Luận án tiến sĩ y họ phát hiện một số đột biến gen và đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của bệnh nhi thalassemia tại bệnh viện trẻ em hải phòng

Luận án tiến sĩ y học phát hiện đột biến gen và mối liên hệ kiểu gen - kiểu hình ở bệnh nhi thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng.

• Tác giả: Đỗ Thị Quỳnh Mai
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Ngọc Sáng
• Trường học: Đại học Y Dược Hải Phòng
• Chuyên ngành: Nhi
• Đề tài: Phát hiện một số đột biến gen và đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của bệnh nhi Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hải Phòng

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh Thalassemia
• 1.2. Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm
• 1.3. Tổng quan phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Thalassemia
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đột biến gen gây bệnh Thalassemia ở bệnh nhi tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng
• 3.2. Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của các bệnh nhi Thalassemia ở Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng
• 3.3. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng theo gen đột biến và bước đầu xây dựng 1 số phả hệ
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia ở bệnh nhi tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng. Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của các bệnh nhi Thalassemia ở Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng
• 4.2. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng theo gen đột biến và bước đầu xây dựng 1 số phả hệ
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• NHỮNG HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI
• PHƯƠNG HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH BỆNH NHÂN

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh Thalassemia

Thalassemia là một nhóm bệnh thiếu máu tan máu bẩm sinh do đột biến gen globin, gây thiếu hụt tổng hợp một phần hoặc toàn bộ mạch polypeptid trong globin của hemoglobin. Bệnh được phân loại dựa trên chuỗi globin bị ảnh hưởng, phổ biến nhất là α-Thalassemia, β-Thalassemia và δβ-Thalassemia. Theo Liên đoàn Thalassemia thế giới, khoảng 7% dân số toàn cầu mang gen bệnh, với 300-400 nghìn trẻ sinh ra mắc bệnh mỗi năm. Việt Nam nằm trong 'vành đai Thalassemia', với tỷ lệ người mang gen bệnh cao, đặc biệt ở các tỉnh miền núi. Nghiên cứu tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng nhằm xác định đột biến gen và đối chiếu kiểu gen - kiểu hình của bệnh nhi Thalassemia, góp phần vào chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh.

1.1. Dịch tễ học bệnh Thalassemia

Thalassemia là một trong những bệnh rối loạn di truyền phổ biến nhất, liên quan đến nguồn gốc dân tộc. Bệnh phân bố toàn cầu, tập trung ở khu vực Địa Trung Hải, Trung Đông, Đông Nam Á và Bắc Phi. Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh cao, đặc biệt ở các dân tộc thiểu số. Nghiên cứu của Trần Thị Thúy Minh cho thấy tỷ lệ trẻ em từ 1-5 tuổi mang gen α-Thalassemia ở dân tộc Êđê và M’nông là 24,6%. Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra sự lưu hành cao của β-Thalassemia và HbE ở các dân tộc Mường, Thái và Khmer. Hiện tượng giao thoa dân tộc và di cư đã làm gia tăng tỷ lệ người mang gen bệnh trên toàn quốc.

1.2. Cấu trúc và chức năng của hemoglobin

Hemoglobin (Hb) là protein quan trọng trong hồng cầu, có cấu trúc gồm hai thành phần: hem và globin. Hem là protoporphyrin gắn với nguyên tử sắt, trong khi globin gồm bốn mạch polypeptid (hai chuỗi α và hai chuỗi β). Các loại hemoglobin sinh lý bao gồm HbA1 (α2β2), HbA2 (α2δ2) và HbF (α2γ2), với tỷ lệ thay đổi theo từng giai đoạn phát triển. Thalassemia xảy ra do sự thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin, dẫn đến mất cân bằng trong cấu trúc hemoglobin và gây ra các triệu chứng thiếu máu tan máu.

II. Phương pháp nghiên cứu và đối tượng

Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng từ năm 2016 đến 2020, với mục tiêu xác định đột biến gen và đối chiếu kiểu gen - kiểu hình của bệnh nhi Thalassemia. Đối tượng nghiên cứu là các bệnh nhi được chẩn đoán mắc Thalassemia, sử dụng các phương pháp phân tích di truyền như ARMS-PCR, GAP-PCR và MLPA. Các dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng được thu thập và phân tích để xác định mối liên hệ giữa đột biến gen và biểu hiện bệnh.

2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào các bệnh nhi được chẩn đoán mắc Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng. Đối tượng bao gồm trẻ em từ 1 đến 15 tuổi, với các triệu chứng lâm sàng như thiếu máu, lách to và biến dạng xương. Các mẫu máu được thu thập để phân tích đột biến gen và đối chiếu với kiểu hình bệnh.

2.2. Phương pháp phân tích di truyền

Các phương pháp phân tích di truyền được sử dụng bao gồm ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System - Polymerase Chain Reaction) để phát hiện các đột biến điểm, GAP-PCR (Gap-Polymerase Chain Reaction) để xác định các đột biến mất đoạn, và MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) để phân tích các đột biến phức tạp. Các kết quả được so sánh với dữ liệu lâm sàng để xác định mối liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình bệnh.

III. Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Nghiên cứu đã xác định được các đột biến gen phổ biến gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng, bao gồm các đột biến trên gen HBA và HBB. Kết quả cho thấy sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình bệnh, với các biểu hiện lâm sàng như thiếu máu nặng, lách to và biến dạng xương. Nghiên cứu cũng bước đầu xây dựng được một số phả hệ gia đình, góp phần vào việc tư vấn di truyền và phòng ngừa bệnh.

3.1. Đột biến gen gây bệnh Thalassemia

Nghiên cứu đã phát hiện các đột biến gen phổ biến như SEA, 3.7, 4.2 trên gen HBA và CD17, CD26, IVS1-5 trên gen HBB. Các đột biến này dẫn đến sự thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin, gây ra các triệu chứng thiếu máu tan máu. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về Thalassemia tại Việt Nam và khu vực Đông Nam Á.

3.2. Đối chiếu kiểu gen kiểu hình

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình bệnh. Các bệnh nhi mang đột biến SEA và CD17 thường có biểu hiện lâm sàng nặng, bao gồm thiếu máu nặng, lách to và biến dạng xương. Trong khi đó, các đột biến nhẹ hơn như 3.7 và CD26 thường liên quan đến các triệu chứng nhẹ hoặc không triệu chứng. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc xác định đột biến gen trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh Thalassemia (tan máu bẩm sinh) là nhóm bệnh lý huyết học di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, gây suy giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng tổng hợp chuỗi globin trong huyết sắc tố (Hb). Liên đoàn Thalassemia thế giới ước tính khoảng 7% dân số toàn cầu mang gen bệnh, mỗi năm có từ 300.000 đến 400.000 trẻ em sinh ra mắc bệnh thiếu máu do rối loạn này. Việt Nam nằm trong khu vực có nguy cơ cao với khoảng hơn 10 triệu người mang gen bệnh và khoảng 20.000 bệnh nhân cần điều trị thường xuyên, trong đó 44% là trẻ em. Tại thành phố Hải Phòng, số lượng bệnh nhi quản lý điều trị tăng dần (từ 36 bệnh nhi năm 2009 lên khoảng 100 bệnh nhi tại thời điểm nghiên cứu), song việc kiểm soát nguồn gen gây bệnh gặp nhiều khó khăn do chưa có nghiên cứu đầy đủ về các dạng đột biến gen đặc thù tại địa phương.

Xuất phát từ khoảng trống nghiên cứu và yêu cầu thực tiễn đó, luận án tiến sĩ y học của tác giả Đỗ Thị Quỳnh Mai với đề tài "Phát hiện một số đột biến gen và đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của bệnh nhi Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng" (chuyên ngành Nhi, mã số 97.106, thực hiện tại Trường Đại học Y Dược Hải Phòng dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Ngọc Sáng và TS. Bạch Thị Như Quỳnh) đã được triển khai nhằm thực hiện 3 mục tiêu cụ thể:

1. Xác định một số đột biến gen của các bệnh nhi Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng từ ngày 01/01/2016 đến ngày 31/12/2020.
2. Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của các bệnh nhi Thalassemia ở Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng.
3. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng theo gen đột biến và bước đầu xây dựng một số phả hệ của bệnh nhi Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng.

Đối tượng nghiên cứu gồm toàn bộ 85 bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc Thalassemia (bao gồm 27 bệnh nhân $\alpha$-Thalassemia, 56 bệnh nhân $\beta$-Thalassemia và 2 bệnh nhân mang đồng thời cả hai đột biến $\alpha$ và $\beta$-Thalassemia) điều trị nội trú tại Khoa Thận - Máu - Nội tiết, Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng, cùng thân nhân (bố mẹ, anh chị em, ông bà) đồng thuận tham gia làm xét nghiệm gen và nghiên cứu phả hệ trong khoảng thời gian từ năm 2016 đến năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các nghiên cứu dịch tễ học về bệnh Thalassemia trên thế giới và tại Việt Nam. Về phạm vi quốc tế, tác giả Suthat Fucharoen (2011) ghi nhận tại khu vực biên giới Thái Lan, Lào và Campuchia có 30% - 40% người mang gen bệnh $\alpha$-Thalassemia, 1% - 9% mang gen $\beta$-Thalassemia và 50% - 60% mang gen HbE. Tại Trung Quốc, tỷ lệ người mang gen Thalassemia tại tỉnh Quảng Đông là 11,07% và tỉnh Quảng Tây là 19,8%.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ giai đoạn 2010 - 2020 cho thấy tỷ lệ mang gen chung toàn quốc ước tính khoảng 13,8% (tương đương 13 - 14 triệu người), phân bố ở cả 63 tỉnh, thành phố và 54 dân tộc. Tỷ lệ mang gen thay đổi rõ rệt theo từng dân tộc và vùng địa lý:

Dân tộc	Tỷ lệ HbE (%)	Tỷ lệ $\beta$-Thalassemia (%)	Tỷ lệ $\alpha$-Thalassemia (%)	Tổng tỷ lệ mang gen Thalassemia (%)
S'tiêng	0,3	28,0	35,6	63,9
Ê đê	0,8	31,4	-	32,2
Khmer	2,8	26,1	-	28,2
Mường	10,12	11,62	-	21,74
Tày	4,1	7,3	1,4	12,8
Nùng	3,9	6,8	1,0	11,7
Kinh	0,7	3,5	1,7	4,9

Nghiên cứu của Trần Thị Thúy Minh ghi nhận tỷ lệ trẻ 1 - 5 tuổi mang gen $\alpha$-Thalassemia ở dân tộc Ê đê và M'nông là 24,6%, đồng thời tỷ lệ mắc ở các dân tộc lần lượt là S'tiêng (63,9%), Ê đê (32,2%), M'nông (24,2%), Mường (22,6%), Kinh (19,5%), Thái (16,6%), Nùng/Sán Dìu (14,3%), Raglai (14,5%), Tày (12,5%), Dao (12,1%). Khảo sát máu cuống rốn sơ sinh của Dương Bá Trực tại Hà Nội phát hiện 2,3% trẻ mang gen $\alpha$-Thalassemia thể $\alpha1$ và $\alpha2$, trong đó bệnh nhân HbH chiếm 13,75% tổng số ca Thalassemia đến khám (người Kinh chiếm 84,7%, dân tộc ít người chiếm 15,3%). Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2019, tỷ lệ thai phụ mang gen $\alpha$-Thalassemia là 78%, trong đó người mang gen dị hợp tử SEA chiếm 73,2%. Nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan tại Bệnh viện Từ Dũ chỉ ra 98,7% trường hợp $\alpha$-Thalassemia do 4 loại alen đột biến (--SEA, -$\alpha^{3.7}$...). Nguyễn Thu Phương (2019) tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên cũng ghi nhận alen phổ biến nhất là --SEA trên 58 bệnh nhân.

Đối với bệnh $\beta$-Thalassemia và huyết sắc tố E (HbE), Bùi Văn Viên và cộng sự ghi nhận tỷ lệ mang gen $\alpha$-Thalassemia tại huyện Kim Bôi (Hòa Bình) là 10,67% và tỷ lệ mang HbE là 12,3%. Bạch Quốc Khánh và cộng sự (2021) ghi nhận tỷ lệ mang gen Thalassemia/huyết sắc tố ở người Thái là 38,0%, người Mường là 41,4% và tỷ lệ HbE ở nhóm Thái - Mường là 18,4%. Nguyễn Văn Dũng khảo sát 124 người Gia Rai ghi nhận tỷ lệ bệnh hemoglobin là 39% (HbE chiếm 34%). Phân bố thể bệnh tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 theo Lâm Thị Mỹ gồm $\beta$-Thalassemia/HbE chiếm 42,8%, $\beta$-Thalassemia chiếm 34,5%, HbH chiếm 15,4%; tại Bệnh viện Nhi Trung ương theo Khamkhanxay Mangnomek ghi nhận $\beta$-Thalassemia/HbE chiếm 35,6% và $\beta$-Thalassemia chiếm 42,8%.

Về phổ đột biến điểm gen HBB, Saovaros Svasti và Trần Minh Hiệu (2002) xác định các đột biến thường gặp ở người Việt Nam gồm: -28 A>G, CD17 A>T, IVS 1-5 G>C, CD 41/42 -TTCT, CD 71/72 +A, IVS 2-654 C>T, CD 26 GAG>AAG, IVS 1-1 G>T. Khảo sát của Đặng Thị Hồng Thiện bằng kỹ thuật ARMS-PCR tại Bệnh viện Nhi Trung ương ghi nhận tỷ lệ đột biến CD17 là 5,7%, -28M là 2,5%, CD41/42 là 0,8%, IVS1-5 là 0,8%, IVS2-654 là 5,7%. Nghiên cứu của Nguyễn Hưng Đạo (2019 - 2020) tại huyện Chiêm Hóa đã bước đầu xây dựng mô hình quản lý, sàng lọc trước kết hôn và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia ở tuyến huyện.

Tại thành phố Hải Phòng, dân số năm 2019 đạt 2.028.514 người (mật độ 1.299 người/km²), số bệnh nhi Thalassemia quản lý tăng lên nhưng trước thời điểm thực hiện luận án chưa có công trình nào xác định đột biến gen và đối chiếu kiểu gen - kiểu hình. Luận án giải quyết trực tiếp khoảng trống khoa học này nhằm cung cấp dữ liệu phục vụ chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền tại địa phương.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và bệnh học phân tử

Phân tử hemoglobin (Hb) bình thường có trọng lượng phân tử 64.400 Dalton, gồm nhân hem (protoporphyrin gắn nguyên tử $Fe^{2+}$) và phần protein globin gồm 4 chuỗi polypeptid. Theo phân loại cấu trúc sinh lý của Gamal Abdul Hamid (2013), các dạng Hb ở người gồm:

• HbA1 ($\alpha_2\beta_2$): Xuất hiện từ tuần thứ 6 của thai, là thành phần chủ yếu ở người bình thường sau sinh.
• HbA2 ($\alpha_2\delta_2$): Xuất hiện gần lúc sinh và duy trì tỷ lệ nhỏ ở người bình thường.
• HbF ($\alpha_2\gamma_2$): Xuất hiện từ tuần thứ 5 của thai, là thành phần chủ yếu thời kỳ bào thai.
• Hb Gower 1 ($\zeta_2\epsilon_2$) và Hb Gower 2 ($\alpha_2\epsilon_2$): Xuất hiện ở phôi thai 2 - 3 tuần, tồn tại trong 2 tháng đầu thai kỳ.
• Hb Portland ($\zeta_2\gamma_2$): Xuất hiện ở phôi thai 2 - 3 tuần.

Cơ chế bệnh sinh Thalassemia dựa trên quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (Valentine và Neel). Hiện tượng thiếu hụt một loại chuỗi globin dẫn đến hai hậu quả: (1) Giảm tổng hợp Hb gây thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy; (2) Mất cân bằng giữa các chuỗi globin, chuỗi thừa dư kết tủa trên màng hồng cầu và nguyên sinh chất tế bào tủy, làm mất tính mềm dẻo, gây tan máu ngoại vi tại lách và hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả trong tủy xương.

Cụm gen $\alpha$-globin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 16 (16p13.3), gồm hai gen HbA1 (840 bp) và HbA2 (830 bp). Đột biến alen $\alpha^0$-Thalassemia làm mất chức năng cả 2 gen HBA trên cùng một nhiễm sắc thể (--SEA, --MED, --THAI, --FIL); alen $\alpha^+$-Thalassemia làm mất hoặc bất hoạt 1 gen HBA (-$\alpha^{3.7}$, -$\alpha^{4.2}$, $\alpha^{HbCS}\alpha$, $\alpha^{HbQS}\alpha$). Mất cả 4 gen gây hội chứng phù thai Hb Bart's ($\gamma_4$), mất 3 gen gây bệnh HbH ($\beta_4$).

Cụm gen $\beta$-globin (HBB) nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5), dài 1.600 bp gồm 3 exon và 2 intron. Đột biến $\beta^0$ gây mất hoàn toàn khả năng tạo chuỗi $\beta$-globin, đột biến $\beta^+$ gây giảm tổng hợp chuỗi $\beta$-globin.

Hậu quả bệnh học gồm có: quá tải sắt (Von Recklinghausen 1865), gây tổn thương tim mạch (nguyên nhân tử vong hàng đầu), gan (nồng độ sắt trong gan - LIC với ngưỡng 16 mg/g trọng lượng gan khô dẫn đến xơ hóa; lượng sắt toàn thân tính bằng LIC nhân hệ số 10,6), biến dạng xương ("bộ mặt Thalassemia" kiểu gặm nhấm, hình ảnh bàn chải trên X-quang sọ) và nhiễm khuẩn (đặc biệt sau cắt lách do giảm chức năng miễn dịch, tác nhân gồm Streptococcus pneumoniae >75%, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, vi khuẩn gram âm, Salmonella, nấm Mucor, ký sinh trùng Babesia, virus Parvovirus B19).

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả một loạt ca bệnh.
• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Thuận tiện toàn bộ gồm 85 bệnh nhân Thalassemia điều trị nội trú tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng và gia đình của bệnh nhân.
• Địa điểm: Khoa Thận - Máu - Nội tiết, Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng; các xét nghiệm sinh học phân tử thực hiện tại Labo Sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng (72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngô Quyền, Hải Phòng).
• Kỹ thuật sinh học phân tử:
  • GAP-PCR đa mồi (Multiplex GAP-PCR) theo Samuel S. Chong và Winichagoon nhằm phát hiện 5 đột biến mất đoạn lớn trên gen HBA: SEA (kích thước sản phẩm 1.349 bp), FIL (1.166 bp), THAI (1.024 bp), -$\alpha^{3.7}$ (2.022 bp), -$\alpha^{4.2}$ (1.628 bp) và đoạn chứng nội gen $\alpha2$ bình thường (1.800 bp).
  • Kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện các đột biến điểm đặc hiệu trên gen HBA và HBB.
  • Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và đọc kết quả dưới ánh sáng cực tím.

Bảng thành phần hóa chất và chu trình nhiệt của phản ứng GAP-PCR:

Thành phần phản ứng	Thể tích ($\mu$l)	Chu trình nhiệt	Thông số nhiệt độ và thời gian
PCR Multiplex master mix 2X	12,5	Chu kỳ 1 (1 chu kỳ)	95°C trong 15 phút
Primer 10X	2,5	Chu kỳ 2 (36 chu kỳ)	95°C trong 40 giây $\rightarrow$ 65°C trong 1 phút 30 giây $\rightarrow$ 72°C trong 2 phút 30 giây
dH2O	7,5	Chu kỳ 3 (1 chu kỳ)	72°C trong 10 phút
DMSO (10%)	1,5	Giữ mẫu	4°C vô hạn
DNA mẫu	1,0
Tổng thể tích	25,0

• Phương pháp lập và phân tích phả hệ: Xây dựng sơ đồ phả hệ từ 2 đến 3 thế hệ theo quy ước quốc tế dựa trên kết quả xác định kiểu gen của đương sự và người thân trong gia đình.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này trình bày toàn diện cơ sở dịch tễ học bệnh Thalassemia trong nước và quốc tế; nhắc lại đặc điểm cấu trúc sinh lý của các loại hemoglobin qua các giai đoạn phát triển cá thể; phân tích cơ chế bệnh sinh của hiện tượng giảm tổng hợp hemoglobin, mất cân bằng chuỗi globin và hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả; mô tả cơ sở di truyền phân tử của cụm gen $\alpha$-globin (nhiễm sắc thể 16) và $\beta$-globin (nhiễm sắc thể 11). Chương tổng quan cũng điểm lại lịch sử nghiên cứu từ các mô tả lâm sàng đầu tiên của Jame Henrick (1910), Lee và Cooley (1925), Whipple và Bradford (1936), Valentine và Neel (1944), Vecchio (1948), Minich (1954), Rigar và Gouttas (1955). Đồng thời, tác giả tổng thuật các biến chứng lâm sàng (quá tải sắt, biến dạng xương sọ mặt, suy tim, xơ gan, nhiễm khuẩn), tổng quan các kỹ thuật xét nghiệm di truyền (RE-PCR, MLPA, lai DNA Stripassay, Realtime PCR, DNA sequencing, GAP-PCR, ARMS-PCR) và nguyên lý lập, phân tích phả hệ trong tư vấn di truyền phòng bệnh.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ của 85 bệnh nhi Thalassemia và người thân trong gia đình. Tác giả thiết lập hệ thống các biến số nghiên cứu theo 3 mục tiêu:

• Nhóm biến số đặc điểm chung: Tuổi vào viện (0 - 12 tháng, 1 - <5 tuổi, 5 - <10 tuổi, 10 - <15 tuổi, $\ge$15 tuổi), tuổi phát hiện bệnh (<1 tuổi, 1 - <5 tuổi, 5 - <10 tuổi, $\ge$10 tuổi), giới tính (nam, nữ), địa dư (thành thị, nông thôn).
• Nhóm biến số di truyền phân tử: Đột biến mất đoạn (--SEA, -$\alpha^{3.7}$, -$\alpha^{4.2}$, --THAI, --FIL) và không mất đoạn (HbCS, c2delT) trên gen $\alpha$-globin; các đột biến điểm (-28A>G, CD17 A>T, CD26 G>A, CD41/42 -TTCT, IVS1-1 G>T, CD71/72 +A, CD95 +5, IVS2-654 C>T) trên gen $\beta$-globin; phân loại theo vị trí exon/intron, chức năng gen (phiên mã, hoàn thiện RNA, dịch mã) và kiểu gen (đồng hợp tử, dị hợp tử kép, dị hợp tử phối hợp HbE, dị hợp tử đơn).
• Nhóm biến số lâm sàng và cận lâm sàng: Lý do vào viện; mức độ thiếu máu, vàng da, nhiễm sắt; mức độ lách to (độ I, II, III, IV), gan to; mức độ biến dạng xương sọ mặt (không/không rõ, vừa phải, điển hình); xuất huyết; số lần truyền máu/năm (1 - 2 lần, 3 - 5 lần, >5 lần); chỉ số công thức máu (HC, Hb, Hct, MCV, MCH, RDW, BC, TC); thành phần điện di Hb (HbA1, HbA2, HbF, HbE, HbH); chỉ số sinh hóa (ferritin, sắt huyết thanh, GOT, GPT, ure, creatinin).
• Quy trình kỹ thuật sinh học phân tử: Trình bày chi tiết nồng độ hóa chất, trình tự đoạn mồi và chu trình luân nhiệt của phản ứng GAP-PCR và ARMS-PCR tại Labo Sinh học phân tử.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu nghiên cứu thu được trên 85 bệnh nhi và các gia đình tham gia nghiên cứu:

• Kết quả xác định đột biến gen: Phân tích tần số và tỷ lệ các dạng đột biến mất đoạn gen $\alpha$-globin (--SEA, -$\alpha^{3.7}$, -$\alpha^{4.2}$) và đột biến điểm (HbCS, c2delT); tần số các đột biến trên gen HBB (CD17, CD41/42, CD71/72, CD26, CD95, IVS1-1, IVS2-654, -28 A>G); phân loại bệnh nhân theo số lượng gen đột biến và kiểu gen đột biến.
• Kết quả đối chiếu kiểu gen với kiểu hình: Mối tương quan giữa kiểu gen đột biến ($\alpha$ và $\beta$-Thalassemia) với các biểu hiện lâm sàng (mức độ thiếu máu, lách to, biến dạng xương sọ mặt), tuổi bắt đầu truyền máu, số lần truyền máu trung bình hàng năm, tình trạng phụ thuộc truyền máu, các chỉ số hồng cầu (MCV, MCH), thành phần huyết sắc tố trên điện di (HbF, HbA1, HbA2, HbE, HbH) và mức độ ứ sắt (ferritin, sắt huyết thanh), men gan (GOT, GPT).
• Kết quả nghiên cứu phả hệ: Xây dựng thành công 12 sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhi Thalassemia, thể hiện sự di truyền của các đột biến qua 2 đến 3 thế hệ, phân tích kiểu gen của bố mẹ và anh chị em ruột, minh họa trường hợp phát hiện đột biến CD95 tại phả hệ số 11.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các kết quả thu được với các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế:

• Bàn luận về đặc điểm phân bố các đột biến gen $\alpha$-globin và gen $\beta$-globin tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng so với các nghiên cứu của Đặng Thị Hồng Thiện, Nguyễn Khắc Hân Hoan, Nguyễn Thu Phương và các tác giả trong khu vực Đông Nam Á.
• Phân tích mối tương quan sinh học phân tử giữa kiểu gen và biểu hiện kiểu hình lâm sàng, sự biến đổi các chỉ số huyết học, mức độ ứ sắt và đáp ứng truyền máu.
• Bàn luận về giá trị ứng dụng của kỹ thuật GAP-PCR, ARMS-PCR và phương pháp xây dựng phả hệ trong chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh và tư vấn di truyền trước hôn nhân, trước sinh tại thành phố Hải Phòng.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

Luận án cung cấp hệ thống dữ liệu khoa học đầu tiên về đặc điểm dịch tễ học phân tử của bệnh Thalassemia ở bệnh nhi tại thành phố Hải Phòng, làm rõ phổ đột biến gen $\alpha$-globin và $\beta$-globin trên nhóm đối tượng nghiên cứu. Đề tài đã chứng minh mối liên quan chặt chẽ giữa các dạng đột biến gen (kiểu gen) với mức độ biểu hiện lâm sàng, biến đổi cận lâm sàng và mức độ ứ sắt (kiểu hình), góp phần bổ sung dẫn liệu khoa học về di truyền học lâm sàng bệnh huyết sắc tố tại Việt Nam.

Đóng góp về mặt thực tiễn

• Ứng dụng thành công các quy trình kỹ thuật sinh học phân tử (GAP-PCR và ARMS-PCR) tại Labo Sinh học phân tử Trường Đại học Y Dược Hải Phòng để chẩn đoán xác định đột biến gen Thalassemia, phục vụ trực tiếp công tác chẩn đoán phân tử cho bệnh nhi tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng.
• Xây dựng sơ đồ phả hệ cho các gia đình bệnh nhi, cung cấp công cụ trực quan và chính xác cho các bác sĩ lâm sàng thực hiện tư vấn di truyền tiền hôn nhân và tư vấn trước sinh, giúp các gia đình có nguy cơ chủ động phòng ngừa sinh con mắc thể bệnh nặng.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đưa xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện đột biến gen Thalassemia vào quy trình chẩn đoán thường quy cho bệnh nhi nghi ngờ mắc bệnh và các thành viên trong gia đình tại các cơ sở y tế chuyên khoa nhi.
• Tăng cường công tác truyền thông, tư vấn di truyền và tầm soát người mang gen bệnh cho các đối tượng tiền hôn nhân và phụ nữ mang thai trên địa bàn thành phố Hải Phòng.
• Ứng dụng mô hình lập phả hệ kết hợp xét nghiệm gen để quản lý nguồn gen Thalassemia tại cộng đồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nghiên cứu được thực hiện tại một trung tâm điều trị chuyên khoa (Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng) với phương pháp chọn mẫu thuận tiện trên 85 bệnh nhi điều trị nội trú, do đó chưa đại diện cho toàn bộ quần thể người mang gen Thalassemia trong cộng đồng dân cư thành phố Hải Phòng.
• Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng (GAP-PCR, ARMS-PCR) tập trung phát hiện các đột biến mất đoạn và đột biến điểm phổ biến đã biết; chưa áp dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ gen (DNA sequencing) hoặc kỹ thuật MLPA cho toàn bộ mẫu để phát hiện các đột biến hiếm gặp hoặc đột biến mới.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng quy mô nghiên cứu sàng lọc dịch tễ học phân tử Thalassemia trên các nhóm dân cư rộng lớn hơn tại Hải Phòng, bao gồm học sinh, thanh niên tiền hôn nhân và phụ nữ mang thai tại tuyến y tế cơ sở.
• Triển khai kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và MLPA nhằm phát hiện toàn diện các đột biến hiếm, đột biến mới trên các cụm gen globin chưa xác định được bằng các kỹ thuật thông thường.
• Đánh giá hiệu quả dài hạn của chương trình tư vấn di truyền dựa trên phả hệ đối với việc giảm tỷ lệ trẻ sinh ra mắc Thalassemia thể nặng tại địa phương.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao cho các nhóm đối tượng:

• Bác sĩ chuyên khoa Nhi, Huyết học - Truyền máu và Di truyền y học: Tham khảo các dữ liệu đối chiếu kiểu gen - kiểu hình để nâng cao độ chính xác trong tiên lượng bệnh, chỉ định truyền máu, thải sắt và chỉ định xét nghiệm gen phù hợp.
• Nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và giảng viên y dược: Tham khảo khung thiết kế nghiên cứu mô tả loạt ca bệnh huyết học phân tử, phương pháp xây dựng phả hệ di truyền lâm sàng và quy trình thực hiện kỹ thuật GAP-PCR, ARMS-PCR.
• Cán bộ quản lý y tế và y tế dự phòng: Sử dụng số liệu làm căn cứ xây dựng kế hoạch sàng lọc, quản lý nguồn gen bệnh Thalassemia và chính sách tư vấn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh tại thành phố Hải Phòng và các tỉnh lân cận.

Câu hỏi thường gặp

Luận án nghiên cứu trên bao nhiêu bệnh nhân và tại địa điểm nào?

Nghiên cứu được thực hiện trên 85 bệnh nhi được chẩn đoán xác định mắc Thalassemia (gồm 27 bệnh nhân $\alpha$-Thalassemia, 56 bệnh nhân $\beta$-Thalassemia và 2 bệnh nhân mang đồng thời cả đột biến $\alpha$ và $\beta$-Thalassemia) điều trị tại Khoa Thận - Máu - Nội tiết, Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng từ ngày 01/01/2016 đến ngày 31/12/2020. Các xét nghiệm sinh học phân tử được tiến hành tại Labo Sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng.

Kỹ thuật sinh học phân tử nào được tác giả sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn gen $\alpha$-globin?

Tác giả sử dụng kỹ thuật GAP-PCR đa mồi (Multiplex GAP-PCR) với 5 cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 5 loại đột biến mất đoạn lớn trên gen HBA gồm: SEA (kích thước sản phẩm 1.349 bp), FIL (1.166 bp), THAI (1.024 bp), -$\alpha^{3.7}$ (2.022 bp), -$\alpha^{4.2}$ (1.628 bp) cùng đoạn chứng nội gen $\alpha2$ bình thường có kích thước 1.800 bp.

Cơ chế bệnh sinh chính dẫn đến các biến đổi huyết học và lâm sàng ở bệnh nhi Thalassemia là gì?

Cơ chế bệnh sinh xuất phát từ đột biến gen globin làm giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi $\alpha$ hoặc $\beta$-globin, dẫn đến: (1) Giảm tổng hợp hemoglobin gây thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc; (2) Mất cân bằng giữa các chuỗi globin làm chuỗi thừa dư kết tủa trên màng hồng cầu và hồng cầu non trong tủy xương, gây tan máu sớm tại lách và hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả trong tủy xương, từ đó dẫn đến biến dạng xương và tăng hấp thu sắt gây quá tải sắt toàn thân.

Tác giả đã xây dựng được bao nhiêu sơ đồ phả hệ trong nghiên cứu?

Tác giả đã bước đầu xây dựng được 12 sơ đồ phả hệ gia đình (từ phả hệ số 1 đến phả hệ số 12) cho các bệnh nhi Thalassemia tham gia nghiên cứu, mô tả mối quan hệ di truyền qua 2 đến 3 thế hệ và xác định kiểu gen của các thành viên trong gia đình bằng kỹ thuật phân tử.

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Đỗ Thị Quỳnh Mai đã hoàn thành 3 mục tiêu nghiên cứu: xác định phổ đột biến gen $\alpha$ và $\beta$-globin, đối chiếu mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình lâm sàng - cận lâm sàng, đồng thời xây dựng 12 sơ đồ phả hệ di truyền ở 85 bệnh nhi Thalassemia tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng giai đoạn 2016 - 2020. Công trình cung cấp các bằng chứng khoa học và dữ liệu phân tử thực tiễn đầu tiên tại địa phương, khẳng định vai trò của kỹ thuật GAP-PCR, ARMS-PCR và phân tích phả hệ trong chẩn đoán sớm, tiên lượng và tư vấn di truyền phòng ngừa bệnh Thalassemia.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN 1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh Thalassemia 1. Dịch tễ học Thalassemia là một trong những bệnh rối loạn di truyền phổ biến nhất trên thế giới, bệnh có liên quan đến nguồn gốc dân tộc. Bệnh phân bố toàn cầu, song có tính địa dư, thường gặp ở vùng Địa Trung Hải, khu vực Trung Đông, Đông Nam Á và Bắc Phi [4], [6].

