Tách Biệt và Lựa Chọn Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Tolerant Mặn

Đất nhiễm mặn là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất cây trồng và an ninh lương… 53 trang · Vietnam National University of Agriculture · 2022.

• Tác giả: Do Van Thao
• Người hướng dẫn: Dr. Bui Thi Thu Huong
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Tách Biệt và Lựa Chọn Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Tolerant Mặn
• Loại tài liệu: undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENTS
• CONTENTS
• 1. OVERVIEW OF SALT-CONTAMINATED SOIL
• 1.1. Definition
• 1.2. Causes of salty soil formation
• 2. THE ACTUALITY STUDIES OF SALT-TOLERANCE BACTERIA IN THE WORLD AND VIETNAM
• 2.1. The actuality studies of salt-tolerance bacteria in the world
• 2.2. The actuality studies of salt-tolerance bacteria in Vietnam
• 3. SOIL MICROORGANISMS AND ROLES FOR CROPS
• 3.1. The role of nutritional metabolism
• 4. MATERIALS AND METHODS
• 4.1. Study time and area
• 4.2. Collection of samples
• 4.3. Preservation of the sample
• 4.4. Determination of soil pH
• 4.5. Assess the suitability of the method of preserving freeze and dry varieties
• 5. RESULTS AND DISCUSSION
• 5.1. Screening and evaluation of nitrogen fixation activity
• 5.2. Colony morphology and cell morphology of N10
• 5.3. Assessment of salt tolerance of nitrogen fixed strain N10
• 5.4. Nitrogen fixed strain identification N10
• 5.5. Assess the suitability of the method of preserving freeze-dried varieties
• 6. CONCLUSION AND RECOMMENDATION
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• ABSTRACT
• INTRODUCTION

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Chịu Mặn Giới Thiệu

Đất nhiễm mặn là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất cây trồng và an ninh lương thực toàn cầu. Sự xâm nhập mặn do nhiều nguyên nhân, bao gồm tưới tiêu không hợp lý, mực nước biển dâng và biến đổi khí hậu. Vi khuẩn cố định nitơ (nitrogen fixation) đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì độ phì nhiêu của đất, đặc biệt là trong điều kiện khắc nghiệt. Nghiên cứu tập trung vào việc tách biệt vi khuẩn (isolation of bacteria) và chọn lọc vi khuẩn (selection of bacteria) có khả năng cố định nitơ trong môi trường mặn là rất cần thiết. Các vi sinh vật cố định nitơ này có thể được sử dụng để phát triển các loại phân bón sinh học, giúp cải thiện sức khỏe của đất và năng suất cây trồng trong các khu vực bị ảnh hưởng bởi độ mặn cao. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc phân lập và lựa chọn các chủng vi khuẩn cố định nitơ chịu mặn (halophilic) từ quần đảo Trường Sa, nơi điều kiện đất đai khắc nghiệt và độ mặn cao.

1.1. Tầm Quan Trọng của Vi Khuẩn Cố Định Đạm Chịu Mặn

Trong bối cảnh biến đổi khí hậu và gia tăng xâm nhập mặn, việc tìm kiếm và ứng dụng các giải pháp sinh học để cải thiện năng suất cây trồng trên đất mặn trở nên vô cùng cấp thiết. Vi khuẩn cố định đạm (nitrogen fixation) chịu mặn không chỉ cung cấp nguồn đạm tự nhiên cho cây trồng mà còn giúp cải thiện cấu trúc đất, tăng khả năng giữ nước và giảm thiểu tác động tiêu cực của độ mặn (salt tolerance). Việc ứng dụng vi sinh vật chịu mặn này mang lại lợi ích kinh tế và môi trường bền vững.

1.2. Ứng Dụng Thực Tế Từ Nghiên Cứu Đến Sản Xuất Phân Bón Sinh Học

Nghiên cứu về tách biệt vi khuẩn (isolation of bacteria) cố định nitơ chịu mặn có thể mở ra tiềm năng sản xuất phân bón sinh học chất lượng cao, phù hợp với điều kiện đất mặn ven biển và hải đảo. Phân bón sinh học từ vi khuẩn cố định nitơ trong đất mặn không chỉ giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học mà còn góp phần bảo vệ môi trường, giảm thiểu ô nhiễm và cải thiện chất lượng nông sản.

II. Vấn Đề Đất Mặn Ảnh Hưởng Giải Pháp Sinh Học

Đất mặn gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng cho nông nghiệp, bao gồm giảm khả năng hấp thụ nước của cây, thiếu hụt dinh dưỡng và tích tụ các ion độc hại. Ảnh hưởng của độ mặn đến vi khuẩn là một yếu tố quan trọng cần xem xét, vì độ mặn cao có thể ức chế hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong đất. Các giải pháp sinh học, chẳng hạn như sử dụng vi sinh vật cố định nitơ (Nitrogen fixation) chịu mặn, có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của đất mặn và cải thiện năng suất cây trồng. Việc tìm hiểu đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ chịu mặn (Salt tolerance) là cần thiết để phát triển các giải pháp hiệu quả.

