MỞ ĐẦU Ngày nay gần 90% các loại thuốc được bán trên thị trường dưới dạng hỗn hợp racemic [34]. Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy việc sử dụng đồng phân tinh khiết thay thế cho hỗn hợp racemic của cùng hợp chất đem lại nhiều hiệu quả hơn trong điều trị như giảm liều dùng, giảm tác dụng không mong muốn của thuốc. Thuốc đồng phân đối quang được bán trên thị trường đầu tiên vào năm 1961 là thuốc điều trị lao ethambutol và các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đồng phân (S)-ethambutol có tác dụng điều trị lao trong khi đó đồng phân (R)-ethambutol gây viêm dây thần kinh thị giác [32]. Thảm họa y học Thalidomid vào thế kỷ XX gây dị tật cụt chi bẩm sinh cho hàng ngàn trẻ em do thalidomid được sử dụng trị liệu an thần cho phụ nữ mang thai.
Các nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây quái thai do đồng phân (S)-thalidomid trong hỗn hợp racemic [32]. Vì những lý do trên, nghành công nghiệp dược phẩm thế giới chuyển từ hỗn hợp racemic sang sử dụng dạng đồng phân đối quang tinh khiết. Citalopram (CIT) là thuốc ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin (SSRI) thuộc dẫn chất phthalen vòng đôi. CIT được sử dụng trong điều trị chống trầm cảm giúp tăng khí sắc, giải lo âu và bệnh tâm thần như rối loạn ám ảm cưỡng bức, rối loạn lo âu, rối loạn kiểm soát xung động (ICDs) và rối loạn căng thẳng sau chấn thương [47].
Giống như hầu hết các thuốc ức chế chọn lọc tái hấp thu serotonin, CIT thường được sử dụng trong điều trị dưới dạng racemic. Tuy nhiên đồng phân (R) và (S) không cùng hoạt tính sinh học, các tác dụng dược lý liên quan chủ yếu ở dạng (S) [24]. Kết quả của một nghiên cứu cho thấy đồng phân (S)-CIT có khả năng ức chế tái hấp thu serotonin ở màng trước synapse gấp 100 lần so với (R)-CIT và ít nhất gấp 2 lần so với dạng racemic [40]. Hiệu quả trị liệu của CIT thấp hơn là do sự ức chế tác dụng dược lý của (R)-CIT [17].
Do sự khác biệt đáng kể về đặc tính dược học và độc tính giữa hai dạng đồng phân quang học này và để cải thiện tính an toàn và hiệu quả, nhiều công ty đã nghiên. 2 cứu sản xuất các chế phẩm chỉ có dược chất (S)-CIT với hàm lượng bằng ½ hỗn hợp racemic CIT và đã được đưa ra thị trường. Tương tự, mirtazapin (MIR) là một thuốc chống trầm cảm không điển hình thuộc nhóm piperazinoazepin [22], là một hợp chất tetracyclic có tác dụng chống trầm cảm trên cả hai hệ thống chất dẫn truyền thần kinh noradrennergic và serotonergic (NaSSA). Cả hai đồng phân quang học (S)-MIR và (R)-MIR đều có hoạt tính chống trầm cảm [26], đồng phân (S)-MIR đối kháng thụ thể α2-autoreceptor, 5-HT2 giúp tăng cường giải phóng serotonin (5-HT) và norepinerphin (NE) cao hơn dạng (R)- MIR, trong khi đồng phân (R)-MIR đối kháng thụ thể 5-HT3 làm giảm tác dụng phụ serotonergic (buồn nôn, nôn.
