## Tổng quan nghiên cứu

Ung thư gan (UTG) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến và có tỉ lệ tử vong cao trên thế giới, với khoảng 900.000 ca mắc mới và hơn 830.000 ca tử vong mỗi năm. Tại Việt Nam, UTG là ung thư phổ biến nhất kể từ năm 2018 với hơn 182.000 ca mắc mới và chiếm 20,6% tổng số ca tử vong do ung thư. Bệnh có tiến triển nhanh, thường được phát hiện muộn do triệu chứng xuất hiện khi bệnh đã nghiêm trọng, làm giảm hiệu quả điều trị và khả năng sống sót của bệnh nhân. Các phương pháp chẩn đoán hiện nay như xét nghiệm AFP, sinh thiết gan, siêu âm, CT, MRI đều có hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu hoặc tính xâm lấn. 

Đột biến gen vùng khởi động TERT (đặc biệt là đột biến C228T) và gen CTNNB1 (đột biến tại exon 3) được xác định là các dấu ấn sinh học quan trọng trong ung thư gan. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chủ yếu phân tích trên mẫu mô ung thư, phương pháp xâm lấn và chi phí cao. Nghiên cứu này nhằm phát triển phương pháp phát hiện đột biến gen TERT và CTNNB1 trên mẫu máu ngoại vi không xâm lấn, đồng thời đánh giá giá trị của các đột biến này trong sàng lọc ung thư gan tại Việt Nam. 

Phạm vi nghiên cứu bao gồm 288 mẫu máu ngoại vi thu thập từ năm 2019 đến 2023 tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và Bệnh viện Quân y 103, phân nhóm bệnh nhân viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan. Mục tiêu chính là thiết lập phương pháp Nested Realtime PCR phát hiện đột biến C228T vùng khởi động gen TERT và giải trình tự gen CTNNB1, đồng thời đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị chẩn đoán của các đột biến này kết hợp với chỉ số AFP.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Đột biến gen TERT và vai trò trong ung thư gan:** Gen TERT mã hóa enzyme telomerase reverse transcriptase, có vai trò duy trì chiều dài telomere, giúp tế bào bất tử. Đột biến C228T tại vùng promoter gen TERT làm tăng hoạt tính phiên mã, thúc đẩy sự phát triển khối u. Tần suất đột biến này cao trong ung thư biểu mô tế bào gan (HCC).

- **Đột biến gen CTNNB1 và con đường tín hiệu Wnt/β-catenin:** Gen CTNNB1 mã hóa β-catenin, trung tâm con đường tín hiệu Wnt, điều hòa tăng sinh tế bào. Đột biến tại exon 3 làm giảm quá trình phosphoryl hóa β-catenin, dẫn đến tích tụ β-catenin trong nhân, kích hoạt các gen tăng sinh và góp phần hình thành ung thư gan.

- **Phương pháp phát hiện đột biến gen:** Nested Realtime PCR kết hợp peptide nucleic acid (pNA) và locked nucleic acid (LNA) probe được sử dụng để tăng độ nhạy và đặc hiệu phát hiện đột biến TERT C228T trên cfDNA. Giải trình tự Sanger được áp dụng để phát hiện đột biến gen CTNNB1 trên cfDNA.

- **Khái niệm cfDNA và ctDNA:** DNA lưu hành tự do (cfDNA) trong máu chứa DNA ung thư (ctDNA) mang các đột biến đặc trưng của khối u, có thể phát hiện sớm ung thư không xâm lấn.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu:** 288 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan thu thập tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và Bệnh viện Quân y 103 từ 2019 đến 2023.

- **Phương pháp chọn mẫu:** Bệnh nhân được lựa chọn theo tiêu chuẩn quốc tế về viêm gan B mạn, xơ gan và ung thư gan có HBsAg (+). Loại trừ bệnh nhân có các bệnh lý phối hợp hoặc yếu tố ảnh hưởng khác.

- **Quy trình xử lý mẫu:** Mẫu máu ly tâm tách huyết tương, bảo quản -80°C. DNA được tách chiết theo phương pháp phenol-chloroform, đánh giá chất lượng bằng tỉ số OD260/280.

- **Phương pháp phân tích:** 
  - Phát hiện đột biến TERT C228T bằng Nested Realtime PCR với pNA và LNA probe, đánh giá độ nhạy (0,1%) và độ đặc hiệu (100%).
  - Phát hiện đột biến gen CTNNB1 bằng PCR khuếch đại vùng exon 3, giải trình tự Sanger.
  - Định lượng AFP bằng phương pháp miễn dịch hóa phát quang.
  - Phân tích số liệu bằng SPSS 22, sử dụng các kiểm định Mann-Whitney, Chi-square, ROC curve để đánh giá hiệu quả chẩn đoán.

- **Timeline nghiên cứu:** Thu thập mẫu từ 2019-2023, phân tích và hoàn thiện luận văn năm 2023.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- Phương pháp Nested Realtime PCR phát hiện đột biến TERT C228T đạt độ nhạy 0,1% và độ đặc hiệu 100%, vượt trội so với phương pháp allele-specific PCR trước đây.

- Tần suất đột biến TERT C228T trên mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư gan là 26,44% (46/174), không phát hiện đột biến này ở nhóm viêm gan mạn và xơ gan.

- Tần suất đột biến gen CTNNB1 tại exon 3 là 6,32% (11/174) ở bệnh nhân ung thư gan, không phát hiện ở nhóm viêm gan mạn và xơ gan.

- Độ tuổi trung vị của bệnh nhân ung thư gan là 62, cao hơn nhóm viêm gan mạn (45) và xơ gan (60). Nồng độ AFP trung vị ở nhóm ung thư gan cao hơn đáng kể (9,5 - 2008,6 ng/μl) so với nhóm viêm gan và xơ gan.

- Phân tích ROC cho thấy AFP có khả năng chẩn đoán UTG tốt hơn riêng lẻ (AUC 0,796), đột biến TERT có AUC 0,632, CTNNB1 có AUC 0,532. Khi kết hợp AFP và TERT, AUC tăng lên 0,847, cải thiện đáng kể độ chính xác chẩn đoán.

### Thảo luận kết quả

- Đột biến TERT C228T là dấu hiệu sớm và đặc hiệu cho ung thư gan, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế cho thấy tần suất đột biến này cao ở bệnh nhân UTG, đặc biệt ở châu Á.

- Đột biến gen CTNNB1 tuy có tần suất thấp hơn nhưng tập trung ở các vị trí quan trọng (D32-S37), có thể liên quan đến tiến triển bệnh và biến chuyển từ u lành tính sang ác tính.

- Phương pháp Nested Realtime PCR kết hợp pNA và LNA probe giúp tăng độ nhạy và đặc hiệu, phù hợp phát hiện đột biến trên cfDNA, mở ra hướng phát hiện ung thư gan không xâm lấn, chi phí hợp lý.

- Kết quả cho thấy việc kết hợp các dấu ấn sinh học gen và AFP giúp nâng cao hiệu quả sàng lọc và chẩn đoán UTG, đặc biệt trong giai đoạn sớm, góp phần cải thiện tiên lượng bệnh nhân.

- Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ROC, bảng tần suất đột biến và biểu đồ phân bố độ tuổi, AFP giữa các nhóm bệnh để minh họa rõ ràng sự khác biệt và giá trị chẩn đoán.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Triển khai áp dụng phương pháp Nested Realtime PCR phát hiện đột biến TERT C228T** trong các trung tâm y tế lớn nhằm nâng cao khả năng sàng lọc ung thư gan không xâm lấn, mục tiêu tăng tỷ lệ phát hiện sớm lên trên 30% trong vòng 2 năm.

- **Kết hợp xét nghiệm AFP và phát hiện đột biến gen TERT** trong quy trình sàng lọc ung thư gan cho bệnh nhân có nguy cơ cao (viêm gan mạn, xơ gan), nhằm cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán, thực hiện trong 1-3 năm tới.

- **Đào tạo nhân viên y tế và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm** về kỹ thuật Nested Realtime PCR và giải trình tự gen CTNNB1 để đảm bảo chất lượng xét nghiệm, nâng cao năng lực chuyên môn trong 6-12 tháng.