2.1. Tác Động Tiêu Cực của Độ Mặn Lên Sinh Trưởng Cây Trồng

Độ mặn cao trong đất làm giảm khả năng hấp thụ nước và dinh dưỡng của cây trồng, dẫn đến còi cọc, giảm năng suất và thậm chí là chết cây. Sự tích tụ các ion natri (Na+) và clo (Cl-) trong tế bào thực vật gây ra rối loạn trao đổi chất, ức chế quá trình quang hợp và hô hấp, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của cây. Hình 2 trong tài liệu gốc cho thấy ảnh hưởng của muối đến sự hấp thu nước ở cây trồng.

2.2. Vai Trò Của Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Trong Cải Tạo Đất Mặn

Vi khuẩn cố định nitơ (Nitrogen fixation) có khả năng chuyển đổi nitơ trong khí quyển thành dạng amoni (NH4+), một dạng nitơ dễ hấp thụ cho cây trồng. Việc sử dụng vi khuẩn cố định đạm (nitrogen fixation) chịu mặn giúp tăng cường nguồn nitơ tự nhiên trong đất, cải thiện độ phì nhiêu và hỗ trợ sự phát triển của cây trồng trong điều kiện mặn. Các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn (Salt tolerance) cao có thể tồn tại và hoạt động hiệu quả trong môi trường khắc nghiệt này.

2.3. Ứng dụng vi khuẩn cố định nitơ Nitrogen fixation Giải pháp bền vững cho đất mặn

Sử dụng vi khuẩn cố định nitơ là một giải pháp bền vững để cải thiện đất mặn vì nó giảm nhu cầu sử dụng phân bón hóa học, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và cải thiện sức khỏe của đất. Điều này giúp tăng năng suất cây trồng một cách bền vững trong các khu vực bị ảnh hưởng bởi độ mặn.

III. Phương Pháp Tách Biệt Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Chịu Mặn Hiệu Quả

Việc tách biệt vi khuẩn (isolation of bacteria) cố định nitơ chịu mặn đòi hỏi các phương pháp đặc biệt để đảm bảo thu được các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn và cố định nitơ hiệu quả. Các phương pháp này bao gồm thu thập mẫu đất từ các khu vực có độ mặn cao, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc có chứa nồng độ muối cao và tiến hành các thử nghiệm để đánh giá khả năng cố định nitơ và khả năng chịu mặn của vi khuẩn.

3.1. Thu Thập Mẫu Đất Mặn Yếu Tố Quan Trọng Ban Đầu

Mẫu đất nên được thu thập từ các khu vực có độ mặn cao đã được xác định, chẳng hạn như vùng ven biển, đất ngập mặn hoặc đất canh tác bị nhiễm mặn. Mẫu đất nên được thu thập ở độ sâu khác nhau và bảo quản đúng cách để đảm bảo sự sống sót của các vi sinh vật trong quá trình vận chuyển và phân tích. Phần 'MATERIALS AND METHODS' trong tài liệu gốc mô tả chi tiết về việc thu thập mẫu.

3.2. Môi Trường Nuôi Cấy Chọn Lọc Bí Quyết Tìm Kiếm Vi Khuẩn

Môi trường nuôi cấy chọn lọc nên chứa nồng độ muối cao (ví dụ: 3-6% NaCl) để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không chịu mặn và tạo điều kiện cho vi sinh vật chịu mặn (salt tolerance) phát triển. Các thành phần dinh dưỡng trong môi trường cũng cần được tối ưu hóa để hỗ trợ quá trình cố định nitơ. Các phương pháp phân lập vi khuẩn sẽ có tính chọn lọc cao.

3.3. Đánh Giá Khả Năng Cố Định Nitơ Thử Nghiệm Quan Trọng Nhất

Các thử nghiệm để đánh giá khả năng cố định nitơ có thể bao gồm đo lượng amoni (NH4+) được tạo ra bởi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, sử dụng phương pháp acetylene reduction assay (ARA) để đo hoạt tính nitrogenase và sử dụng các phương pháp phân tích gen để xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến quá trình cố định nitơ.

IV. Chọn Lọc Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Chịu Mặn Tiêu Chí Phương Pháp

Sau khi tách biệt vi khuẩn (isolation of bacteria), bước tiếp theo là chọn lọc vi khuẩn (selection of bacteria) có khả năng cố định nitơ và chịu mặn tốt nhất. Các tiêu chí chọn lọc bao gồm khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ mặn cao, khả năng cố định nitơ cao, khả năng tạo ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR) và khả năng cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong đất. Việc định danh vi khuẩn cũng rất quan trọng.

4.1. Đánh Giá Khả Năng Sinh Trưởng trong Điều Kiện Mặn

Các chủng vi khuẩn nên được kiểm tra khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ mặn khác nhau để xác định mức độ chịu mặn tối ưu. Khả năng sinh trưởng có thể được đánh giá bằng cách đo mật độ tế bào hoặc quan sát sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường thạch. Bảng 4 trong tài liệu gốc đề cập đến khả năng chịu mặn của chủng N10.

4.2. Đo Lường Hiệu Quả Cố Định Nitơ Phương Pháp Phân Tích

Hiệu quả cố định nitơ có thể được đo lường bằng cách xác định lượng amoni (NH4+) được tạo ra bởi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Các phương pháp phân tích hóa học như phương pháp Kjeldahl hoặc phương pháp Nessler có thể được sử dụng để xác định nồng độ amoni. Số liệu ở phần 'RESULTS AND DISCUSSION' đề cập đến nồng độ amoni được tạo ra bởi các vi khuẩn phân lập được.

