MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trên thế giới, cà chua (Solanum lycopersicum) là cây rau ăn quả quan trọng đƣợc hầu hết các nƣớc quan tâm và phát triển vì có giá trị dinh dƣỡng và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Theo thống kê của FAO (2010), diện tích cà chua sản xuất năm 2009, đạt 5.883 ha tăng 30% so với năm 2000. Năng suất 28,39 tấn/ha (năm 2009), sản lƣợng đạt 141.
Tại Việt Nam, cây cà chua đƣợc chú trọng đẩy mạnh đầu tƣ phát triển để nâng cao năng suất và chất lƣợng sản phẩm. Số liệu thống kê năm 2013, năm 2012 diện tích trồng cà chua cả nƣớc đạt 23.917,8 ha, tăng 11,3% so với năm 2010 (21. Năng suất trung bình 252,6 - 257,9 tạ/ha, sản lƣợng đạt 616.Tuy nhiên, quá trình sản xuất cà chua gặp nhiều khó khăn trở ngại, bởi rất nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ tuyến trùng, vi khuẩn và nấm bệnh.Sản xuất cà chua tại các vùng trong cả nƣớc đang chịu tổn thất nghiêm trọng do bệnh vàng lá chết chậm mà nguyên nhân gây bệnh chủ yếu do tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne spp. Đây đƣợc coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong ngành nông nghiệp.
Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp thế giới và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng khí hậu khác nhau và gây thiệt hại nặng về kinh tế cho cây cà chua. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng một số loại thuốc đặc hiệu nhƣ Furadan, Marshal, Oncol, Nokap, Vimoca.Tuy nhiên, những loại thuốc này thƣờng có giá thành cao, hiệu quả giảm mật số tuyến trùng không ổn định. Mặt khác, việc sử dụng thuốc có nguồn gốc hóa học trong thời gian dài sẽ dẫn đến hiện tƣợng kháng thuốc, mất cân bằng hệ sinh vật và vi sinh vật đất, dễ dẫn đến hiện tƣợng bộc phát các dịch bệnh khác và đặc biệt là ảnh hƣởng môi trƣờng và tồn dƣ thuốc trong nông sản (Hoàng Ngọc Duyên, 2010). Đứng trƣớc tình hình đó, việc nghiên cứu và chọn lọc vi sinh vật bản địa có tính ký sinh, đối kháng cao trên tuyến trùng cây cà chua là vấn đề đáng quan tâm, nhằm giảm thiệt hại và nâng cao năng suất, sản lƣợng, chất lƣợng sản phẩm.
Một trong những biện pháp hiệu quả góp phần đảm bảo an toàn cho con ngƣời và không gây ô nhiễm môi trƣờng là dùng biện pháp sinh học để phòng trừ. Bacillus thuringiensis (Bt) đã đƣợc báo cáo là một tác nhân kiểm soát tiềm năng đối với một số tuyến trùng (Borgonie et al., 1996; Marroquin và cs, 2000; Griffitts và cs, 1 2001). zuckerman và cs đã đánh giá về hiệu quả vi khuẩn Bacillus thuringiensis CR ‐ 371 trong việc kiểm soát tuyến trùng ký sinh trên cây cà chua.H Mohammed và cs đã đánh giá về hiệu quả kiểm soát sinh học của độc tố Bacillus thuringiensis chống lại tuyến trùng nút rễ trên cây cà chua. Theo tác giả các chủng phân lập Bt7N, BtDen, Bt18, BtK73, BtSoto và Bt7 cho thấy các hoạt động diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita cao nhất (86 -100%).
Ở Việt Nam, chƣa có nhiều nghiên cứu về B. thuringiensis kiểm soát tuyến trùng. Việc phòng ngừa truyến trùng chủ yếu dựa vào các tác nhân hóa học. Sử dụng các tác nhân sinh học nhƣ B.
thuringiensis để kiểm soát tuyến trùng đang là một hƣớng đi mới, đầy hứa hẹn trong tƣơng lai. Nhằm góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của nguồn tài nguyên vi sinh vật bản địa vốn rất phong phú, có tác dụng phòng ngừa tác nhân gây bệnh trên cây cà chua chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn Bacillus thuringiensis phòng trừ tuyến trùng trên cây cà chua”. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà chua.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.
Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà chua. Ý nghĩa thực tiễn Chủng B. Thuringiensis tuyển chọn đƣợc sẽ góp phần quan trọng trong việc ứng dụng biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng hiệu quả và an toàn với môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời.
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ BACILLUS THURINGIENSIS 1. Lịch sử phát hiện Bacillus thuringiensis Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm, ông đặt tên là Bacillus bombyces. Vào năm 1901, nhà sinh vật học Nhật Bản Shigenete Ishiwarti tìm ra nguyên nhân gây nên cái chết đột ngột của một số sâu tơ, gọi tên là Bacillus sotto. Năm 1915, Ernst Berliner ở Đức đã phát hiện ra Bacillus thuringiensis, khi ấy ông cũng cho rằng nó là nguyên nhân của bệnh đƣợc gọi là Schlaffsucht ở trên xác ấu trùng bƣớm Địa Trung Hải.
Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis (Ngô Đình Bính, 2005). Cũng vào năm 1915, Berliner đã phát hiện ra sự hiện diện tinh thể ký sinh gần với bào tử (Saadeldin Mudawi Osman Mudawi, 2007). Năm 1958 tại Hoa Kỳ, việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học dựa trên B. thuringiensis (Margalit et al.
Các sản phẩm của B. thuringiensis là các tác nhân sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để kiểm soát Diptera (Goldberg và Margalit, 1977) và Coleoptera (Krieg et al. Bacillus thuringiensis dƣờng nhƣ là sinh vật bản địa của nhiều môi trƣờng (Bernhard et al. thuringiensis đã đƣợc phân lập trên toàn thế giới từ nhiều môi trƣờng sống bao gồm: (i) Đất: Bào tử B.
thuringiensis tồn tại trong đất và tạo ra các tế bào sinh dƣỡng khi điều kiện thuận lợi chiếm ƣu thế (Martin và Travers, 1989). (ii) Môi trƣờng dƣới nƣớc: Nhiều phân loài B. thuringiensis đƣợc phân lập từ môi trƣờng sống dƣới nƣớc, đặc biệt là mục tiêu Diptera (Meadows, 1993). (iii) Bề mặt thực vật: Trong môi trƣờng sống này, các chủng B.
thuringiensis đã đƣợc phân lập rộng rãi từ phylloplanes của cây, rau, cây trồng trên đồng ruộng và bụi sản phẩm đƣợc lƣu trữ (Meadows et al. Ngoài ra, chúng đƣợc phân lập từ lá rụng lá và lá kim (Kaelin et al. (iv) Côn trùng: Nhiều nhà nghiên cứu đã phân lập đƣợc B. thuringiensis subsp từ ấu trùng côn trùng và nhộng chết (Carozzi et al.
3 (v) Không khí: Có một chủng B. thuringiensis đã đƣợc phân lập từ ứng dụng trên không có tên B. thuringiensis var kurstaki và sự hiện diện của nó đã đƣợc chứng minh trong không khí tới 17 ngày (Swadener, 1994). Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis a.
Vị trí phân loại Bacillus thuringiensis đƣợc xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes. Nhóm này gồm hơn 20 loài khác nhau, ngoài B. thuringiensis còn có vi khuẩn B. cereus (vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm), vi khuẩn B.
Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thƣờng đƣợc coi là vi khuẩn đất, sống trong môi trƣờng đất, côn trùng và bề mặt tiếp xúc với côn trùng (Eugene và cs, 2000). Đặc điểm hình thái B. thuringiensis hình que có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào, bắt màu Gram dƣơng. thuringiensis hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc.
Mỗi tế bào B. thuringiensis có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc có bản chất protein có khả năng diệt côn trùng. Kích thƣớc tế bào khoảng 0,8 - 1,4µm x 2,5 – 10µm (Nguyễn Xuân Cảnh và cs, 2004). Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích thƣớc 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm, quá trình hình thành bào tử không làm thay đổi hình dạng tế bào.
Hình ảnh bào tử và tinh thể vi khuẩn B. thuringiensis Mũi tên đỏ: bào tử; mũi tên xanh: tinh thể. (EFSA BIOHAZ Panel, 2016) Hầu hết các chủng B. thuringiensis đều tổng hợp protein tinh thể.
Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng, kích thƣớc và số lƣợng khác nhau, tuy nhiên các 4 protein tinh thể này mang đặc điểm chung là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng. Khi ở trong tế bào sinh dƣỡng, tinh thể thƣờng nằm kề với bào tử; khi tế bào tan, tinh thể và bào tử đều thoát ra ngoài (Dean, 1984). Trong môi trƣờng lỏng, B. thuringiensis có khả năng chuyển động, khả năng này có đƣợc là nhờ các lông roi trên bề mặt tế bào có kích thƣớc lớn hơn 0,9 µm (Thiery và Frachon, 1997).
thuringiensis đƣợc xem nhƣ là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trƣờng khác nhau nhƣ côn trùng, thực vật, đất và bụi khi lƣu trữ nông sản (Ibrahim và cs, 2008) c. Đặc điểm sinh hóa B. thuringiensis không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng arrabinoza, xylose, manitol, nhƣng sinh axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose; có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat. thuringiensis có khả năng sinh trƣởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45oC.
Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng là 28 - 30oC. thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ƣu cho sự phát triển của B. thuringiensis là pH = 7. thuringiensis có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas (Ngô Đình Bính và cs, 2000).
Đặc điểm phân loại Có nhiều phƣơng pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu, cụ thể: - Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa: B. thuringiensis đƣợc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa kết hợp với các phƣơng pháp phân loại đã đƣợc mô tả bởi Claus và Berkeley (1986), Logan và Devos (2009). Đây đƣợc xem là công cụ hiệu quả trong việc phân loại các vi khuẩn sinh bào tử nhƣ B.
Tuy nhiên phân loại theo phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc các chủng B. thuringiensis một cách rõ ràng bởi vì B. thuringiensis có các đặc điểm hình thái, sinh lý, 5 sinh hóa rất giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử B. - Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên H (de Barjac và Bonnefoi, 1962; 1973): Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại B.
thuringiensis bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp…Phƣơng pháp phân loại theo typ huyết thanh H đƣợc sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao.