Luận văn thạc sĩ xác định tạp nhiễm salmonella trong thịt lợn tại thành phố thái nguyên bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Phát hiện Salmonella trong thịt lợn tại Thái Nguyên bằng kỹ thuật sinh học phân tử, đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

• Tác giả: Hà Thị Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella. Trên thế giới
• 2.2. Tổng quan về Salmonella
• 2.2.1. Lịch sử phát hiện
• 2.2.2. Phân loại Salmonella
• 2.2.3. Đặc điểm hình thái
• 2.2.4. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
• 2.2.5. Sức đề kháng của vi khuẩn
• 2.2.6. Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực
• 2.2.7. Đặc điểm gây bệnh Salmonella
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian thực hiện nghiên cứu
• 3.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
• 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp thu mẫu
• 3.5.2. So sánh hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn
• 3.5.3. Phản ứng PCR
• 3.5.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn
• 4.2. Sử dụng phối hợp hai cặp mồi invA và spvC trong PCR đa mồi
• 4.3. Kết quả phát hiện Salmonella nhiễm trên thịt lợn tại khu vực Thành Phố Thái Nguyên
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Salmonella

Salmonella là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm trên toàn cầu. Vi khuẩn này thường được tìm thấy trong thịt lợn, gia cầm và các sản phẩm từ trứng. Theo thống kê, Salmonella chiếm khoảng 70% các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật tại Việt Nam. Tại Thái Nguyên, tình hình nhiễm Salmonella trong thịt lợn đang trở thành mối quan tâm lớn, đặc biệt trong bối cảnh an toàn thực phẩm ngày càng được chú trọng. Việc phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của Salmonella trong thực phẩm là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella

Ngộ độc thực phẩm do Salmonella đã trở thành vấn đề nghiêm trọng tại nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Theo số liệu từ Cục An toàn thực phẩm, hàng năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó Salmonella là nguyên nhân chính. Tại Thái Nguyên, tỷ lệ mắc ngộ độc thực phẩm do Salmonella cũng không ngừng gia tăng, với nhiều vụ ngộ độc tập thể xảy ra. Việc phát hiện và kiểm soát Salmonella trong thực phẩm là rất quan trọng để giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

II. Kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện Salmonella

Kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là phản ứng chuỗi polymerase (PCR), đã trở thành công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện Salmonella. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy dài. PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp xác định các chủng vi khuẩn gây bệnh. Việc ứng dụng PCR trong phát hiện Salmonella trong thịt lợn tại Thái Nguyên không chỉ giúp nâng cao hiệu quả kiểm tra an toàn thực phẩm mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2.1. Quy trình phát hiện Salmonella bằng PCR

Quy trình phát hiện Salmonella bằng PCR bao gồm các bước thu mẫu, chiết xuất DNA và thực hiện phản ứng PCR. Việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu giúp khuếch đại các đoạn DNA của Salmonella, từ đó xác định sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu thịt. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thái Nguyên là đáng kể, cho thấy sự cần thiết phải áp dụng kỹ thuật này trong kiểm soát an toàn thực phẩm.

III. Kết quả nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thái Nguyên là cao, điều này đặt ra thách thức lớn cho công tác quản lý an toàn thực phẩm. Việc phát hiện nhanh chóng Salmonella không chỉ giúp ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn mà còn bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Nghiên cứu này cũng góp phần nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm trong cộng đồng, đồng thời khuyến khích việc áp dụng các phương pháp hiện đại trong kiểm tra thực phẩm.

3.1. Ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình trạng nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thái Nguyên mà còn mở ra hướng đi mới trong việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong kiểm soát an toàn thực phẩm. Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để xây dựng các chính sách và biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn, từ đó giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những thách thức y tế công cộng và kinh tế - sinh học hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Theo thống kê của Cục An toàn Thực phẩm (Bộ Y tế), mỗi năm nước ta ghi nhận từ 250 đến 500 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 7.000 nạn nhân và từ 100 đến 200 trường hợp tử vong. Đáng chú ý, các vụ ngộ độc do vi sinh vật chiếm tới 43,2% tổng số vụ, trong đó trực khuẩn đường ruột chi phối phần lớn các ca nghiêm trọng là vi khuẩn Salmonella (chiếm gần 70% các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật). Tại tỉnh Thái Nguyên, năm 2014 tỷ lệ mắc ngộ độc thực phẩm đạt mức 4,7/100.000 dân với nhiều ca nhiễm độc tập thể.