4.3. Kiểm Tra Khả Năng PGPR Lợi Ích Bổ Sung Cho Cây Trồng

Nhiều vi khuẩn cố định nitơ (Nitrogen fixation) có khả năng tạo ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), chẳng hạn như auxin, cytokinin và gibberellin. Những chất này có thể thúc đẩy sự phát triển của rễ, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng và bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh. Việc kiểm tra khả năng PGPR có thể giúp chọn lọc các chủng vi khuẩn có lợi cho cây trồng.

V. Ứng Dụng Vi Khuẩn Cố Định Nitơ Chịu Mặn Nghiên Cứu Trường Sa

Nghiên cứu tại Trường Sa cho thấy tiềm năng lớn của việc sử dụng vi khuẩn cố định nitơ (Nitrogen fixation) chịu mặn để cải thiện điều kiện đất đai và hỗ trợ sản xuất nông nghiệp. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn bản địa, thích nghi với môi trường khắc nghiệt, có thể mang lại hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng các chủng vi khuẩn từ các khu vực khác. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chủng N10 có quan hệ gần gũi với Bacillus megaterium NA10.

5.1. Kết Quả Nghiên Cứu Phân Lập Định Danh Chủng N10

Nghiên cứu đã phân lập được chủng N10 từ quần đảo Trường Sa và xác định nó có quan hệ gần gũi với Bacillus megaterium NA10 dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA (Hình 10 trong tài liệu gốc). Chủng N10 thể hiện khả năng cố định nitơ và chịu mặn tốt, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong cải tạo đất mặn tại khu vực này.

5.2. Tiềm Năng Phát Triển Phân Bón Sinh Học cho Trường Sa

Việc sử dụng chủng N10 hoặc các chủng vi khuẩn cố định đạm (nitrogen fixation) chịu mặn khác có thể giúp phát triển các loại phân bón sinh học phù hợp với điều kiện đất đai tại Trường Sa. Phân bón sinh học này có thể cung cấp nguồn nitơ tự nhiên cho cây trồng, cải thiện độ phì nhiêu của đất và giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học.

5.3. Bảo Quản Chủng Vi Khuẩn Phương Pháp Đông Khô Hiệu Quả

Nghiên cứu đánh giá tính phù hợp của phương pháp đông khô (freeze-drying) để bảo quản các chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể duy trì mật độ tế bào vi khuẩn sau thời gian bảo quản, đảm bảo nguồn giống cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo (Bảng 5 trong tài liệu gốc).

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Vi Khuẩn Chịu Mặn

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tách biệt vi khuẩn (isolation of bacteria) và chọn lọc vi khuẩn (selection of bacteria) cố định nitơ chịu mặn từ quần đảo Trường Sa. Chủng N10, có quan hệ gần gũi với Bacillus megaterium NA10, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong cải tạo đất mặn. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, đánh giá hiệu quả của chủng N10 trong điều kiện thực tế và phát triển các loại phân bón sinh học phù hợp với điều kiện địa phương.

6.1. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Nuôi Cấy để Tăng Hiệu Quả Cố Định Đạm

Nghiên cứu cần tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định nitơ, chẳng hạn như nhiệt độ, pH, nồng độ muối và nguồn carbon. Việc xác định các điều kiện tối ưu có thể giúp tăng hiệu quả cố định nitơ của vi khuẩn và cải thiện hiệu suất sản xuất phân bón sinh học.

6.2. Đánh Giá Hiệu Quả trên Đồng Ruộng Bước Quan Trọng Tiếp Theo

Các thử nghiệm trên đồng ruộng cần được tiến hành để đánh giá hiệu quả của chủng N10 hoặc các chủng vi khuẩn cố định nitơ (Nitrogen fixation) chịu mặn khác trong điều kiện thực tế. Các thử nghiệm này nên được thực hiện trên các loại cây trồng khác nhau và ở các địa điểm khác nhau để xác định phạm vi ứng dụng của vi khuẩn.

6.3. Nghiên Cứu Chuyên Sâu Về Cơ Chế Chịu Mặn Của Vi Khuẩn

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế chịu mặn của vi khuẩn cố định nitơ (Nitrogen fixation) có thể giúp xác định các gen và protein liên quan đến khả năng chịu mặn. Thông tin này có thể được sử dụng để cải thiện khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn hoặc để phát triển các loại cây trồng chịu mặn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán và xâm nhập mặn đang diễn biến ngày càng phức tạp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp cũng như đời sống dân sinh tại các vùng duyên hải và hải đảo của Việt Nam. Bên cạnh tác động từ tự nhiên, việc lạm dụng phân bón vô cơ hóa học qua nhiều năm cũng thúc đẩy nhanh quá trình mặn hóa đất canh tác. Đất mặn chứa nồng độ muối hòa tan cao làm gia tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch đất, hàm lượng natri trao đổi lớn gây suy giảm tính chất vật lý của đất, đồng thời làm giảm khả năng hấp thu nước và các khoáng chất thiết yếu của rễ cây.

