Đặt vấn đề Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của nhiều quốc gia. Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống của nhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội [4]. Theo số liệu thống kê của cục an toàn vệ sinh thực phẩm mỗi năm nước ta có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Riêng tỉnh Thái nguyên, năm 2014 tỷ lệ mắc 4,7/100.000 dân, tháng 4/2014 có 04 vụ ngộ độc thực phẩm.
Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, chiếm tỷ lệ 43,2% [18]. Đặc biệt vi khuẩn Salmonella là thủ phạm gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Theo thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400 công nhân mắc và phải nhập viện. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc.
Theo WHO/ FAO ngộ độc thực phẩm xảy ra ở nhiều nơi ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế. Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra hoá sinh tốn nhiều thời gian 5 đến 7 ngày (ISO 6579: 2003), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác quy trình n 2 phân tích này không cho phép phân biệt các loài hay phân loài Salmonella với nhau.
Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khoẻ, tính mạng con người, gây thiệt hại về kinh tế. Những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các kỹ thuật sinh học phân tử đã cho phép phát triển phương pháp kiểm tra rất nhạy và nhanh sự hiện diện của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy dài [5]. Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán ngắn và không yêu cầu thiết bị phức tạp. Dựa vào viêc sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các đoạn DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phép phát hiện đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh [11].
Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh Salmonella là một đề tài có ý nghĩa thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do Salmonella gây nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, để đánh giá tình trạng nhiễm vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tại các khu chợ xung quanh Thành Phố Thái Nguyên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kĩ thuật sinh học phân tử” 1.Mục đích nghiên cứu Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kỹ thuật PCR.Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong mẫu thịt bằng kỹ thuật PCR. n 3 Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp và S.enterica trong thịt lợn ở khu vực thành phố Thái Nguyên.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 1.Ý nghĩa khoa học Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong thịt lợn. Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tác phong làm việc.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh Salmonella tạp nhiễm trong thịt lợn.
n 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella. Trên thế giới Ngộ độc thực phẩm là mối quan tâm đặc biệt ở mỗi quốc gia và là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Mỗi năm thế giới đã ghi nhận hàng triệu ca bệnh trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong.
Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (lợn, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng và các sản phẩm của trứng [21]. Ở Mỹ theo thống kê của trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh CDC (Centers for Disease Control and Prevention) năm 2007 cả nước Mỹ có 17,883 ca ngộ độc thực phẩm, trong số đó có 38% bệnh nhân nhiễm Salmonella nhưng thực tế chỉ có khoảng 1 - 5% là được thống kê và có khoảng 400 trường hợp tử vong do Salmonella, làm thiệt hại hơn 50 triệu USD nên vi khuẩn này được liệt vào loại gây ngộ độc nguy hiểm nhất tại Mỹ. Trong số ca nhiễm khuẩn Salmonella, phần lớn bệnh nhân bị nhiễm S. Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu và Trung tâm phòng chống kiểm soát bệnh dịch Châu Âu đã thống kê năm 2009 khu vực EU có tổng 108.614 người bị nhiễm Salmonella.
Ở Việt nam Tại Việt Nam trong những năm gần đây tình hình ngộ độc thực phẩm cũng gia tăng trở thành vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng và là mối quan tâm hàng đầu hiện nay của các nhà dịch tễ, vi sinh và lâm sàng trong cả nước. Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33 - 49% và chủ yếu n 5 là Salmonella chiếm 70% các vụ ngộ độc [1]. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn năm 2009 tại Hà Nội trong số 72 mẫu thịt lợn được kiểm tra có 3 mẫu nhiễm Salmonella (chiếm 4,1%) và tại TP Hồ Chí Minh, trong số 69 mẫu thịt lợn được kiểm tra có 4 mẫu nhiễm Salmonella (chiếm 5,8%). Tại Thành phố Hồ Chí Minh, Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) thực hiện kiểm tra 213 mẫu thịt lợn, 213 mẫu thịt gà và 213 mẫu cá biển vào tháng 5/2013 – 4/2014 tại chợ đầu mối Bình Điền, Hóc Môn,Thủ Đức trong đó thịt lợn có 71/213 mẫu kiểm nghiệm phát hiện nhiễm Salmonella (chiếm 30,74%) , thịt gà phát hiện Salmonella trong 105/231 mẫu kiểm nghiệm (chiếm 45,45%) và cá biển 13/ 213 mẫu kiểm nghiệm có nhiễm Salmonella (chiếm 6,103%) [18].
Thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400 công nhân mắc và phải nhập viện. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc. Nhìn chung tỷ lệ nhiễm Salmonella cao, các vụ ngộ độc với quy mô nhiều người mắc thường xảy ra ở các bếp ăn tập thể, các xí nghiệp [18]. Tổng quan về Salmonella 2.
Lịch sử phát hiện Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweninittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là n 6 do một loại virus gây nên và đã xác định S. choleraesui là vi khuẩn gây bệnh thương hàn [13].Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là S. Vi khuẩn này được gọi nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner [2].
Năm 1889 Klein phân lập được S. gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau nên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S. Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.
paratyphi equi và S. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S. paratyphi B và đến năm 1898, S. paratyphi A đã tìm được do N.
Phân loại Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que và có thể di động được [6]. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân loại Salmonella trong đó Kauffmann - White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003 [24]. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng nguyên H và kháng nguyên bề mặt Vi.
Theo phương pháp định danh Kauffmann – White Salmonella được chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo phân loại Kauffmann- White. Số kiểu Loài và phân loài Salmonella Vật chủ huyết thanh S. enterica (I) 1454 Động vật máu nóng S.
salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và môi trường S. arizonae (IIIa) 94 Động vật máu lạnh và môi trường S. diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường S.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường S. indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường S.
bongori 20 Động vật máu lạnh và môi trường Tổng 2463 Samonella enterica phân loài I chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu huyết thanh của Salmonella. Phân loài này gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu nóng, trong đó S. enteritidis là có hai kiểu huyết thanh quan trọng gây bệnh cho người [19, 40]. Thống kê từ 1990 đến 1995, S.
typhimurium chiếm khoảng 70% tổng số Salmonella được phân lập trên toàn thế giới [26]. Đặc điểm hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram âm, có kích thước 0,7 - 1,5 x 2-5µm, sống kị khí tùy nghi, không có nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao, có khoảng 7 đến 12 lông mao xung quanh thân (trừ S. n 8 pullorum gây bệnh cho gia cầm). Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 370 C trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính 2 - 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất [2].