Thịt lợn là nguồn thực phẩm tươi sống thiết yếu trong khẩu phần ăn hàng ngày của người dân Việt Nam, nhưng đồng thời là môi trường thuận lợi cho sự phát triển và lây lan của các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Phương pháp kiểm nghiệm Salmonella truyền thống đang áp dụng rộng rãi (theo tiêu chuẩn ISO 6579:2003 hoặc TCVN) đòi hỏi từ 5 đến 7 ngày với 4 giai đoạn nối tiếp: tiền tăng sinh (Pre-enrichment), tăng sinh chọn lọc (Selective enrichment), phân lập trên môi trường chọn lọc (Isolation) và khẳng định sinh hóa - huyết thanh (Biochemical & Serological confirmation). Quy trình này tốn nhiều công sức, chi phí hóa chất cao, không đáp ứng được yêu cầu giám sát nhanh chuỗi cung ứng thực phẩm tươi sống tiêu thụ trong ngày và khó phân định nhanh các chủng mang plasmid độc lực cao.

                  THÁCH THỨC VÀ MỤC TIÊU DỰ ÁN

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Khảo sát và chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA nhanh: So sánh quy trình tách chiết DNA bằng hóa chất (CTAB/CIAA) kéo dài 3 ngày với quy trình phá vỡ màng tế bào bằng sốc nhiệt vật lý rút ngắn toàn bộ thời gian xét nghiệm xuống còn 12 giờ.
2. Thiết lập phản ứng PCR đa mồi (Multiplex PCR): Phối hợp đồng thời hai cặp mồi đặc hiệu invA (nhận diện chi Salmonella spp.) và spvC (nhận diện plasmid độc lực của Salmonella enterica serovar Typhimurium và Enteritidis) trong cùng một phản ứng nhiệt.
3. Đánh giá thực trạng tạp nhiễm trên địa bàn thực tế: Khảo sát 60 mẫu thịt lợn tại 3 chợ đầu mối/dân sinh lớn thuộc Thành phố Thái Nguyên (Chợ Sư phạm, Chợ Túc Duyên, Chợ Trung tâm) theo cả hai khung thời gian buôn bán: chợ sáng (thịt mới mổ) và chợ chiều (thịt lưu thông tự nhiên không bảo quản lạnh).

Phạm vi và giới hạn

• Đối tượng: Mẫu thịt lợn tươi sống thu nhận trực tiếp từ quầy bán thịt theo tiêu chuẩn TCVN 4833-1:2002 và TCVN 4833-2:2002.
• Phạm vi kỹ thuật: Nghiên cứu thực nghiệm tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử và Công nghệ Gen – Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
• Chỉ tiêu kiểm soát: Phát hiện gen xâm nhiễm invA và gen độc lực spvC của vi khuẩn Salmonella.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Để kiểm soát vi khuẩn Salmonella trong chuỗi cung ứng thực phẩm, nhiều giải pháp xét nghiệm đã được ứng dụng trong phòng thí nghiệm và thực địa. Dưới đây là bảng so sánh phân tích ưu - nhược điểm của các phương pháp hiện hành:

Phương pháp	Thời gian thực hiện	Độ nhạy & Độ đặc hiệu	Chi phí & Thiết bị	Khả năng định danh phân loài / độc lực
Nuôi cấy truyền thống (ISO 6579:2003)	5 – 7 ngày	Độ nhạy cao, độ đặc hiệu phụ thuộc phản ứng sinh hóa	Chi phí hóa chất trung bình, thiết bị đơn giản	Thấp (phải làm thêm ngưng kết kháng huyết thanh đa giá)
Thử nghiệm miễn dịch ELISA	24 – 48 giờ	Nhạy cao (0.1 ng/mL), dễ dương tính giả	Chi phí đĩa kit cao, cần máy đọc quang phổ	Trung bình (dựa trên kháng nguyên H hoặc O)
Phân tích Phage Typing	24 – 48 giờ	Trung bình, phụ thuộc dải mẫu thực địa	Thấp, yêu cầu chủng chuẩn lưu trữ nghiêm ngặt	Tốt cho truy vết dịch tễ nhưng quy trình phức tạp
Kỹ thuật RAPD-PCR	24 – 48 giờ	Nhạy nhưng độ lặp lại không cao do mồi ngẫu nhiên	Trung bình, máy PCR thường	Phân tích đa hình di truyền, khó chuẩn hóa test nhanh
Single-plex PCR (invA đơn lẻ)	12 – 24 giờ	Rất cao (>98%)	Trung bình, máy PCR và bộ điện di	Chỉ xác định Salmonella spp., không định danh được chủng độc lực
Multiplex PCR đề xuất (invA + spvC)	12 giờ	Rất cao (100% đặc hiệu phân tử)	Tối ưu hóa chi phí phản ứng đơn, thiết bị chuẩn BSL-2	Đồng thời xác định Salmonella spp. và chủng mang plasmid độc tính S. enterica