Bên cạnh đó, thời gian bán hủy sau khi uống hỗn hợp racemic MIR cho thấy dạng (S)-MIR đào thải lâu hơn so với dạng (R)-MIR [18]. Chính vì sự khác nhau giữa hai dạng đồng phân (R) và (S) của MIR mà công ty dược phẩm Organon Hà Lan trước khi sáp nhập với Schering Plough và sau này là MSD đã và đang nghiên cứu chế phẩm có tên Esmirtazapine (ORG 50081; SCH 900265) chỉ chứa dược chất (S)-mirtazapin để điều trị chứng mất ngủ ở người trung niên và triệu chứng bốc hỏa liên quan đến mãn kinh ở phụ nữ [33]. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC [10],[30],[31],[36] và phương pháp CE [27],[38],[48],[51],[28] để phân tích đồng phân quang học CIT, MIR. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào ứng dụng phương pháp HPLC hay CE để phân tích đồng thời cả hai dược chất quang hoạt CIT và MIR.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình phân tích đồng thời đồng phân quang học citalopram và mirtazapin bằng phương pháp HPLC và CE” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện điện di để phân tích đồng phân quang học citalopram và mirtazapin. - Thẩm định quy trình phân tích. - Ứng dụng quy trình để phân tích một số chế phẩm trên thị trường có chứa citalopram và mirtazapin. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
CITALOPRAM (R)-Citalopram (S)-Citalopram Hình 1. Công thức cấu tạo của citalopram. Công thức phân tử: C20H21FN2O [21]. Khối lượng phân tử: 324,39 g/mol [21].
Citalopram thường được sử dụng dưới dạng muối citalopram hydrobromid có khối lượng phân tử 405,30 g/mol [21]. Tính chất Citalopram hydrobromid là chất tinh thể màu trắng, dễ tan trong ethanol tuyệt đối, tan tốt trong nước, có bước sóng hấp thụ cực đại 239 nm (trong môi trường methanol) [46]. Định tính - Phương pháp đo năng suất quay cực: - 0,10o đến 0,10o. Đo góc quay cực của dung dịch S (hòa tan 1,0 g mẫu trong 20 ml MeOH) [21].
- Phương pháp HPLC: trong phần định lượng, thời gian lưu của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic trong dung dịch chuẩn [46]. - Phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại: so sánh phổ hồng ngoại giữa chất thử và citalopram HBr chuẩn. Phổ hồng ngoại của chất thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của citalopram HBr chuẩn [21],[46]. CIT có các đỉnh đặc trưng của.
Phổ IR của citalopram HBr [45] 1. Định lượng - Phương pháp acid – base trong ethanol khan: hòa tan 0,3 g mẫu trong 50 ml dung dịch ethanol 96%, thêm vào 0,5 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M, sử dụng dung dịch chuẩn độ NaOH 0,1 M, phát hiện điểm tương đương bằng đo thế [21]. - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [46]. Điều kiện sắc ký + Cột sắc ký: C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm); nhiệt độ cột: 50 oC.
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1 g natri acetat trong 800 ml nước, thêm 6 ml triethylamin, chỉnh pH đến 4,6 bằng acid acetic băng, bổ sung nước vừa đủ 1 lít. + Pha động: ACN - dung dịch đệm (20:80), pH pha động là 5,0 ± 0,1. Điều chỉnh pH nếu cần. + Tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; bước sóng phát hiện: 239 nm.
+ Dung môi pha loãng: MeOH - H2O (50:50). 5 + Thời gian sắc ký: không ít hơn 1,3 lần thời gian lưu của citalopram. Chuẩn bị mẫu + Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Dung dịch có nồng độ citalopram HBr 1 µg/ml và tạp D citalopram chuẩn 1 µg/ml, được pha trong dung môi pha loãng + Dung dịch chuẩn citalopram HBr: Dung dịch có nồng độ citalopram hydrobromid 0,625 mg/ml, được pha trong dung môi pha loãng. + Dung dịch thử: 0,625 mg hoạt chất citalopram hydrobromid của chế phẩm trong một mililit dung môi pha loãng.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và dung dịch chuẩn citalopram HBr. Phép thử chỉ có giá trị khi: + Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: độ phân giải không ít hơn 1,8 lần giữa citalopram HBr chuẩn và tạp D citalopram chuẩn. + Dung dịch chuẩn citalopram HBr: hiệu năng của cột phải có số đĩa lý thuyết không được ít hơn 3000, hệ số kéo bất đối xứng của pic citalopram HBr không được lớn hơn 3,0 và độ lệch chuẩn tương đối của sáu lần tiêm không quá 2,0%. Chỉ định Điều trị trầm cảm nặng, CIT giúp khôi phục lại sự cân bằng của serotonin trong não giúp cải thiện năng lượng và tăng khí sắc cho người bệnh.
