Phân tích đa dạng di truyền của các giống nấm sò sử dụng chỉ thị phân tử RAPD

Khóa luận tốt nghiệp phân tích đa dạng di truyền các mẫu giống nấm sò sử dụng chỉ thị phân tử RAPD, giúp hiểu rõ cấu trúc di truyền và ứng dụng trong chọn giống.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Ánh
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Trường Sơn
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Phân tích đa dạng di truyền của một số mẫu giống nấm sò bằng chỉ thị phân tử RAPD
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Giới thiệu chung về nấm sò
• 1.1.2. Khái quát chung
• 1.1.3. Đặc điểm hình thái. Chu trình sống của nấm sò
• 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm sò
• 1.1.5. Giá trị dinh dưỡng và giá trị dược liệu của nấm sò
• 1.1.6. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm sò
• 1.1.7. Đa dạng di truyền
• 1.1.8. Các phương pháp nghiên cứu trong đánh giá đa dạng di truyền
• 1.1.8.1. Các phương pháp truyền thống
• 1.1.8.2. Chỉ thị phân tử
• 1.1.8.2.1. Chỉ thị RAPD
• 1.1.8.3. Một số nghiên cứu về đa dạng di truyền của nấm sò bằng chỉ thị phân tử RAPD
• 1.2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị trong nghiên cứu. Hóa chất và trang thiết bị trong nghiên cứu
• 1.2.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.3.1. Phương pháp đánh giá sự sinh trưởng của các giống nấm sò trên môi trường nhân giống cấp 1
• 1.2.3.2. Tách chiết DNA tổng số
• 1.2.3.3. Phương pháp chạy PCR
• 1.2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 1.2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.3.1. Đánh giá sự sinh trưởng của các mẫu giống nấm sò trên môi trường nhân giống cấp 1
• 1.3.2. Đánh giá đa dạng di truyền của 10 mẫu giống nấm sò
• 1.3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
• 1.3.2.2. Kết quả sử dụng chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền
• 1.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Phân tích di truyền và đa dạng di truyền

Phân tích di truyền là trọng tâm của khóa luận, sử dụng chỉ thị phân tử RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 10 mẫu giống nấm sò. Kết quả cho thấy sự đa dạng cao với tỷ lệ đa hình từ 83,33% đến 100%. Kỹ thuật RAPD đã nhân bản 1284 băng vạch, phát hiện 302 locus, trong đó 294 locus đa hình. Hệ số PIC dao động từ 0,33 đến 0,46, chỉ số Rp trung bình là 12,84. Phân tích gen này giúp xác định hệ số tương đồng di truyền, từ 0,464 đến 0,775, và phân nhóm các mẫu nấm thành 3 nhóm chính.

1.1. Ứng dụng RAPD trong nông nghiệp

Chỉ thị phân tử RAPD được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền nhờ khả năng phân tích đa hình cao và thiết kế mồi đơn giản. Trong khóa luận, RAPD được sử dụng để đánh giá đặc điểm di truyền nấm, giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen nấm sò. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc tuyển chọn và lai tạo giống nấm có phẩm chất tốt và năng suất cao, góp phần thúc đẩy nông nghiệp bền vững.

II. Giống nấm sò và đặc điểm di truyền

Giống nấm sò (Pleurotus spp.) là đối tượng nghiên cứu chính của khóa luận. Nấm sò có đặc điểm di truyền đa dạng, thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái và giá thể nuôi trồng. Khóa luận đã đánh giá sự sinh trưởng của 10 mẫu giống nấm trên môi trường nhân giống cấp 1, với tốc độ sinh trưởng dao động từ 2,61 đến 5,31 mm/ngày. Phân tích di truyền bằng RAPD cho thấy sự đa dạng cao, giúp phân loại và bảo tồn nguồn gen nấm ăn và nấm dược liệu.

2.1. Đặc điểm hình thái và chu trình sống

Nấm sò có hình dạng phễu lệch, mọc thành cụm, với màu sắc đa dạng từ trắng, xám, nâu đến tím. Chu trình sống của nấm bắt đầu từ bào tử, phát triển thành hệ sợi sơ cấp và thứ cấp, sau đó hình thành quả thể. Phương pháp phân tích di truyền đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm, bao gồm nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và dinh dưỡng.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Khóa luận sử dụng phương pháp phân tích di truyền bao gồm tách chiết DNA tổng số, chạy PCR và điện di trên gel agarose. Kết quả tách chiết DNA cho độ tinh sạch cao, phù hợp cho phản ứng PCR. Kỹ thuật RAPD đã nhân bản thành công các đoạn DNA đặc trưng, tạo ra các băng vạch sắc nét và rõ ràng. Kết quả nghiên cứu đã xác định được hệ số tương đồng di truyền và phân nhóm các mẫu giống nấm sò.

3.1. Đánh giá sinh trưởng và đa dạng di truyền

Khóa luận đã đánh giá sự sinh trưởng của các mẫu giống nấm sò trên môi trường nhân giống cấp 1, với tốc độ sinh trưởng nhanh và ổn định. Phân tích đa dạng di truyền bằng RAPD cho thấy sự đa dạng cao, giúp phân loại và bảo tồn nguồn gen nấm sò. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các giống nấm có phẩm chất tốt và năng suất cao.

IV. Giá trị dinh dưỡng và dược liệu của nấm sò

Nấm sò không chỉ có giá trị dinh dưỡng cao mà còn mang lại nhiều lợi ích dược liệu. Nấm chứa nhiều protein, vitamin, chất xơ và khoáng chất, hỗ trợ tăng cường sức khỏe. Các hoạt chất trong nấm sò có khả năng kháng ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa và điều hòa hệ miễn dịch. Nghiên cứu di truyền về nấm sò giúp phát triển các giống nấm có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, đóng góp vào ngành nông nghiệp và y học.

4.1. Ứng dụng trong y học và thực phẩm

Nấm sò được sử dụng làm thực phẩm chức năng nhờ các hoạt chất có lợi cho sức khỏe. Các nghiên cứu đã chứng minh khả năng kháng ung thư, kháng viêm và chống oxy hóa của nấm sò. Phân tích di truyền giúp xác định các đặc điểm di truyền liên quan đến giá trị dinh dưỡng và dược liệu, từ đó phát triển các giống nấm có lợi ích cao cho con người.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nấm sò (Pleurotus spp.) là một trong những loài nấm ăn và nấm dược liệu được nuôi trồng phổ biến trên thế giới cũng như tại Việt Nam nhờ hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu hoạt tính sinh học và khả năng thích ứng tốt với nhiều loại giá thể phế phụ phẩm nông nghiệp. Tại Việt Nam, nguồn gen nấm lớn nói chung và nấm sò nói riêng có mức độ đa dạng sinh học cao. Tuy nhiên, việc quản lý, nhận diện và khai thác nguồn gen phục vụ công tác bảo tồn, tuyển chọn và lai tạo các giống có năng suất, chất lượng cao vẫn đòi hỏi các công cụ đánh giá chính xác ở cả mức độ hình thái sinh trưởng và mức độ phân tử.

Khóa luận tốt nghiệp "Phân tích đa dạng di truyền của một số mẫu giống nấm sò bằng chỉ thị phân tử RAPD" do sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của TS. Đinh Trường Sơn và TS. Ngô Xuân Nghiễn. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề đánh giá sự sai khác về đặc điểm sinh trưởng hệ sợi trong giai đoạn nhân giống cấp 1 và xác định mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn mẫu giống nấm sò thu thập từ các nguồn gốc địa lý khác nhau.

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định trong văn bản gồm:

• Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sự sinh trưởng của các mẫu giống nấm sò trong giai đoạn nhân giống cấp 1 và xác định được sự đa dạng di truyền của 10 mẫu giống nấm sò bằng chỉ thị phân tử RAPD.
• Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Đánh giá sự sinh trưởng của các mẫu giống nấm sò trong giai đoạn nhân giống cấp 1.
  2. Xác định được quy trình tách chiết DNA phù hợp để thu được DNA tổng số có chất lượng tốt cho phản ứng PCR.
  3. Xác định quy trình chạy PCR với chỉ thị RAPD cho sản phẩm có tính lặp cao, băng vạch sắc nét, rõ ràng.
  4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu giống nấm sò nghiên cứu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 10 mẫu giống nấm sò (Pleurotus spp.) ký hiệu gồm PN1, PN2, PN8, PN15, PN19, PN20, PN28, PN30, PN50 và PN1142 do Viện Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu – Học viện Nông nghiệp Việt Nam thu thập, lưu giữ và chọn tạo.
• Nguồn gốc mẫu giống: PN1, PN8, PN19, PN30 có nguồn gốc từ Thái Lan; PN2 từ Mỹ; PN15 từ Hàn Quốc; PN20 từ Nhật Bản; PN28 từ Trung Quốc; PN50 và PN1142 được thu thập tại Việt Nam.
• Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật (Khoa Công nghệ Sinh học) và Viện Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2021 đến tháng 08/2021.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở sinh học nấm học, hóa sinh học và di truyền học phân tử. Về mặt phân loại học, nấm sò thuộc chi Pleurotus, họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Agaricomycetes, ngành phụ Basidiomycota. Chu trình sống của nấm sò mang đặc điểm dị tản hai yếu tố (bifactorial heterothallism), phát triển từ bào tử đảm đơn bội hình thành hệ sợi sơ cấp (1 nhân, không có khóa), sau đó kết hợp tạo hệ sợi thứ cấp song hạch (2 nhân, có khóa điển hình) trước khi biệt hóa hình thành quả thể. Về mặt giá trị sử dụng, nấm sò chứa hàm lượng protein thô chiếm từ 10% đến 30% (thậm chí 40%) trọng lượng khô, giàu các acid amin thiết yếu, vitamin nhóm B (B1, B2, B12, niacin), vitamin D3 và khoáng chất, đồng thời chứa các hợp chất có hoạt tính trị liệu như polysaccharide, pleuran, lectin có tác dụng kháng u, kháng khuẩn, chống oxy hóa và kháng viêm.