Theo số liệu từ Bản đồ Đất mặn Toàn cầu do Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) công bố vào tháng 10/2021, toàn thế giới có hơn 833 triệu hecta đất bị nhiễm mặn (chiếm 8,7% diện tích bề mặt hành tinh). Mỗi năm, đất mặn làm mất đi khoảng 1,5 triệu hecta đất canh tác nông nghiệp, gây thiệt hại kinh tế ước tính từ 27,3 đến 31 tỷ USD. Tại Việt Nam, diện tích đất mặn chiếm khoảng 1 triệu hecta (tương đương 3% tổng diện tích tự nhiên), tập trung chủ yếu tại Đồng bằng sông Cửu Long và các tỉnh ven biển miền Trung. Đặc biệt tại quần đảo Trường Sa, điều kiện thổ nhưỡng vô cùng khắc nghiệt, đất đai khô cằn và nhiễm mặn nghiêm trọng khiến việc trồng trọt rau xanh phục vụ quân và dân gặp rất nhiều trở ngại. Các biện pháp truyền thống như vận chuyển đất màu và lương thực từ đất liền ra đảo tốn kém nhiều chi phí và khó mang tính bền vững lâu dài. Việc khai thác các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng thích nghi với điều kiện mặn để cố định nitơ sinh học là giải pháp sinh thái thiết thực nhằm cải tạo đất.

Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học của tác giả Đỗ Văn Thảo (Lớp K62CNSHE, Học viện Nông nghiệp Việt Nam), thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Bùi Thị Thu Hướng và PGS.TS. Đồng Huy Giới, tập trung giải quyết bài toán trên thông qua việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn bản địa.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài:

• Mục tiêu tổng quát: Phân lập thành công và tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitơ chịu mặn có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện độ mặn cao để định hướng ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh.
• Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
  1. Phân lập các chủng vi sinh vật chịu mặn từ các mẫu đất thu thập tại quần đảo Trường Sa trên môi trường chuyên dụng.
  2. Đánh giá hoạt tính cố định nitơ thông qua khả năng sinh tổng hợp amoni của các chủng phân lập được, từ đó lựa chọn chủng có hoạt tính cao nhất.
  3. Đánh giá đặc tính sinh học, khả năng chịu mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau và định danh phân tử chủng vi khuẩn tiềm năng.
  4. Đưa chủng vi khuẩn đã chọn lọc vào quy trình bảo quản đông khô và đánh giá độ ổn định mật độ tế bào theo thời gian.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu đất nhiễm mặn được thu thập tại khu vực vườn rau, đất quanh gốc cây lâu năm và đất ven biển trên quần đảo Trường Sa.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 05 năm 2022.
• Địa điểm thực nghiệm: Viện Hóa học và Vật liệu thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

• Khái niệm và đặc tính đất mặn: Đất mặn trong nông nghiệp là loại đất có nồng độ muối hòa tan cao vượt ngưỡng bình thường, thường có độ dẫn điện (EC) lớn hơn $4\text{ mmho/cm}$ (hay $4\text{ dS/m}$) và độ pH thông thường dưới 8,0. Các loại muối phổ biến gồm $\text{NaCl}$, $\text{CaCl}_2$, $\text{CaSO}_4$, $\text{MgSO}_4$, $\text{KCl}$ và $\text{Na}_2\text{SO}_4$. Nồng độ muối cao làm giảm khả năng hút nước của rễ do áp suất thẩm thấu dung dịch đất tăng, ức chế quang hợp, phá hủy cấu trúc màng tế bào và gây tích tụ các ion độc hại cho cây.
• Chu trình chuyển hóa Nitơ: Chu trình nitơ tự nhiên bao gồm 5 mắt xích chính: Cố định nitơ (Nitrogen fixation), Nitrat hóa (Nitrification), Đồng hóa (Assimilation), Amôn hóa (Ammonification) và Phản nitrat hóa (Denitrification). Khí nitơ trơ ($N_2$) trong khí quyển được vi sinh vật chuyển hóa thành dạng cây trồng hấp thu được ($NH_3/NH_4^+$).
• Cơ chế cố định nitơ sinh học (BNF): Quá trình khử $N_2$ thành $NH_3$ diễn ra nhờ sự xúc tác của phức hệ enzyme nitrogenase (gồm hai thành phần protein kim loại Mo-Fe protein và Fe-protein). Phương trình phản ứng tổng quát tiêu tốn năng lượng sinh học: $$\text{N}_2 + 16\text{ Mg-ATP} + 8\text{ e}^- + 8\text{ H}^+ \rightarrow 2\text{NH}_3 + \text{H}_2 + 16\text{ Mg-ADP} + 16\text{ P}_i$$
• Nhóm vi sinh vật cố định đạm: Gồm vi sinh vật sống tự do (như Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Klebsiella), vi sinh vật hội sinh vùng rễ (như Azospirillum) và vi sinh vật cộng sinh (như Rhizobium, Bradyrhizobium tạo nốt sần ở cây họ Đậu; Anabaena azollae cộng sinh với bèo hoa dâu Azolla).

Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp lấy và xử lý mẫu đất: Thu thập tầng đất mặt ($0 - 4\text{ cm}$) theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7538-6:2010 bằng dụng cụ vô trùng, đựng trong túi polythene chuyên dụng, dán nhãn và bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ tại phòng thí nghiệm.
• Xác định pH đất: Lấy 25 g đất hòa trong 50 ml nước cất vô trùng, khuấy đều bằng máy vortex và đo bằng máy đo pH kỹ thuật số.
• Phương pháp phân lập vi sinh vật cố định đạm: Sử dụng phương pháp pha loãng nồng độ tới hạn ($10^{-3} - 10^{-5}$) từ huyền phù 10 g đất trong 90 ml nước cất vô trùng; cấy gạt 1 ml dịch pha loãng lên môi trường thạch Ashby (Ashby’s Mannitol Agar) bổ sung $3%\text{ NaCl}$; ủ ở nhiệt độ $28 \pm 2^\circ\text{C}$ trong thời gian từ 2 đến 3 ngày.
• Phương pháp định lượng hoạt tính cố định đạm: Cấy 1 ml dịch vi khuẩn ($10^8\text{ CFU/ml}$) vào môi trường lỏng Ashby, nuôi cấy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút, nhiệt độ $30^\circ\text{C}$ trong 4 ngày (96 giờ) hoặc $37^\circ\text{C}$ trong 8 ngày. Thu dịch nổi qua ly tâm ($10000\text{ rpm}$ trong 5 phút) và định lượng hàm lượng amoni giải phóng bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Nessler/đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng $\text{OD}_{625\text{nm}}$.
• Phương pháp đánh giá khả năng chịu mặn: Nuôi cấy chủng tuyển chọn trong môi trường dịch thể Ashby ở các dải nồng độ NaCl khác nhau ($0%$, $2%$, $4%$, $6%$, $8%$, $10%$), theo dõi sinh trưởng thông qua đo mật độ quang $\text{OD}_{600}$.
• Phương pháp định danh sinh học phân tử: Chiết tách DNA tổng số, khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuẩn 27F/1525R. Sản phẩm PCR được giải trình tự, so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank và xây dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree) bằng phương pháp Neighbor-Joining với hệ số lặp lại bootstrap 1.000 lần.
• Phương pháp bảo quản chủng bằng kỹ thuật đông khô: Thực hiện quy trình bảo quản chủng vi sinh vật nông nghiệp theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9299:2014; theo dõi mật độ tế bào sống ($\text{CFU/ml}$) trước đông khô, ngay sau đông khô và định kỳ sau 1 tuần, 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần bảo quản.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Mở đầu (Introduction)

Chương I trình bày tổng quan về tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng hạn mặn, xâm nhập mặn nghiêm trọng tại các đảo và quần đảo của Việt Nam, đặc biệt là quần đảo Trường Sa (cách đất liền 208 hải lý). Tác giả phân tích những hạn chế của các giải pháp cải tạo đất hiện hành và chỉ ra tính cần thiết của việc khai thác tập đoàn vi sinh vật chịu mặn bản địa nhằm phát triển phân bón hữu cơ vi sinh, phục vụ canh tác nông nghiệp tự chủ rau xanh trên đảo. Từ đó, chương xác định rõ mục đích nghiên cứu và các yêu cầu kỹ thuật cần đạt được.

Chương II: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương này tổng hợp hệ thống lý luận và tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đề tài:

• Tổng quan về đất nhiễm mặn: Định nghĩa đất mặn nông nghiệp, cơ chế cản trở hút nước của rễ cây, tác động của sự tích tụ ion $\text{Cl}^-$, $\text{SO}_4^{2-}$, $\text{Ca}^{2+}$, $\text{Mg}^{2+}$, $\text{K}^+$, $\text{Na}^+$ và các nguyên nhân khách quan (tự nhiên, xâm nhập mặn) lẫn chủ quan (tưới tiêu không hợp lý, lạm dụng phân bón).
• Tình hình nghiên cứu vi sinh vật chịu mặn trên thế giới và Việt Nam: Khái quát các công trình quốc tế về các chủng vi khuẩn chịu mặn như Azospirillum brasilense, Brachybacterium saurashtrense, Brevibacterium casei, Pseudomonas extremorientalis có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng cây trồng; tổng hợp các nghiên cứu trong nước của Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thế Thư (2010), Phan Thị Tuyết Minh và Tăng Thị Chính (2006), Đinh Thúy Hằng và Trần Triết (2009) về vi sinh vật mặn tại Hải Phòng, Cần Giờ, Thừa Thiên Huế.
• Vai trò của vi sinh vật đất đối với cây trồng: Phân tích vai trò chuyển hóa dinh dưỡng, phân giải chất hữu cơ và cơ chế bảo vệ cây trồng trước áp lực stress mặn (duy trì tỷ lệ $\text{K}^+/\text{Na}^+$, tăng cường tích lũy proline, hoạt hóa enzyme chống oxy hóa).
• Chu trình nitơ và vi sinh vật cố định đạm: Trình bày chi tiết cơ chế hóa sinh của enzyme nitrogenase, phân loại các hình thức cố định nitơ (tự do, hội sinh, cộng sinh nốt sần họ Đậu) và tổng quan các phương pháp lên men rắn, lên men lỏng thu sinh khối vi sinh vật.

Chương III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Trình bày cụ thể địa điểm, thời gian, đối tượng và các hóa chất, thiết bị sử dụng trong quá trình thực nghiệm. Mô tả chi tiết quy trình lấy mẫu đất tại quần đảo Trường Sa theo TCVN 7538-6:2010, quy trình phân lập trên môi trường thạch Ashby có $3%\text{ NaCl}$, phương pháp định lượng amoni bằng so màu quang phổ tại bước sóng $625\text{ nm}$, phương pháp kiểm tra khả năng chịu mặn ở các nồng độ $\text{NaCl}$ từ $0%$ đến $10%$, phương pháp khuếch đại giải trình tự gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1525R và quy trình bảo quản đông khô chủng giống theo TCVN 9299:2014.