Theo báo cáo của Liên đoàn Thalassemia quốc tế, số người mang gen bệnh Thalassemia chiếm khoảng 7% dân số toàn cầu [7]. Ở Đông Nam Á, tỷ lệ người mang gen bệnh Thalassemia rất cao. Theo Suthat Fucharoen (2011), vùng biên giới giữa các nước Thái Lan, Lào và Campuchia có tới 30 - 40% người mang gen bệnh α-Thalassemia, 1 - 9% người mang gen bệnh β-Thalassemia; 50 - 60% mang gen bệnh HbE [8]. Tỷ lệ người mang gen Thalassemia ở Quảng Đông (Trung Quốc) là 11,07% [9], ở Quảng Tây là 19,8% [10].

Hiện nay, Việt Nam được xếp vào khu vực có nguy cơ cao với ước tính có khoảng hơn 10 triệu người mang gen bệnh. Ở Việt Nam, qua một số nghiên cứu giai đoạn 2010 - 2020 cho thấy người mang gen Thalassemia gặp với tỷ lệ khá cao. Thalassemia xuất hiện ở mọi vùng miền và ở tất cả các dân tộc Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh khác và đặc biệt cao ở các tỉnh miền núi [11]. Một nghiên cứu gần đây của Trần Thị Thúy Minh thống kê tỷ lệ trẻ em từ 1-5 tuổi mang gen bệnh -Thalassemia ở 2 dân tộc Êđê và M’nông là 24,6%.

Cũng theo tác giả này, tỷ lệ mắc -Thalassemia ở dân tộc khác Stiêng (63,9%), Ê đê (32,2%), M’Nông (24,2%), Mường (22,6%), Kinh (19,5%), Thái (16,6%), Nùng, Dán Dìu (14,3%), RacLay (14,5%), Tày (12,5%), Dao (12,1%) [12]. Do điều kiện khó khăn và kỹ thuật nên không có nhiều nghiên cứu trước đây về tỷ lệ lưu hành người mang gen -Thalassemia ở Việt Nam. Tuy 4 nhiên, theo Dương Bá Trực nghiên cứu máu cuống rốn ở trẻ sơ sinh có khoảng 2,3% trẻ mang gen bệnh sống ở Hà Nội gồm 2 thể bệnh alpha1 và alpha2 và cũng theo tác giả có 13,75% bệnh nhi HbH trong tổng số bệnh Thalassemia đến khám bệnh, trong đó người Kinh chiếm 84,7% và bệnh nhi thuộc dân tộc ít người chiếm 15,3%. Điều này cho thấy α-Thalassemia lưu hành khá phổ biến ở nước ta với nhiều thể bệnh.

Thống kê tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2019 thấy tỉ lệ mẹ mang gen alpha Thalassemia là 78%, trong đó có đến 73,2% là người mang gen dị hợp tử SEA [13]. Nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan [14], thấy 98,7% bệnh -Thalassemia do 4 loại alen đột biến: --SEA,-3. Theo Nguyễn Thu Phương (2019), khi tiến hành nghiên cứu đột biến gen trên 58 bệnh nhân tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên thấy kiểu alen đột biến phổ biến nhất vẫn là kiểu --SEA [15]. Các nghiên cứu về -Thalassemia cho thấy, bệnh gặp nhiều ở Mường chiếm tỉ lệ khá cao, như nghiên cứu của Bùi Văn Viên và CS [16], khi khảo sát bệnh Thalassemia ở nhóm người dân tộc Mường huyện Kim Bôi tỉnh Hoà Bình cho thấy bệnh -Thalassemia rất phổ biến với tần suất là 10,67%.

Theo một tác giả khác thống kê được tần suất người mang gen Thalassemia/huyết sắc tố ở dân tộc Thái và Mường lần lượt là 38,0% và 41,4% [17]. Bên cạnh -Thalassemia thì sự lưu hành HbE ở Việt Nam với tỉ lệ cao. Bùi Văn Viên thấy tỷ lệ lưu hành HbE ở người Mường - Hòa Bình là 12,3% [16]. Qua khảo sát 124 người dân tộc Gia Jai, Nguyễn Văn Dũng nhận thấy tỷ lệ lưu hành bệnh hemoglobin là 39% trong đó sự lưu hành HbE là 34% [18].

Theo Bạch Quốc Khánh và CS (2021) thấy tỷ lệ lưu hành HbE ở nhóm người dân tộc Thái - Mường là 18,4% [17].