Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chi Bacillus bao gồm các vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có hình que và khả năng tạo nội bào tử bền vững trước các điều kiện bất lợi của môi trường. Trong số các loài thuộc chi này, Bacillus thuringiensis nổi bật nhờ khả năng tổng hợp các tinh thể protein và chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính diệt côn trùng và kháng vi sinh vật gây bệnh, được ứng dụng rộng rãi trong y tế, nông nghiệp và sản xuất chế phẩm sinh học.

Sự phát triển của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) đã cho phép giải mã toàn bộ hệ gen của nhiều loài vi sinh vật với chi phí hợp lý. Tuy nhiên, phương pháp sàng lọc vi sinh vật truyền thống thường tốn thời gian, công sức và có tỷ lệ tái phát hiện cao các hợp chất đã biết. Do đó, việc ứng dụng tin sinh học để khai thác dữ liệu hệ gen (genome mining) đã trở thành hướng tiếp cận quan trọng nhằm phát hiện các cụm gen sinh tổng hợp (Biosynthetic Gene Clusters - BGCs) mã hóa cho các sản phẩm tự nhiên và chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học mới.

Mặc dù trình tự bộ gen của chủng Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 đã được công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI (mã định danh GenBank: CM000753.1), các phân tích chi tiết về đặc điểm cấu trúc bộ gen, chú thích chức năng toàn diện và đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của chủng này vẫn chưa từng được thực hiện. Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Tống Mai Linh tại Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (thực hiện năm 2022 dưới sự hướng dẫn của TS. Đinh Trường Sơn) tập trung giải quyết vấn đề này.

Mục đích của đề tài là ứng dụng các công cụ tin sinh học để khảo sát cấu trúc, thành phần hệ gen, hoạt tính sinh học và tiềm năng sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792.

Để đạt được mục đích trên, nghiên cứu đặt ra 5 nhiệm vụ cụ thể:

  1. Xác định các đặc điểm chung của hệ gene chủng Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792.
  2. Xác định vị trí phân loại của Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792.
  3. Xác định được các cụm gene liên quan tới sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong bộ genome của Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792.
  4. Phân tích Gene Ontology (xác định chức năng phân tử, quá trình chuyển hoá sinh học và vị trí của protein) và phân tích chú thích chức năng của Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792.
  5. Phân tích chi tiết con đường chuyển hóa thứ cấp của fengycin.

Đối tượng nghiên cứu là dữ liệu bộ gen hoàn chỉnh của chủng Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 truy xuất từ NCBI. Phạm vi nghiên cứu hoàn toàn là phân tích in silico bằng các cơ sở dữ liệu và phần mềm tin sinh học chuyên dụng.


Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình tiếp cận

Nghiên cứu được xây dựng trên các nền tảng lý thuyết tin sinh học và vi sinh học phân tử:

  • Phân loại học hệ gen vi khuẩn: Ứng dụng phương pháp so sánh khoảng cách bộ gen (Genome BLAST Distance Phylogeny - GBDP) nhằm xác định vị trí tiến hóa chính xác của chủng vi khuẩn so với các chủng chuẩn.
  • Bản thể luận gen (Gene Ontology - GO): Hệ thống chuẩn hóa quốc tế phân loại chức năng của sản phẩm gen thành 3 nhóm độc lập: Quá trình sinh học (Biological Process), Chức năng phân tử (Molecular Function) và Thành phần tế bào (Cellular Component).
  • Khai thác cụm gen sinh tổng hợp (BGCs): Cơ chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp như peptide không phụ thuộc ribosome (NRPS), peptide tổng hợp qua ribosome và biến đổi sau dịch mã (RiPPs), Terpene và Betalactone.
  • Con đường sinh tổng hợp lipopeptide Fengycin: Nghiên cứu cấu trúc và cụm gen mã hóa enzyme NRPS xúc tác tổng hợp chuỗi lipo-depsipeptide vòng có hoạt tính kháng nấm mạnh.