Chương IV: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương IV trình bày các kết quả thực nghiệm thu được:

• Kết quả sàng lọc và phân lập thành công 28 chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng sinh trưởng trên môi trường Ashby bổ sung $3%\text{ NaCl}$ từ các mẫu đất Trường Sa.
• Kết quả định lượng hoạt tính cố định đạm cho thấy hàm lượng amoni tạo thành dao động từ $6,66\text{ mg/l}$ đến $21,61\text{ mg/l}$, trong đó chủng ký hiệu N10 đạt hoạt tính cố định đạm cao nhất ($21,61 \pm 1,14\text{ mg/l}$ sau 96 giờ).
• Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc chủng N10 có hình tròn, bề mặt bóng mượt, rìa nhẵn, màu trắng; tế bào hình que xếp thành chuỗi, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm (-).
• Khả năng chịu mặn của chủng N10: Sinh trưởng tốt và ổn định ở dải nồng độ NaCl từ $0%$ đến $4%$; duy trì khả năng sinh trưởng ở nồng độ $4% - 6%\text{ NaCl}$; hầu như bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ $8%$ và $10%\text{ NaCl}$.
• Kết quả định danh sinh học phân tử: Đoạn trình tự gen 16S rRNA của chủng N10 có độ tương đồng $100%$ với loài Bacillus megaterium (nằm cùng nhánh với Bacillus megaterium NA10 trên cây phát sinh loài).
• Đánh giá khả năng bảo quản đông khô: Mật độ tế bào sống của chủng N10 trước và ngay sau đông khô duy trì ở mức $4,8 \times 10^7\text{ CFU/ml}$, sau 12 tuần bảo quản vẫn duy trì mật độ $> 10^6\text{ CFU/ml}$, đạt tiêu chuẩn theo TCVN 9299:2014.

Chương V: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Recommendation)

Tổng kết các kết quả đạt được về số lượng chủng phân lập, chỉ tiêu hoạt tính của chủng N10 (Bacillus megaterium), khả năng chịu mặn ở mức $6%\text{ NaCl}$ và độ bền sinh học khi bảo quản đông khô. Đồng thời, chương đưa ra kiến nghị tiếp tục nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng N10 để ứng dụng sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh phục vụ cải tạo đất trồng rau trên các vùng hải đảo.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

1. Kết quả phân lập và tuyển chọn hoạt tính cố định đạm:

   • Đã phân lập được 28 chủng vi sinh vật từ các mẫu đất tại quần đảo Trường Sa có khả năng phát triển trên môi trường chọn lọc Ashby bổ sung $3%\text{ NaCl}$.
   • Hàm lượng amoni chuyển hóa từ nitơ tự do của 28 chủng phân lập nằm trong khoảng từ $6,66\text{ mg/l}$ đến $21,61\text{ mg/l}$.
   • Tuyển chọn được chủng vi khuẩn N10 có hoạt tính cố định đạm mạnh nhất, đạt $21,61 \pm 1,14\text{ mg/l}$ sau 96 giờ nuôi cấy.

2. Đặc tính hình thái và phân loại sinh học phân tử chủng N10:

   • Nguồn gốc thu mẫu: Mẫu đất thu thập gần khu vực bãi rác nhà bếp trên đảo thuộc quần đảo Trường Sa.
   • Hình thái khuẩn lạc: Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt bóng, mép nhẵn phẳng, màu trắng đục.
   • Hình thái tế bào: Dạng que (rod-shaped), liên kết dạng chuỗi, bắt màu nhuộm Gram âm (-).
   • Định danh phân tử: Trình tự gen 16S rRNA khuếch đại qua PCR bằng cặp mồi 27F/1525R đạt độ tương đồng $100%$ với loài Bacillus megaterium trên cơ sở dữ liệu GenBank.

3. Khả năng chịu mặn của chủng N10:

   • Chủng N10 có khả năng chống chịu tốt ở môi trường nồng độ muối cao:

Chủng vi sinh vật	$0%\text{ NaCl}$	$2%\text{ NaCl}$	$4%\text{ NaCl}$	$6%\text{ NaCl}$	$8%\text{ NaCl}$	$10%\text{ NaCl}$
N10	Sinh trưởng tốt	Sinh trưởng tốt	Sinh trưởng tốt	Thích ứng/Sinh trưởng tốt	Hầu như không sinh trưởng	Hầu như không sinh trưởng

4. Độ ổn định khi bảo quản bằng phương pháp đông khô (theo TCVN 9299:2014):
   • Mật độ vi sinh vật sống của chủng Bacillus megaterium N10 duy trì ổn định qua các mốc thời gian đánh giá:

Chủng vi sinh vật	Trước đông khô	Ngay sau đông khô	Sau 1 tuần	Sau 4 tuần	Sau 8 tuần	Sau 12 tuần
Bacillus megaterium N10	$4,8 \times 10^7\text{ CFU/ml}$	$4,8 \times 10^7\text{ CFU/ml}$	$> 10^6\text{ CFU/ml}$	$> 10^6\text{ CFU/ml}$	$> 10^6\text{ CFU/ml}$	$> 10^6\text{ CFU/ml}$