                       MA TRẬN YÊU CẦU HỆ THỐNG (MoSCoW)

---

Thiết kế hệ thống kỹ thuật

Quy trình phát hiện tạp nhiễm Salmonella bằng Multiplex PCR được thiết kế thành một chuỗi quy trình khép kín, từ khâu xử lý mẫu, ly giải giải phóng vật liệu di truyền đến chu kỳ luân nhiệt khuếch đại và phân tích điện di:

                            SƠ ĐỒ QUY TRÌNH KỸ THUẬT

Bảng thông số thiết kế cặp mồi đặc hiệu

Các cặp mồi được thiết kế nhắm vào các vùng trình tự gen có tính bảo tồn cao, đảm bảo không bắt cặp chéo hoặc hình thành primer-dimer:

Tên mồi	Bản chất & Chức năng	Trình tự Nucleotide (5' $\rightarrow$ 3')	Nhiệt độ nóng chảy ($T_m$)	Kích thước đoạn khuếch đại (Amplicon)
invA-F	Gen xâm nhập tế bào biểu mô ruột (Invasion gene A) - Chỉ thị chi Salmonella	5'-TTGTTACGGCTATTTTGACCA-3'	54°C	521 bp
invA-R	5'-CTGACTGCTACCTTGCTGATG-3'	54°C
spvC-F	Gen độc lực trên plasmid (Salmonella plasmid virulence C) - Chỉ thị độc tính	5'-TCCCTCCTTTGAATATTGTAGCTG-3'	60°C	400 bp
spvC-R	5'-GGGCTTGTTGAACGACCTTC-3'	60°C

---

Phương pháp nghiên cứu và Thiết bị sử dụng

• Hóa chất & Sinh phẩm chuẩn:
  • 2X PCR Master Mix (Thermo Scientific, Mỹ) chứa Taq DNA Polymerase, dNTPs ($0.4\text{ mM mỗi loại}$), $\text{MgCl}_2$ ($4\text{ mM}$) và đệm phản ứng tối ưu.
  • Thang chuẩn DNA: GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific).
  • Agarose sinh học phân tử (Sigma-Aldrich), đệm TAE 1X ($\text{Tris-Base}$, $\text{Acid Acetic}$, $\text{EDTA } 0.5\text{ M}$, $\text{pH } 8.0$), Ethidium Bromide ($5\text{ mg/mL}$).
  • Môi trường nuôi cấy: Buffered Peptone Water (BPW), Luria-Bertani (LB) broth.
• Trang thiết bị chuyên dụng:
  • Máy nhân gen PCR (GeneAmp Thermal Cycler).
  • Tủ an toàn sinh học cấp II Nu-425-400E (NuAire - USA).
  • Bộ điện di ngang Scie-Plas Ltd (UK) kết hợp máy soi chụp gel tự động Gel Logic 1500 (Kodak - USA).
  • Máy ly tâm lạnh tốc độ cao Eppendorf 5418R (Đức), máy lắc ổn nhiệt Jeiotech S3000 (Hàn Quốc), cân phân tích Sartorius TE 214S (Đức).

                      MA TRẬN QUẢN TRỊ RỦI RO THỰC NGHIỆM

---

Implementation và kết quả

Quy trình công nghệ và Thiết lập phản ứng

Phản ứng Multiplex PCR được tối ưu hóa trong thể tích tổng $25\text{ }\mu\text{L}$. Thành phần hóa chất được nạp theo trật tự nghiêm ngặt trong môi trường vô trùng:

# Cấu trúc thành phần phản ứng Multiplex PCR (Master Mix Calculation)
multiplex_pcr_mix = {
    "2X PCR Master Mix (Thermo Scientific)": "12.5 uL",
    "Primer invA (F + R, 10 uM)": "2.0 uL",
    "Primer spvC (F + R, 10 uM)": "2.0 uL",
    "Template DNA (Dịch ly giải sau sốc nhiệt)": "2.0 uL",
    "Nước khử ion siêu sạch (Nuclease-free dH2O)": "6.5 uL",
    "Total Volume": "25.0 uL"
}

Chu trình nhiệt tối ưu hóa cho phản ứng PCR đa mồi:

Phản ứng được lập trình trên máy luân nhiệt theo chu kỳ 3 bước cải tiến:

1. Biến tính ban đầu: $94^\circ\text{C}$ trong $5\text{ phút}$ (đảm bảo tháo xoắn hoàn toàn bộ gen vi khuẩn).
2. Chu kỳ khuếch đại (30 chu kỳ):
   • Biến tính tách mạch: $94^\circ\text{C}$ trong $45\text{ giây}$.
   • Gắn mồi đặc hiệu (Annealing): $56^\circ\text{C}$ trong $45\text{ giây}$ (điểm cân bằng nhiệt động học giữa $T_m$ của invA và spvC).
   • Kéo dài chuỗi (Extension): $72^\circ\text{C}$ trong $45\text{ giây}$ (vận tốc tổng hợp của Taq Polymerase $\sim 1000\text{ bp/phút}$).
3. Kéo dài hoàn tất: $72^\circ\text{C}$ trong $7\text{ phút}$.
4. Bảo quản sau phản ứng: Giữ ổn định ở $4^\circ\text{C}$.

                 BIỂU ĐỒ CHU KỲ NHIỆT MULTIPLEX PCR
 Temp (°C)
        [Biến tính đầu]   [Lặp 30 Chu kỳ]    [Kéo dài cuối]

---

Kiểm chứng và Xác thực thực nghiệm

1. Thử nghiệm so sánh quy trình tách chiết (Quy trình 1 vs Quy trình 2)

Thực nghiệm so sánh song song 2 phương pháp trên mẫu thịt lợn thực tế có gây nhiễm chủ động vi khuẩn Salmonella spp. và S. enteritidis:

• Quy trình 1 (K. Nagappa et al., 2007): Tăng sinh qua 2 bước (BPW $18\text{h}$ + LB $14\text{h}$) $\rightarrow$ Tách chiết bằng CTAB/CIAA/Isopropanol. Thời gian thực hiện: 3 ngày.
• Quy trình 2 (Omar B. Ahmed et al., 2014 cải tiến): Tiền tăng sinh BPW $6\text{h}$ $\rightarrow$ Ly tâm thu cặn và sốc nhiệt phá vách ($100^\circ\text{C} / -20^\circ\text{C}$) trong $35\text{ phút}$. Thời gian thực hiện: 12 giờ.

Kết quả điện di kiểm chứng: Cả hai quy trình đều cho tín hiệu băng huỳnh quang đồng nhất, sắc nét tại vị trí $521\text{ bp}$ (invA) đối với Salmonella spp. và $400\text{ bp}$ (spvC) đối với S. enteritidis. Quy trình 2 đạt độ nhạy tương đương nhưng giảm thời gian đến $83.3%$ và loại bỏ hoàn toàn việc phát thải hóa chất hữu cơ độc hại.

2. Kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng Multiplex PCR

Kiểm tra chéo trên các chủng vi khuẩn chuẩn đối chứng:

• Làn -: Đối chứng âm (Nuclease-free $\text{H}_2\text{O}$) $\rightarrow$ Không xuất hiện băng.
• Làn 1 - 2: Chủng chuẩn Salmonella spp. $\rightarrow$ Xuất hiện duy nhất 1 băng $521\text{ bp}$ (invA).
• Làn 3: Salmonella typhimurium $\rightarrow$ Xuất hiện cả 2 băng $521\text{ bp}$ và $400\text{ bp}$.
• Làn 4: Salmonella enteritidis $\rightarrow$ Xuất hiện cả 2 băng $521\text{ bp}$ và $400\text{ bp}$.
• Làn 5 - 6: Vi khuẩn gram âm đường ruột Escherichia coli $\rightarrow$ Hoàn toàn âm tính (không có băng).
• Làn 7 - 8: Vi khuẩn gram dương hoại sinh Bacillus subtilis $\rightarrow$ Hoàn toàn âm tính.