Phương pháp nghiên cứu và công cụ tin sinh học

Nghiên cứu sử dụng hệ thống các máy chủ và phần mềm tính toán trực tuyến cũng như cục bộ:

Nhiệm vụ phân tích Công cụ / Phần mềm sử dụng Thuật toán & Phương pháp tiếp cận
Dự đoán gen GeneMark (GeneMarkS-2) Dự đoán vị trí CDS và khung đọc mở dựa trên mô hình Markov ẩn
Phân tích phát sinh loài TYGS (The Type Strain Genome Server) Thuật toán FastME của GBDP, tính khoảng cách GGDC với 100 bootstrap
Chú thích chức năng & GO BLAST2GO, InterProScan BLASTx so khớp cơ sở dữ liệu NCBI nr, GO Mapping, GO Annotation
Tìm kiếm BGCs antiSMASH phiên bản 6.1, ARTS Thuật toán CLUSEAN, mô hình HMMER/Pfam, dự đoán cơ chất NRPSpredictor
Phân tích con đường Fengycin Local BLAST, cơ sở dữ liệu KEGG So sánh tương đồng trình tự nucleotide/protein với cụm gen chuẩn của B. velezensis FZB42

Nguồn dữ liệu

  • Dữ liệu hệ gen hoàn chỉnh của Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 (Accession GenBank: CM000753.1; BioProject: PRJNA29723).
  • Dữ liệu đối chứng từ 6 chủng Bacillus liên quan: B. thuringiensis str. Al Hakam (CP000485.1), B. thuringiensis BMB171 (CP001903.1), B. thuringiensis serovar tochigiensis BGSC 4Y1 (CM000746.1), B. thuringiensis Bt407 (CM000747.1), B. thuringiensis serovar thuringiensis str. T01001 (CM000748.1) và B. thuringiensis serovar pakistani.
  • Cơ sở dữ liệu phụ trợ: EZBioCloud, KEGG, Pfam, InterPro.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương này tổng kết cơ sở lý thuyết về chi Bacillus, vị trí phân loại của loài Bacillus thuringiensis (Giới: Bacteria, Ngành: Firmicutes, Lớp: Bacilli, Bộ: Bacillales, Họ: Bacillaceae, Chi: Bacillus). Tác giả trình bày đặc điểm hình thái, vòng đời 3 giai đoạn (sinh trưởng sinh dưỡng, tạo bào tử, nảy mầm) và khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng.

Nội dung đi sâu vào các nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng:

  • Lipopeptide vòng (đặc biệt là Fengycin có khả năng làm rò rỉ và ly giải màng tế bào nấm phytopathogenic).
  • Terpene (hydrocacbon công thức $(C_5H_8)_n$).
  • RiPPs (peptide tổng hợp qua ribosome và biến đổi sau dịch mã).
  • NRPS (các phức hợp megaenzyme tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome).

Chương 1 cũng giới thiệu tổng quan về sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), chiến lược súng ngắn toàn bộ hệ gen (WGS), nguyên lý các thuật toán căn chỉnh trình tự (Smith-Waterman, Needleman-Wunsch) và vai trò của tin sinh học trong việc khai thác dữ liệu bộ gen để tìm kiếm kháng sinh mới.

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết thông tin bộ gen thô của chủng ATCC 10792 (kích thước ~6,26 Mbp, dạng vòng, tỷ lệ G+C là 34,7%, gồm 6.274 gen theo NCBI/EZBioCloud) và thiết lập sơ đồ quy trình phân tích gồm 5 nội dung chính.

Tác giả trình bày chi tiết từng bước thực hiện trên các công cụ:

  • Quy trình tải và xử lý dữ liệu FASTA từ GenBank (CM000753.1).
  • Quy trình phân tích phát sinh loài trên máy chủ TYGS với 6 chủng chuẩn.
  • Quy trình 4 bước trong BLAST2GO (BLASTx mất khoảng 1 tháng tính toán cho 6.514 gen, InterProScan mất 2 ngày, Mapping mất 2 ngày, Annotation và xuất biểu đồ thống kê).
  • Quy trình nạp tệp vào antiSMASH 6.1 và ARTS để dò tìm các BGCs và gen kháng thuốc.
  • Phương pháp Local BLAST đối chiếu cụm gen chuyển hóa fengycin với các cụm gen tham chiếu trên KEGG.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả phân tích số liệu thu được:

  1. Phát sinh loài: Cây phân loại xây dựng bằng TYGS dựa trên toàn bộ bộ gen cho thấy chủng ATCC 10792 có quan hệ di truyền gần gũi nhất với hai chủng Bacillus thuringiensis Bt407 và Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis str. T01001.
  2. Dự đoán gen: So sánh số lượng gen dự đoán từ các công cụ khác nhau: EZBioCloud dự đoán 6.274 gen, ARTS đưa ra 6.366 gen, và GeneMark dự đoán 6.514 gen. Tác giả lựa chọn tập dữ liệu 6.514 gen của GeneMark cho các phân tích chức năng tiếp theo.
  3. Chú thích chức năng với BLAST2GO và InterProScan:
    • Trong 6.514 gen phân tích qua BLAST2GO, có 4.730 gen được gán chú thích GO trực tiếp qua BLAST, 1.641 gen có BLAST hits nhưng chưa gán GO trực tiếp, 41 gen qua Mapping, 71 gen qua InterProScan và chỉ có 31 gen không tìm thấy tương đồng (without hits).
    • BLAST tìm thấy 5.175 trình tự tương đồng trên NCBI, trung bình mỗi gen của chủng ATCC 10792 có 809 trình tự tương đồng, với đa số đạt độ tương đồng >95%.
    • Phân bố loài theo BLAST hits và Top-hits khẳng định độ tương đồng cao nhất với loài Bacillus thuringiensis (56.489 hits; 3.557 top-hits), tiếp theo là nhóm Bacillus cereus, Bacillus toyonensis và Bacillus anthracis.
    • Việc tích hợp thêm InterProScan đã nâng tổng số gen có thông tin GO từ 4.730 lên 5.347 gen (tăng thêm 617 gen).
    • Phân loại bản thể luận GO (tổng cộng 13.457 chú thích trên 15 cấp độ, mức 5 chiếm ưu thế):
      • Quá trình sinh học (Biological Process): 2.828 gen.
      • Chức năng phân tử (Molecular Function): 3.577 gen.
      • Thành phần tế bào (Cellular Component): 2.492 gen.
  4. Xác định các BGCs bằng antiSMASH 6.1: Xác định được 15 cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp giả định.
  5. Phân tích cụm gen sinh tổng hợp Fengycin: antiSMASH và Local BLAST xác định Cụm 5 (Cluster 5) chứa 26 gen liên quan trực tiếp đến con đường sinh tổng hợp fengycin, bao gồm 2 gen lõi (core biosynthetic genes), 5 gen sinh tổng hợp bổ sung, 2 gen vận chuyển, 3 gen điều hòa và 14 gen chức năng khác.

Kết quả và đóng góp

Dữ liệu so sánh đặc điểm hệ gen

Khóa luận đã so sánh các thông số hệ gen cơ bản của Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 với 6 chủng Bacillus liên quan:

Tên chủng Bacillus BioProject Kích thước (Mbp) Số Contig Tỷ lệ G+C (%) Số CDS Số tRNA Số rRNA
B. thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 PRJNA29723 6,26 1 34,7 6.274 91 4
B. thuringiensis str. Al Hakam - 5,26 1 35,4 5.351 104 42
B. thuringiensis BMB171 PRJNA43631 5,33 2 35,2 5.611 104 42
B. thuringiensis serovar tochigiensis BGSC 4Y1 PRJNA29713 5,62 1 34,8 5.741 84 9
B. thuringiensis Bt407 PRJNA29717 6,02 1 34,7 6.317 124 6
B. thuringiensis serovar thuringiensis str. T01001 - 6,07 1 34,7 6.356 85 6
B. thuringiensis serovar pakistani str. - - - - - - -

Chi tiết phân loại Bản thể luận Gen (Gene Ontology)

Dữ liệu phân bố 13.457 thuật ngữ GO trên 6.514 gen của chủng ATCC 10792 được thống kê chi tiết như sau:

Nhóm GO cấp 1 (Mã GO) Số gen Nhóm chức năng con Mã GO con Số gen gán
Quá trình sinh học
(Biological Process, GO:0008150)
2.828 Quá trình tế bào (Cellular process)
Quá trình trao đổi chất (Metabolic process)
Điều hòa sinh học (Biological regulation)
Vị trí (Localization)
Điều hòa quá trình sinh học (Regulation of BP)
Đáp ứng kích thích (Response to stimulus)
GO:0009987
GO:0008152
GO:0065007
GO:0051179
GO:0050789
GO:0050896
2.382
2.094
522
515
497
308
Chức năng phân tử
(Molecular Function, GO:0003674)
3.577 Hoạt tính xúc tác (Catalytic activity)
Hoạt tính liên kết (Binding)
Hoạt tính vận chuyển (Transporter activity)
GO:0003824
GO:0005488
GO:0005215
2.547
1.676
391
Thành phần tế bào
(Cellular Component, GO:0005575)
2.492 Thực thể giải phẫu tế bào (Cellular anatomical entity) GO:0110165 2.475

Phát hiện các cụm gen chuyển hóa thứ cấp

  • antiSMASH 6.1 đã phát hiện 15 cụm gen sinh tổng hợp (BGCs) giả định trong hệ gen của chủng ATCC 10792, bao gồm các nhóm: NRPS (Non-ribosomal peptide synthetase), LAP, Thiopeptide, RiPP-like, NRPS-like, Betalactone, Terpene, Lanthipeptide-class-ii.
  • Khóa luận đã bóc tách kiến trúc phân tử của Cụm 5 (Cluster 5) có kích thước lớn, chứa đầy đủ 26 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lipopeptide kháng nấm fengycin:
    • 2 gen lõi (core genes): Mã hóa enzyme tổng hợp chuỗi peptide không phụ thuộc ribosome.
    • 5 gen sinh tổng hợp bổ sung (additional biosynthetic genes): Tham gia hoàn thiện chuỗi và gắn gốc acid béo.
    • 2 gen vận chuyển (transport-related genes): Phụ trách xuất bào sản phẩm ra khỏi tế bào.
    • 3 gen điều hòa (regulatory genes): Kiểm soát mức độ biểu hiện của cụm gen.
    • 14 gen khác: Các chức năng hỗ trợ chuyển hóa liên quan.

Đóng góp của đề tài

  • Cung cấp bản chú thích chức năng hệ gen đầy đủ đầu tiên cho chủng vi khuẩn chuẩn Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792.
  • Chứng minh về mặt di truyền tiềm năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm fengycin của chủng ATCC 10792, làm cơ sở lý thuyết cho việc ứng dụng chủng này trong sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật.
  • Xây dựng quy trình tích hợp các công cụ tin sinh học (GeneMark, TYGS, BLAST2GO, InterProScan, antiSMASH, ARTS, Local BLAST) phục vụ việc khai thác bộ gen vi khuẩn hiệu quả.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Toàn bộ các kết luận về số lượng gen, chức năng protein, các cụm BGCs và con đường tổng hợp fengycin hoàn toàn dựa trên các mô hình tính toán và dự đoán tin sinh học (in silico).
  • Đề tài chưa tiến hành các thí nghiệm kiểm chứng sinh học thực tế trong phòng thí nghiệm (in vitro hoặc in vivo).
  • Chưa kiểm tra mức độ biểu hiện gen (RNA-seq hoặc RT-qPCR) của Cụm 5 trong các điều kiện nuôi cấy thực tế để xác định cụm gen có hoạt động hay ở trạng thái "ngủ" (silent gene cluster).

Hướng nghiên cứu tiếp

  1. Thiết lập quy trình nuôi cấy chủng Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 trong các môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men tối ưu để kích hoạt sự biểu hiện của Cụm gen 5.
  2. Tách chiết, tinh sạch và định danh cấu trúc hóa học của hợp chất fengycin thực tế thu nhận từ dịch nuôi cấy bằng các phương pháp phân tích hóa học hiện đại (HPLC, phổ khối MALDI-TOF MS, LC-MS/MS).
  3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm thực nghiệm của dịch chiết chứa fengycin trên các đối tượng nấm gây bệnh cây trồng quan trọng để phát triển chế phẩm thuốc trừ nấm sinh học.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các ngành Công nghệ Sinh học, Tin sinh học, Vi sinh vật học và Bảo vệ thực vật.
  • Nội dung đáng tham khảo:
    • Quy trình khai thác hệ gen hoàn chỉnh: Các bước xử lý từ tệp FASTA thô đến dự đoán gen bằng GeneMark, xây dựng cây phát sinh loài bằng TYGS (FastME/GBDP) và chú thích GO đa tầng qua BLAST2GO kết hợp InterProScan.
    • Phương pháp phân tích cụm gen BGCs: Kỹ thuật thiết lập và giải thích kết quả từ antiSMASH 6.1 và ARTS, đặc biệt là cách thức phân tích giải phẫu chức năng từng gen trong một cụm sinh tổng hợp lipopeptide (như Cụm 5 mã hóa fengycin).