Đóng góp của đề tài

• Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm đầu tiên về nguồn tài nguyên vi sinh vật cố định đạm chịu mặn bản địa được phân lập trực tiếp từ thổ nhưỡng quần đảo Trường Sa.
• Tuyển chọn và định danh chính xác được chủng vi khuẩn Bacillus megaterium N10 có hoạt tính cố định đạm cao ($21,61\text{ mg/l}$) và khả năng chịu mặn lên đến $6%\text{ NaCl}$.
• Chứng minh tính khả thi của phương pháp bảo quản đông khô đối với chủng N10 theo TCVN 9299:2014, tạo nguồn giống thuần chủng ổn định làm nguyên liệu sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh chịu mặn phục vụ canh tác rau xanh trên các hải đảo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Các đánh giá hoạt tính cố định đạm, khả năng chịu mặn và sinh trưởng của chủng vi khuẩn mới chỉ được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro) trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo, chưa tiến hành thử nghiệm đối chứng trên cây trồng thực tế ở điều kiện đồng ruộng hải đảo.
• Nghiên cứu tập trung chuyên sâu vào một chủng vi khuẩn N10 đạt hoạt tính cố định đạm cao nhất, chưa đi sâu khảo sát chi tiết các đặc tính sinh học kích thích sinh trưởng khác (như hòa tan photphat khó tan, sinh tổng hợp IAA, phân giải xenluloza) của toàn bộ 27 chủng còn lại.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành nghiên cứu công nghệ lên men và quy trình kỹ thuật sản xuất chế phẩm sinh học quy mô lớn từ chủng Bacillus megaterium N10.
• Thử nghiệm phối trộn chế phẩm N10 vào các cơ chất hữu cơ để sản xuất phân bón vi sinh cải tạo đất, đánh giá hiệu quả trên các loại cây trồng (như rau xanh, lúa, ngô) chịu mặn trực tiếp tại quần đảo Trường Sa và các vùng đất cát ven biển.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, giảng viên và nghiên cứu viên thuộc các ngành:

• Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng: Cung cấp quy trình phân lập vi sinh vật từ môi trường khắc nghiệt, kỹ thuật nuôi cấy và định lượng amoni bằng phương pháp so màu, quy trình định danh phân tử bằng PCR 16S rRNA.
• Khoa học Đất, Nông hóa - Thổ nhưỡng, Trồng trọt: Cung cấp giải pháp sinh học trong cải tạo đất nhiễm mặn và cơ sở phát triển phân bón hữu cơ vi sinh thay thế phân đạm hóa học.

Các phần có giá trị tham khảo cao nhất trong tài liệu:

1. Quy trình phân lập vi khuẩn cố định nitơ chịu mặn trên môi trường thạch Ashby bổ sung $3%\text{ NaCl}$ và phương pháp định lượng amoni bằng thuốc thử Nessler/đo quang phổ ($\text{OD}_{625\text{nm}}$).
2. Quy trình và kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA định danh loài Bacillus megaterium.
3. Quy trình thực nghiệm bảo quản chủng vi sinh vật nông nghiệp bằng phương pháp đông khô theo tiêu chuẩn TCVN 9299:2014.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Trong số các chủng phân lập từ quần đảo Trường Sa, chủng vi khuẩn nào có hoạt tính cố định nitơ cao nhất và nguồn gốc lấy mẫu ở đâu?
Chủng vi khuẩn N10 đạt hoạt tính cố định nitơ cao nhất với hàm lượng amoni sinh ra đạt $21,61 \pm 1,14\text{ mg/l}$ sau 96 giờ nuôi cấy trên môi trường Ashby. Chủng N10 được phân lập từ mẫu đất thu thập gần khu vực bãi rác nhà bếp trên đảo thuộc quần đảo Trường Sa.

2. Khả năng chịu đựng nồng độ muối (NaCl) của chủng vi khuẩn N10 được ghi nhận như thế nào trong thực nghiệm?
Chủng N10 sinh trưởng tốt và ổn định ở dải nồng độ $\text{NaCl}$ từ $0%$ đến $4%$. Khi nồng độ $\text{NaCl}$ tăng lên mức $4% - 6%$, chủng vẫn duy trì khả năng thích ứng và sinh trưởng tốt. Tuy nhiên, khi nồng độ muối đạt $8%$ và $10%\text{ NaCl}$, vi khuẩn hầu như không thể sinh trưởng.

3. Kết quả phân tích sinh học phân tử định danh chủng N10 thuộc loài nào?
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F/1525R để khuếch đại gen 16S rRNA và đối soát trình tự trên GenBank bằng BLAST cho thấy chủng N10 có độ tương đồng $100%$ với loài Bacillus megaterium, nằm cùng nhánh trên cây phát sinh loài với Bacillus megaterium NA10.

