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs Các thuốc NSAIDs phổ biến với nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng bao gồm: nhiễm độc đường tiêu hóa, nguy cơ tim mạch, tổn thương chức năng gan, thận và các rối loạn nhỏ khác [7]. Một sơ đồ tóm tắt các độc tính của nhóm NSAIDs trên cơ thể con người được trình bày ở Hình 1. Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs 1.
Tác động lên hệ tiêu hóa Gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, khó tiêu, ợ nóng, buồn nôn. Khi phơi nhiễm NSAIDs kéo dài và đặc biệt ở liều cao, con người có thể bị viêm loét và xuất huyết dạ dày. Những người có sẵn bệnh viêm đường tiêu hóa hoặc người lớn trên 65 tuổi là các đối tượng có nguy cơ cao gặp phải độc tính này [23]. Tác động lên hệ tim mạch Làm tăng huyết áp và gây bất lợi cho việc kiểm soát huyết áp bằng thuốc.
Các NSAIDs cũng làm tăng nguy cơ xuất hiện cơn đau tim ở người có bệnh tim mạch (bệnh động mạch vành) hoặc có nguy cơ cao mắc bệnh tim mạch [23]. Tác động lên chức năng gan - thận NSAIDs gây hại đến thận đặc biệt ở những người đã có bệnh nền ở thận. Độc tính trên gan của NSAIDs cũng cần phải lưu ý khi phơi nhiễm ở liều cao hoặc trong thời gian dài [23]. Tác động lên hệ hô hấp Các NSAIDs gây kích ứng làm tăng nặng bệnh hen suyễn và gây ra các phản ứng dị ứng [23].
Quy định hiện hành về giới hạn hàm lượng NSAIDs trong thực phẩm Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định giới hạn hàm lượng các thuốc NSAIDs trong thực phẩm. Ngày 14/08/2013, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Thông tư số 24/2013/TT-BYT ngày 14 tháng 8 năm 2013 quy định mức giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm nhưng chưa có nhóm thuốc NSAIDs trong danh mục [1]. Trên thế giới, Ủy ban châu Âu đã có quy định về giới hạn tồn dư các thuốc trong thực phẩm (MRLs) trong đó có các thuốc thuộc nhóm NSAIDs [10]. Các mức MRLs của DIC, FLU, MEL, TOL do EU quy định Chất phân tích Các loài động vật MRL Mẫu Bò 5 µg/kg Thịt Diclofenac (DIC) Lợn 5 µg/kg Thịt Bò 20 µg/kg Thịt Flunixin (FLU) Lợn 50 µg/kg Thịt Ngựa 10 µg/kg Thịt Trâu, bò, lợn, thỏ, Meloxicam (MEL) 20 µg/kg Thịt ngựa Tolfenamic acid Bò, lợn 50 µg/kg Thịt (TOL) 1.
Tổng quan về phương pháp phân tích 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam Do chưa ban hành quy định giới hạn hàm lượng các thuốc NSAIDs trong thực phẩm [1] nên hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam xây dựng phương pháp xác định nhóm NSAIDs trong thịt. Dưới đây là một số nghiên cứu trên thế giới đã xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng các thuốc thuộc nhóm NSAIDs trong thịt bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các nghiên cứu đã được thực hiện để xác định nhóm NSAIDs trong thịt Tài S Đối tượng Phương pháp xử lý Phương pháp phân Kết quả liệu T phân tích và mẫu tích phân tích tham T nền mẫu khảo 21 thuốc Thủy phân bằng LC-MS/MS.
Khoảng nhóm enzym: (đệm acetat Pha tĩnh: Cột Luna tuyến tính: NSAIDs pH 4,5; enzym β- C8 được kết nối 0,25; 0,5; trong thịt và glucosidase; nhiệt với tiền cột 1,0; 2,0; sữa động độ 37oC). Chiết xuất bằng (2,0 × 4 mm, CCα: 5,56 1 acetonitril; làm sạch USA). - 57,1 [17] bằng bột hấp phụ Pha động: µg/kg. methanol/acetonotr CCβ: 4,48 Dịch chiết được bay -il (kênh A) và - 790 hơi và hoàn nguyên amoni format 0,01 µg/kg.
Dư lượng Chiết xuất bằng LC-MS/MS. Khoảng metamizol acetonitril và đệm Pha tĩnh: Cột C8 (3 tuyến tính: và các dạng acetat 0,33 M (pH µm, 2,1 × 150 mm, không chuyển hóa 5,0). Phenomenex, công bố. của Chiết SPE bằng cột Torrance, CA, CCα: 12,6 metamizol SepPak Alumina N.
USA) kết nối với - 113 trong thịt Sau đó phần nổi tiền cột Luna C8 µg/kg. được trộn với pha (2,0 × 4 mm). CCβ: 15,8 động và được phân Pha động: - 139 tích bằng LC- methanol:acetonitri µg/kg. -l (8:2) (kênh A) và Độ thu hồi: amoni format 0,01 từ 45 - M, pH 5,0 (kênh 95%.
16 thuốc Thủy phân bằng LC-MS/MS. Khoảng thuộc nhóm enzym: sử dụng đệm Pha tĩnh: Cột Luna tuyến tính: NSAIDs, acetat; enzym β- C18 (3 μm, 4,6 LOQ - 20 bốn chất glucosidase; nhiệt ×150 mm, USA) LOQ. gắn với tiền cột LOQ: 0,18 metamizol Chiết xuất bằng Phenomenex C18 - 125 và năm loại dung môi acetonitril. 3 [14] corticosteroi Dịch chiết sau đó Pha động: Độ thu hồi: -d) trong thịt được làm lạnh ở methanol:acetonitri 36,1 - động vật.
Dịch chiết được tập acid formic - kênh trung, bay hơi và A) và amoni hoàn nguyên trong format 0,01 M, pH dung môi pha động. Dư lượng Chiết xuất bằng hỗn UHPLC-MS/MS. Khoảng của 30 thuốc hợp acetonitril và Pha tĩnh: Cột tuyến tính: chống viêm acid phosphoric. AcquityTM UPLC LOQ - 100 4 không Dịch chiết được làm BEH C18 (50 µm LOQ.
[11] steroid trong khô bởi khí N2. LOD: 0,4 - thịt lợn. Hoàn nguyên trong Pha động: 2 µg/kg. hỗn hợp methanol acetonitril (kênh A) LOQ: 1 - 5 6 và acid phosphoric.
và dung dịch acid µg/kg. Tiếp theo, chiết SPE formic 0,1% chứa Độ thu hồi: sử dụng cột HLB, 0,5 mmol/L amoni 61,7 - rửa giải bằng hỗn acetat (kênh B). hợp dung môi amoni hydroxit:axetonitril: metyl tert-butyl ete (5:95:1) và bay hơi đến khô. Hoàn nguyên trong hỗn hợp acetonitril và acid formic 0,1%, lọc qua màng và chuyển vào vial.
Acid Chiết bằng LC-MS/MS. Khoảng acetylsalicyl acetonitril, sau đó Pha tĩnh: cột tuyến tính: -ic, flunixin, dịch chiết được làm Alltima HP C18 (5 không phenylbutaz bay hơi đến khô. µm, 150 x 2,1 mm, công bố.