                      BẢN ĐỒ BĂNG ĐIỆN DI MULTIPLEX PCR
      Thang DNA      (-)   Sal. spp   S.typhi  S.enter   E.coli   Bacillus
      (GeneRuler)    NTC    (invA)     (spvC)   (spvC)    Ctrl      Ctrl

---

Kết quả khảo sát thực địa trên địa bàn TP. Thái Nguyên

Phân tích 60 mẫu thịt lợn tươi thu nhận ngẫu nhiên tại 3 chợ trọng điểm theo hai ca thu mẫu sáng/chiều mang lại kết quả dịch tễ học phân tử quan trọng:

Địa điểm lấy mẫu	Ca lấy mẫu	Tổng số mẫu kiểm tra	Số mẫu dương tính Salmonella spp. (invA+)	Số mẫu dương tính S. enterica độc lực (spvC+)	Tỷ lệ nhiễm chung (%)
Chợ Sư Phạm	Sáng (06h - 08h)	10	1	0	10.0%
	Chiều (15h - 17h)	10	2	1	30.0%
Chợ Túc Duyên	Sáng (06h - 08h)	10	1	0	10.0%
	Chiều (15h - 17h)	10	3	1	40.0%
Chợ Trung Tâm	Sáng (06h - 08h)	10	1	0	10.0%
	Chiều (15h - 17h)	10	2	0	20.0%
TỔNG HỢP	Ca Sáng	30	3 (10.0%)	0 (0.0%)	10.0%
	Ca Chiều	30	7 (23.33%)	2 (6.67%)	30.0%
	Toàn địa bàn	60	10 (16.67%)	2 (3.33%)	20.0% (12/60)

               BIỂU ĐỒ TỶ LỆ TẠP NHIỄM SALMONELLA THEO THỜI GIAN
   Tỷ lệ nhiễm (%)
            Chợ Sư Phạm        Chợ Túc Duyên   Chợ Trung Tâm

Phân tích tương quan dịch tễ học:

• Tỷ lệ nhiễm chung trên địa bàn đạt 20.0% (12/60 mẫu), vượt ngưỡng cho phép theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm Việt Nam (TCVN 7064:2002 quy định giới hạn Salmonella trong thịt tươi sống là $0\text{ CFU/25g}$).
• Tỷ lệ nhiễm mẫu buổi chiều (30.0%) cao gấp 3 lần so với mẫu buổi sáng (10.0%). Sự gia tăng này là hệ quả trực tiếp của việc bảo quản thịt ở nhiệt độ môi trường tự nhiên ($28^\circ\text{C} - 35^\circ\text{C}$), tạo điều kiện cho vi khuẩn nhân lên nhanh chóng theo cấp số nhân, kết hợp tình trạng lây nhiễm chéo qua thớt, dao và tay người bán sau nhiều giờ tiếp xúc.
• Phát hiện 2 mẫu chứa chủng Salmonella enterica mang gen plasmid độc lực spvC (chiếm $3.33%$ tổng số mẫu và $16.67%$ tổng số mẫu nhiễm). Đây là các chủng có khả năng xâm lấn mô sâu, gây nhiễm trùng huyết và sốt thương hàn nghiêm trọng ở người.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Đổi mới công nghệ tách chiết mẫu: Thay thế hoàn toàn quy trình tách chiết hóa học cổ điển (sử dụng CTAB, Phenol, Chloroform độc hại kéo dài 48 - 72 giờ) bằng phương pháp kết hợp tiền tăng sinh ngắn ($6\text{h}$) và sốc nhiệt phân tử ($100^\circ\text{C} / -20^\circ\text{C}$ trong $35\text{ phút}$). Độ tinh sạch của dịch nổi sau ly tâm đáp ứng hoàn hảo cho phản ứng khuếch đại mà không bị ức chế Taq Polymerase.
2. Khuếch đại đa mục tiêu (Multiplexing): Thiết lập thành công tỷ lệ nồng độ mồi invA : spvC ($1:1$, $10\text{ }\mu\text{M}$) và nhiệt độ bắt cặp mồi ($56^\circ\text{C}$) trong cùng một tube phản ứng $25\text{ }\mu\text{L}$. Điều này giúp phân biệt ngay lập tức giữa Salmonella thông thường và các chủng vi khuẩn mang độc tính cao trong một lần chạy điện di.
3. Hiệu quả kinh tế - kỹ thuật vượt trội:
   • Rút ngắn thời gian xét nghiệm: Giảm từ $120 - 168\text{ giờ}$ (phương pháp nuôi cấy ISO 6579) xuống còn đúng 12 giờ (giảm hơn $90%$ tổng thời gian chờ).
   • Tiết kiệm chi phí vận hành: Giảm $50%$ lượng hóa chất tiêu hao và công lao động so với phương pháp Single-plex PCR kép hoặc kit thương mại nhập ngoại.
4. Cung cấp dữ liệu cảnh báo an toàn thực phẩm: Đưa ra cơ sở dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về thực trạng tạp nhiễm Salmonella đa mồi trên thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên, đóng góp luận cứ khoa học thực tiễn cho cơ quan thanh tra thú y và y tế dự phòng.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng trong chuỗi giá trị thịt tươi sống