- **Nghiên cứu mở rộng về đột biến gen CTNNB1** và các dấu ấn sinh học khác trên cfDNA để hoàn thiện bộ công cụ chẩn đoán ung thư gan đa chiều, hướng tới ứng dụng trong theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh trong 3-5 năm.

- **Tăng cường tuyên truyền, nâng cao nhận thức cộng đồng** về tầm quan trọng của sàng lọc ung thư gan sớm, đặc biệt ở nhóm nguy cơ cao, nhằm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư gan tại Việt Nam.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và gan mật:** Nắm bắt phương pháp mới trong chẩn đoán không xâm lấn, áp dụng trong thực hành lâm sàng để nâng cao hiệu quả phát hiện sớm ung thư gan.

- **Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y học phân tử:** Tham khảo kỹ thuật Nested Realtime PCR kết hợp pNA, LNA probe và giải trình tự gen, phục vụ nghiên cứu phát triển dấu ấn sinh học ung thư.

- **Chuyên viên phòng xét nghiệm y học:** Áp dụng quy trình tách chiết cfDNA, kỹ thuật PCR và phân tích dữ liệu để nâng cao chất lượng xét nghiệm chẩn đoán ung thư gan.

- **Nhà hoạch định chính sách y tế:** Đánh giá hiệu quả và tính khả thi của phương pháp sàng lọc ung thư gan không xâm lấn, xây dựng chương trình sàng lọc và phòng chống ung thư gan hiệu quả.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Phương pháp Nested Realtime PCR có ưu điểm gì so với các kỹ thuật khác?**  
Phương pháp này có độ nhạy cao (0,1%), độ đặc hiệu 100%, cho phép phát hiện đột biến gen trên mẫu máu ngoại vi không xâm lấn, chi phí hợp lý và kết quả dễ phân tích.

2. **Tại sao đột biến gen TERT C228T lại quan trọng trong ung thư gan?**  
Đột biến này làm tăng hoạt tính gen TERT, giúp tế bào ung thư duy trì chiều dài telomere, phát triển không kiểm soát, là dấu hiệu sớm và đặc hiệu của ung thư biểu mô tế bào gan.

3. **Đột biến gen CTNNB1 có vai trò gì trong ung thư gan?**  
Đột biến gen CTNNB1 làm tăng tích tụ β-catenin trong nhân tế bào, kích hoạt các gen tăng sinh, góp phần vào sự phát triển và tiến triển của ung thư gan.

4. **Phát hiện đột biến trên cfDNA có ưu điểm gì?**  
Phát hiện trên cfDNA không xâm lấn, có thể thực hiện nhiều lần để theo dõi tiến triển bệnh, giúp phát hiện ung thư sớm và đánh giá hiệu quả điều trị.

5. **Kết hợp AFP với đột biến gen có cải thiện chẩn đoán ung thư gan không?**  
Có, kết hợp AFP và đột biến TERT nâng cao độ chính xác chẩn đoán (AUC tăng từ 0,796 lên 0,847), giúp phát hiện ung thư gan hiệu quả hơn so với sử dụng riêng lẻ.

## Kết luận

- Đã thiết lập thành công phương pháp Nested Realtime PCR phát hiện đột biến TERT C228T trên mẫu máu ngoại vi với độ nhạy 0,1% và độ đặc hiệu 100%.  
- Tần suất đột biến TERT C228T và CTNNB1 lần lượt là 26,44% và 6,32% ở bệnh nhân ung thư gan, không phát hiện ở nhóm viêm gan mạn và xơ gan.  
- Kết hợp xét nghiệm AFP và phát hiện đột biến gen TERT cải thiện đáng kể hiệu quả chẩn đoán ung thư gan.  
- Phương pháp phát hiện đột biến gen trên cfDNA là công cụ không xâm lấn, có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc và theo dõi ung thư gan.  
- Đề xuất triển khai áp dụng kỹ thuật này trong các trung tâm y tế và nghiên cứu mở rộng để nâng cao hiệu quả phòng chống ung thư gan tại Việt Nam.

**Hành động tiếp theo:** Khuyến khích các cơ sở y tế áp dụng phương pháp này trong sàng lọc ung thư gan, đồng thời phát triển nghiên cứu về các dấu ấn sinh học gen khác để hoàn thiện bộ công cụ chẩn đoán và theo dõi bệnh.