Câu hỏi thường gặp

1. Đặc điểm cơ bản của hệ gen Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 là gì?

Bộ gen của chủng ATCC 10792 có cấu trúc vòng kín với kích thước 6,26 Mbp (hoặc 6.142.148 bp theo EZBioCloud) và hàm lượng G+C là 34,7%. Hệ gen chứa 91 gen tRNA, 4 gen rRNA và số lượng gen mã hóa protein được dự đoán là 6.514 gen (theo GeneMark) hoặc 6.274 gen (theo NCBI/EZBioCloud).

2. Chủng ATCC 10792 có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất với những chủng vi khuẩn nào?

Kết quả phân tích phát sinh loài bằng công cụ TYGS (sử dụng thuật toán FastME của Genome BLAST Distance Phylogeny với 100 bootstrap) cho thấy chủng Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792 có quan hệ di truyền gần gũi nhất với hai chủng: Bacillus thuringiensis Bt407 (PRJNA29717) và Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis str. T01001.

3. Việc kết hợp InterProScan với BLAST2GO mang lại hiệu quả ra sao trong việc chú thích bản thể luận gen (GO)?

Công cụ BLAST ban đầu tìm thấy thông tin GO cho 4.730 trình tự trong tổng số 6.514 gen. Khi tích hợp thêm cơ sở dữ liệu InterProScan, số lượng trình tự được gán thuật ngữ GO tăng lên 5.347 trình tự (tăng thêm 617 gen), giúp giảm số lượng gen chưa rõ chức năng xuống còn 1.167 trình tự.

4. Công cụ antiSMASH 6.1 đã phát hiện những nhóm cụm gen sinh tổng hợp (BGCs) nào trong bộ gen chủng ATCC 10792?

antiSMASH 6.1 đã phát hiện tổng cộng 15 cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp giả định, bao gồm các nhóm: enzym tổng hợp peptide không qua ribosome (NRPS), LAP, Thiopeptide, RiPP-like, NRPS-like, Betalactone, Terpene và Lanthipeptide-class-ii.

5. Cụm gen sinh tổng hợp Fengycin (Cluster 5) có cấu trúc và thành phần các gen như thế nào?

Cụm gen 5 (Cluster 5) trong hệ gen của chủng ATCC 10792 gồm 26 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp lipopeptide kháng nấm fengycin. Cụm này gồm có 2 gen lõi (core biosynthetic genes mã hóa NRPS), 5 gen sinh tổng hợp bổ sung, 2 gen vận chuyển, 3 gen điều hòa và 14 gen chức năng phụ trợ khác.


Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Tống Mai Linh đã ứng dụng thành công các công cụ tin sinh học chuyên sâu (GeneMark, TYGS, BLAST2GO, InterProScan, antiSMASH 6.1 và Local BLAST) để phân tích toàn diện hệ gen chủng Bacillus thuringiensis serovar berliner ATCC 10792. Nghiên cứu đã xác định kích thước hệ gen 6,26 Mbp với 6.514 gen dự đoán, phân loại chi tiết 13.457 thuật ngữ GO và làm sáng tỏ vị trí phân loại của chủng trong mối quan hệ gần gũi với B. thuringiensis Bt407. Điểm nổi bật nhất của công trình là phát hiện 15 cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó bóc tách chi tiết cấu trúc Cụm 5 gồm 26 gen mã hóa con đường sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm fengycin. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu học thuật quan trọng cho các nghiên cứu thực nghiệm tiếp theo nhằm tách chiết và ứng dụng các chế phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn này.