                         ỨNG DỤNG TRONG THỰC TẾ

Yêu cầu cấu hình và Chi phí triển khai trạm kiểm nghiệm nhanh

                    CẤU HÌNH TRẠM KIỂM NGHIỆM MOLECULAR LAB

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Phân biệt sống/chết (Viability): Kỹ thuật PCR thông thường phát hiện vật liệu di truyền DNA nên có thể khuếch đại cả DNA từ các tế bào vi khuẩn đã chết sau quá trình xử lý nhiệt nhẹ, tiềm ẩn nguy cơ xuất hiện kết quả dương tính giả về mặt an toàn vi sinh sống.
• Giới hạn số lượng cặp mồi: Phản ứng mới chỉ dừng lại ở việc kết hợp 2 cặp mồi (invA và spvC), chưa bao quát hết các serovar đặc hữu khác như S. Choleraesuis hoặc các gen kháng kháng sinh (ARG - Antimicrobial Resistance Genes).

Định hướng mở rộng nghiên cứu

1. Nâng cấp lên Real-Time Multiplex qPCR / Digital PCR: Tích hợp các mẫu dò TaqMan huỳnh quang đặc hiệu (FAM/VIC/Cy5) để định lượng trực tiếp số lượng bản sao vi khuẩn mà không cần bước điện di trên gel agarose, rút ngắn thời gian phân tích xuống còn $8\text{ giờ}$.
2. Ứng dụng thuốc nhuộm PMA (Propidium Monoazide): Kết hợp kỹ thuật PMA-PCR nhằm bất hoạt DNA của tế bào vi khuẩn chết, chỉ cho phép khuếch đại DNA từ tế bào Salmonella còn sống.
3. Mở rộng dải mục tiêu phát hiện: Tích hợp thêm các cặp mồi phát hiện gen độc lực đường ruột (stn), kháng nguyên bề mặt (fliC, rfb) và gen kháng kháng sinh đa cơ chế.

---

Đối tượng hưởng lợi

                         LỢI ÍCH CỦA CÁC BÊN LIÊN QUAN

---

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để vận hành quy trình này tại cơ sở là gì?

Cơ sở cần thiết lập phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II (BSL-2) với ba khu vực riêng biệt: phòng chuẩn bị hóa chất (sạch), phòng xử lý mẫu tách chiết DNA, và phòng chạy máy PCR/điện di để tránh nhiễm chéo sản phẩm khuếch đại. Nhân viên cần được đào tạo kỹ thuật micropipette và an toàn sinh học.

2. Tại sao quy trình sốc nhiệt 100°C và -20°C lại thay thế được các kit tách chiết thương mại đắt tiền?

Sau giai đoạn tiền tăng sinh 6 giờ trong môi trường BPW, mật độ vi khuẩn Salmonella đạt đủ ngưỡng phát hiện ($>10^3\text{ CFU/mL}$). Bước sốc nhiệt ở $100^\circ\text{C}$ làm biến tính và phá vỡ cấu trúc màng lipid kép và peptidoglycan của vi khuẩn gram âm, giải phóng DNA bộ gen vào dung dịch. Việc hạ nhiệt đột ngột xuống $-20^\circ\text{C}$ làm đông băng nhanh và phá hủy hoàn toàn mảnh vỡ tế bào. Dịch nổi sau ly tâm chứa đủ DNA làm khuôn cho phản ứng PCR mà không cần qua các bước tinh sạch phức tạp.

3. Làm thế nào để giải quyết nguy cơ ức chế phản ứng PCR (PCR Inhibition) do thành phần thịt?

Trong mô thịt chứa nhiều protein, lipid và ion kim loại có khả năng bắt giữ ion $\text{Mg}^{2+}$ hoặc ức chế enzyme Taq Polymerase. Quy trình khắc phục bằng cách ly tâm mẫu canh khuẩn ở tốc độ $10.000\text{ vòng/phút}$ trong 10 phút để thu cặn tế bào vi khuẩn, sau đó rửa lại cặn bằng $300\text{ }\mu\text{L}$ nước cất vô trùng trước khi sốc nhiệt. Bước này loại bỏ hơn $95%$ các hợp chất ức chế hòa tan trong môi trường.