Có thể dùng CIT để điều trị bệnh tâm thần khác như rối loạn cưỡng chế, rối loạn hoảng sợ có hoặc không có chứng sợ đám đông [24]. MIRTAZAPIN (S)-Mirtazapin (R)-Mirtazapin Hình 1. Công thức cấu tạo của mirtazapin. 6 Công thức phân tử: C17H19N3 [21].
Khối lượng phân tử: 265,4 g/mol [21]. Tính chất Mirtazapin là chất bột kết tinh trắng hay gần như trắng, hơi ẩm, thực tế không tan trong nước, tan hoàn toàn trong ethanol tuyệt đối, có bước sóng hấp thụ cực đại ở 290 nm trong môi trường acetonitril [21],[46]. Định tính - Phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại [21],[46]: so sánh phổ hồng ngoại giữa chất thử và mirtazapin chuẩn. Phổ hồng ngoại của chất thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của mirtazapin chuẩn.
MIR có các đỉnh đặc trưng của dao động biến dạng của nguyên tố N trong liên kết -NH-, cường độ yếu (1586 cm-1), dao động co giãn của N-Carom (1255 cm-1), dao động C-Haliph (khoảng 2930 cm-1) [38]. Phổ IR của mirtazapin [41]. 7 - Phương pháp HPLC: trong phần định lượng, thời gian lưu của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic trong dung dịch chuẩn [46]. Định lượng - Phương pháp acid – base trong acid acetic khan: hòa tan 0,100 g mẫu trong 35 ml acid acetic băng, sử dụng dung dịch chuẩn độ acid percloric 0,1 M; phát hiện điểm tương đương bằng đo thế [21].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nặng cao [46]. Điều kiện sắc ký + Cột sắc ký: C18 (250 x 4,6 mm; 1,5 - 10 µm); nhiệt độ cột: 40 oC. + Dung dịch đệm: hòa tan 18 g tetramethyl amoni hydroxyd pentahydrat trong 950 ml nước, điều chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch acid phosphoric 85%, bổ sung nước vừa đủ 1 lít. + Pha động: ACN - MeOH - tetrahydrofuran - dung dịch đệm (15:12,5:7,5:65).
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút; thể tích tiêm: 10 µl; bước sóng phát hiện: 290 nm. + Dung môi pha loãng: ACN - H2O (1:1). Chuẩn bị mẫu + Dung dịch chuẩn: Dung dịch có nồng độ mirtazapin 0,3 mg/ml, được pha trong dung môi pha loãng. + Dung dịch thử: 0,3 mg hoạt chất mirtazapin của chế phẩm trong một mililit dung môi pha loãng.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi hiệu năng tách của cột phải có số đĩa lý thuyết không ít hơn 7000, hệ số bất đối xứng của pic mirtazapin không được lớn hơn 2,0 và độ lệch chuẩn tương đối của sáu lần tiêm không ít hơn 1,0%. Chỉ định MIR được dùng để điều trị chứng trầm cảm nặng, chứng rối loạn hoảng sợ, rối loạn lo âu tổng quát, loạn trương lực, nhức đầu căng thẳng, bốc hỏa, rối loạn căng thẳng sau chấn thương, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tình dục [19]. ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG 1.
Khái niệm về đồng phân đối quang Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh và vật qua gương, có công thức hóa học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác về cách bố trí không gian của các nhóm thế quanh carbon bất đối.