4. Khả năng sống sót của chủng N10 sau khi bảo quản đông khô theo TCVN 9299:2014 đạt kết quả ra sao?
Mật độ tế bào sống của chủng N10 trước và ngay sau khi đông khô đạt $4,8 \times 10^7\text{ CFU/ml}$. Qua các mốc theo dõi 1 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần bảo quản, mật độ vi sinh vật luôn duy trì ổn định ở mức $> 10^6\text{ CFU/ml}$, đáp ứng đúng quy chuẩn kỹ thuật của Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9299:2014.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đỗ Văn Thảo đã phân lập thành công 28 chủng vi khuẩn cố định nitơ chịu mặn từ các mẫu đất tại quần đảo Trường Sa trên môi trường Ashby bổ sung $3%\text{ NaCl}$. Trong đó, chủng N10 được tuyển chọn nổi bật với hoạt tính sinh amoni đạt $21,61 \pm 1,14\text{ mg/l}$, có khả năng chịu mặn thích ứng tốt ở nồng độ $6%\text{ NaCl}$ và được định danh phân tử chính xác là Bacillus megaterium. Chủng vi khuẩn này duy trì tỷ lệ sống cao ($> 10^6\text{ CFU/ml}$) sau 12 tuần bảo quản đông khô theo TCVN 9299:2014, khẳng định tiềm năng ứng dụng lớn trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh phục vụ cải tạo đất canh tác tại các vùng hải đảo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY --------� � � -------- UNDERGRADUATE THESIS TOPIC: “ISOLATION AND SELECTION OF HALOPHILIC NITROGEN-FIXING BACTERIA” HANOI – 2022 i VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY --------� � � -------- UNDERGRADUATE THESIS TOPIC: “ISOLATION AND SELECTION OF HALOPHILIC NITROGEN-FIXING BACTERIA” Full name : DO VAN THAO Class : K62CNSHE Student code : 620416 Supervisors : Bui Thi Thu Huong, Dr. Dong Huy Gioi, Assoc. HANOI - 2022 ii COMMITMENT I commit this is the work of myself. The data and results mentioned in the thesis are honest and have never been published in any other study.

I commit that the information cited in the thesis has been specified origin. Hanoi, June 7th 2022 Student Do Van Thao i ACKNOWLEDGEMENTS First and foremost, I would like to express my deepest gratitude to my supervisors, Dr. Bui Thi Thu Huong, and Assoc. Dong Huy Gioi - Faculty of Biology, Vietnam National University of Agriculture for their insight and constructive direction, passionate support, and useful critiques of this thesis, as well as their advice.

Secondly, I gratefully acknowledge the Faculty of Biotechnology from Vietnam National University of Agriculture and. Apart from that, I am grateful to my wonderful classmates in class K62CNSHE for the time we spent together over the previous four years. Finally, I express my gratitude to my loved ones for their unwavering and unconditional love, as well as their emotional support through times of adversity in our lives. They are the reason I was able to finish my graduation thesis.

Student Do Van Thao ii CONTENTS COMMITMENT. iii LIST OF TABLES. v LIST OF FIGURES.vi LIST OF ABBREVIATIONS. Overview of salt-contaminated soil.

Causes of salty soil formation. The actuality studies of salt-tolerance bacteria in the world and Vietnam. The actuality studies of salt-tolerance bacteria in the world. The actuality studies of salt-tolerance bacteria in Vietnam.

Soil microorganisms and roles for crops. The role of nutritional metabolism. The role of protecting crops in salty conditions. The Nitrogen Cycle.

Process of the Nitrogen Cycle. Importance of Nitrogen Cycle. Biological Nitrogen Fixation. Nitrogen-fixed microorganisms.

Types of nitrogen-fixing microorganisms. Roles of nitrogen-fixing bacteria. Overview of nitrogen-fixed bacterial isolation. MATERIALS AND METHODS.

Study time and area. Collection of samples. Preservation of the sample. Determination of soil pH.

Assess the suitability of the method of preserving freeze and dry varieties. RESULTS AND DISCUSSION. Screening and evaluation of nitrogen fixation activity. Colony morphology and cell morphology of N10.

Assessment of salt tolerance of nitrogen fixed strain N10. Nitrogen fixed strain identification N10. Assess the suitability of the method of preserving freeze-dried varieties 37 CHAPTER V. CONCLUSION AND RECOMMENDATION.

40 iv LIST OF TABLES Table 4. Salt tolerance of nitrogen fixation strain N10. Density of microorganisms of strains after storage time by freeze- drying method. 38 v LIST OF FIGURES Figure 2.

Increased salts in root zone can result in decreased water uptake by plant. The relationship between microorganisms, crops, and soil. The Nitrogen Cycle. Biological Nitrogen Fixation.

Nitrogen fixation process through nitrogenase enzyme complex. Concentration of amonium were formed by bacteria isolated. Colonies of bacteria isolated. Colony morphology of N10.

Cellular morphology of N10. Phylogenetic plants of the N10 strain with species with close kinship based on RNA16S sequencing analysis. 37 vi LIST OF ABBREVIATIONS BNF Biological Nitrogen Fixation ATP Adenosine Triphosphate The Food and Agriculture Organization of the United FAO Nations ICRAF International Council for Research in Agroforestry vii ABSTRACT Adaptation characteristic of microorganisms in different extreme conditions seeks discoveries in field of pharma, food, bioenergy sectors and fresh agriculture. In the present study were successfully isolated 28 different saline tolerant microorganism strains approach was proposed to prove adaptation ability in extreme conditions with growth and development of agricultural soil bacterial species in stepwise adaptation in 6% salt (NaCl) conditions from soil surrounding the Truong Sa archipelago.

Screening Plant growth-promoting selected a bacterium fixation nitrogen N10 ranged 21,61 mg/l.