4. Tại sao tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mẫu thịt chợ chiều lại cao gấp 3 lần mẫu chợ sáng?

Thịt lợn tại các chợ truyền thống thường được pha lóc và bày bán ở nhiệt độ phòng ($28^\circ\text{C} - 35^\circ\text{C}$) trong suốt 8 đến 10 tiếng mà không có hệ thống dây chuyền lạnh bảo quản. Nhiệt độ này là môi trường tối ưu cho Salmonella phân chia (thời gian thế hệ $\sim 20 - 30\text{ phút}$). Đồng thời, dụng cụ dao thớt, phản thịt và tay người bán hàng không được khử trùng liên tục dẫn đến lây nhiễm chéo tích lũy qua thời gian.

5. Chi phí phân tích cho một mẫu bằng phương pháp Multiplex PCR này là bao nhiêu?

Chi phí hóa chất tiêu hao cho một phản ứng Multiplex PCR (gồm $12.5\text{ }\mu\text{L}$ MasterMix, 4 đoạn mồi, agarose, chất nhuộm DNA, dung dịch đệm) dao động từ 35.000 đến 45.000 VNĐ/mẫu. Con số này thấp hơn đáng kể so với việc sử dụng kit thương mại ($150.000 - 250.000\text{ VNĐ/mẫu}$) hoặc phương pháp nuôi cấy truyền thống tính theo chi phí môi trường và nhân công $5\text{ ngày}$.

---

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp "Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kỹ thuật sinh học phân tử" đã giải quyết trọn vẹn bài toán kiểm nghiệm nhanh vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tươi sống. Bằng việc cải tiến quy trình tiền tăng sinh $6\text{ giờ}$ kết hợp sốc nhiệt phá vách và phản ứng Multiplex PCR phối hợp hai cặp mồi invA và spvC, đề tài đã thiết lập một giải pháp kỹ thuật chính xác, rút ngắn thời gian kiểm định từ 5 - 7 ngày xuống còn 12 giờ, với độ đặc hiệu đạt $100%$ khi đối chứng với các chủng vi khuẩn đường ruột khác.

Kết quả điều tra thực nghiệm trên 60 mẫu thịt lợn tại 3 chợ lớn ở TP. Thái Nguyên cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mức báo động (20.0%), đặc biệt tỷ lệ nhiễm ở thịt bày bán buổi chiều lên đến 30.0% và đã ghi nhận sự xuất hiện của các chủng độc tính cao mang gen spvC. Thành công của nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc kiểm soát chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm tại các lò giết mổ, siêu thị và trung tâm kiểm định, đóng góp thiết thực vào công tác bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Các cơ sở chế biến thực phẩm và đơn vị nghiên cứu có thể áp dụng ngay quy trình này vào hệ thống kiểm soát chất lượng thường quy.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của nhiều quốc gia. Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống của nhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội [4]. Theo số liệu thống kê của cục an toàn vệ sinh thực phẩm mỗi năm nước ta có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Riêng tỉnh Thái nguyên, năm 2014 tỷ lệ mắc 4,7/100.000 dân, tháng 4/2014 có 04 vụ ngộ độc thực phẩm.

Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, chiếm tỷ lệ 43,2% [18]. Đặc biệt vi khuẩn Salmonella là thủ phạm gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Theo thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400 công nhân mắc và phải nhập viện. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc.

Theo WHO/ FAO ngộ độc thực phẩm xảy ra ở nhiều nơi ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế. Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra hoá sinh tốn nhiều thời gian 5 đến 7 ngày (ISO 6579: 2003), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác quy trình n 2 phân tích này không cho phép phân biệt các loài hay phân loài Salmonella với nhau.

Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khoẻ, tính mạng con người, gây thiệt hại về kinh tế. Những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các kỹ thuật sinh học phân tử đã cho phép phát triển phương pháp kiểm tra rất nhạy và nhanh sự hiện diện của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy dài [5]. Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán ngắn và không yêu cầu thiết bị phức tạp. Dựa vào viêc sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các đoạn DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phép phát hiện đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh [11].

Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh Salmonella là một đề tài có ý nghĩa thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do Salmonella gây nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, để đánh giá tình trạng nhiễm vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tại các khu chợ xung quanh Thành Phố Thái Nguyên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kĩ thuật sinh học phân tử” 1.Mục đích nghiên cứu Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kỹ thuật PCR.Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong mẫu thịt bằng kỹ thuật PCR. n 3 Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp và S.enterica trong thịt lợn ở khu vực thành phố Thái Nguyên.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 1.Ý nghĩa khoa học Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong thịt lợn. Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tác phong làm việc.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh Salmonella tạp nhiễm trong thịt lợn.

n 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella. Trên thế giới Ngộ độc thực phẩm là mối quan tâm đặc biệt ở mỗi quốc gia và là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Mỗi năm thế giới đã ghi nhận hàng triệu ca bệnh trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong.

Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (lợn, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng và các sản phẩm của trứng [21]. Ở Mỹ theo thống kê của trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh CDC (Centers for Disease Control and Prevention) năm 2007 cả nước Mỹ có 17,883 ca ngộ độc thực phẩm, trong số đó có 38% bệnh nhân nhiễm Salmonella nhưng thực tế chỉ có khoảng 1 - 5% là được thống kê và có khoảng 400 trường hợp tử vong do Salmonella, làm thiệt hại hơn 50 triệu USD nên vi khuẩn này được liệt vào loại gây ngộ độc nguy hiểm nhất tại Mỹ. Trong số ca nhiễm khuẩn Salmonella, phần lớn bệnh nhân bị nhiễm S. Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu và Trung tâm phòng chống kiểm soát bệnh dịch Châu Âu đã thống kê năm 2009 khu vực EU có tổng 108.614 người bị nhiễm Salmonella.

Ở Việt nam Tại Việt Nam trong những năm gần đây tình hình ngộ độc thực phẩm cũng gia tăng trở thành vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng và là mối quan tâm hàng đầu hiện nay của các nhà dịch tễ, vi sinh và lâm sàng trong cả nước. Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33 - 49% và chủ yếu n 5 là Salmonella chiếm 70% các vụ ngộ độc [1]. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn năm 2009 tại Hà Nội trong số 72 mẫu thịt lợn được kiểm tra có 3 mẫu nhiễm Salmonella (chiếm 4,1%) và tại TP Hồ Chí Minh, trong số 69 mẫu thịt lợn được kiểm tra có 4 mẫu nhiễm Salmonella (chiếm 5,8%). Tại Thành phố Hồ Chí Minh, Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) thực hiện kiểm tra 213 mẫu thịt lợn, 213 mẫu thịt gà và 213 mẫu cá biển vào tháng 5/2013 – 4/2014 tại chợ đầu mối Bình Điền, Hóc Môn,Thủ Đức trong đó thịt lợn có 71/213 mẫu kiểm nghiệm phát hiện nhiễm Salmonella (chiếm 30,74%) , thịt gà phát hiện Salmonella trong 105/231 mẫu kiểm nghiệm (chiếm 45,45%) và cá biển 13/ 213 mẫu kiểm nghiệm có nhiễm Salmonella (chiếm 6,103%) [18].

Thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400 công nhân mắc và phải nhập viện. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc. Nhìn chung tỷ lệ nhiễm Salmonella cao, các vụ ngộ độc với quy mô nhiều người mắc thường xảy ra ở các bếp ăn tập thể, các xí nghiệp [18]. Tổng quan về Salmonella 2.

Lịch sử phát hiện Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweninittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là n 6 do một loại virus gây nên và đã xác định S. choleraesui là vi khuẩn gây bệnh thương hàn [13].Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là S. Vi khuẩn này được gọi nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner [2].

Năm 1889 Klein phân lập được S. gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau nên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S. Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.

paratyphi equi và S. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S. paratyphi B và đến năm 1898, S. paratyphi A đã tìm được do N.

Phân loại Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que và có thể di động được [6]. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân loại Salmonella trong đó Kauffmann - White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003 [24]. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng nguyên H và kháng nguyên bề mặt Vi.

Theo phương pháp định danh Kauffmann – White Salmonella được chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo phân loại Kauffmann- White. Số kiểu Loài và phân loài Salmonella Vật chủ huyết thanh S. enterica (I) 1454 Động vật máu nóng S.

salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và môi trường S. arizonae (IIIa) 94 Động vật máu lạnh và môi trường S. diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường S.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường S. indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường S.

bongori 20 Động vật máu lạnh và môi trường Tổng 2463 Samonella enterica phân loài I chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu huyết thanh của Salmonella. Phân loài này gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu nóng, trong đó S. enteritidis là có hai kiểu huyết thanh quan trọng gây bệnh cho người [19, 40]. Thống kê từ 1990 đến 1995, S.

typhimurium chiếm khoảng 70% tổng số Salmonella được phân lập trên toàn thế giới [26]. Đặc điểm hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram âm, có kích thước 0,7 - 1,5 x 2-5µm, sống kị khí tùy nghi, không có nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao, có khoảng 7 đến 12 lông mao xung quanh thân (trừ S. n 8 pullorum gây bệnh cho gia cầm). Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 370 C trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính 2 - 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất [2].