Về phương pháp phân tích di truyền, tác giả sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Đây là chỉ thị phân tử dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên ngắn (thường từ 8 đến 10 nucleotide) để khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên toàn bộ hệ gen mà không yêu cầu biết trước thông tin trình tự nucleotide.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm các quy trình kỹ thuật chính sau:

1. Phương pháp đánh giá sinh trưởng hệ sợi cấp 1: Môi trường thạch PGA cải tiến được pha chế với công thức gồm 200g khoai tây, 200g giá đỗ, 20g glucose, 16g agar, 0,5g pepton và 0,5g cao nấm men trong 1000 ml nước cất, hấp khử trùng ở 121°C trong 50 phút. Giống gốc được cấy chuyển bằng miếng thạch kích thước 4 mm x 4 mm vào tâm đĩa petri đường kính 9 cm, nuôi ủ ở nhiệt độ 28°C. Các chỉ tiêu theo dõi gồm thời gian bung sợi (ngày), thời gian mọc kín đĩa (ngày), tốc độ sinh trưởng của hệ sợi (mm/ngày), độ dày và đặc điểm hình thái hệ sợi.
2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Áp dụng quy trình của Farhad Masoomi-Aladizgeh và cs. (2016) có cải tiến bởi Đinh Trường Sơn. Hệ sợi nấm (50–100 mg) được nghiền phá vỡ tế bào bằng máy rung bi kim loại MM 400 Retsch (15 bi nhỏ 2 mm và 1 bi lớn 5 mm) với đệm tách chiết (CTAB, EDTA, Tris base, NaCl, β-mercaptoethanol, PVPP) và SDS 20%. Dịch chiết được tinh sạch qua các bước tủa protein bằng Kali acetate 5M, chiết tách bằng hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1) và Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), kết tủa DNA bằng Isopropanol (tỷ lệ 1:2), rửa cồn 70% và hòa tan trong đệm TE (1:10), bảo quản ở -20°C.
3. Phương pháp kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA: Đo mật độ quang phổ tại bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy đo quang phổ Hellma traycell cuvette để xác định tỷ lệ OD260/280 và nồng độ DNA (ng/µl); đồng thời kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di trên gel agarose 1% (80V, 40 phút).
4. Phương pháp phản ứng PCR-RAPD: Sử dụng bộ kit 2X PCR Master mix Bioline. Thành phần phản ứng tổng thể tích 10 µl gồm: 4,0 µl đệm Master mix, 0,5 µl nước cất khử trùng, 1,5 µl mồi RAPD và 4,0 µl DNA khuôn (nồng độ 5 ng/µl, tương đương 20 ng DNA). Chu trình nhiệt PCR thực hiện trên máy Takara PCR Thermal Cycler: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; tiếp theo là 35 chu kỳ gồm biến tính 95°C trong 30 giây, bắt mồi ở 30–34°C (tùy mồi) trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 1 phút 30 giây; kéo dài lần cuối ở 72°C trong 7 phút và giữ ở 20°C.
5. Phương pháp điện di và chụp ảnh gel: Sản phẩm PCR (pha với 2 µl loading dye 6X) cùng thang chuẩn 1kb DNA ladder được phân tách trên gel agarose nồng độ 1,5–2,0% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 80V trong 40 phút, nhuộm Ethidium Bromide và ghi nhận hình ảnh bằng hệ thống UVP BioDoc-it.
6. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu sinh trưởng được phân tích phương sai và so sánh sai khác bằng phần mềm Excel và IRRISTAT 5.0 (các chỉ số LSD0.05, CV%). Dữ liệu điện di RAPD được chuyển đổi thành ma trận nhị phân (1: có băng, 0: không có băng). Dữ liệu nhị phân được phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1 để tính hệ số tương đồng di truyền, thiết lập sơ đồ phân nhóm di truyền theo thuật toán UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Các chỉ số đa hình phân tử được tính toán gồm:
   • Chỉ số đa hình di truyền PIC (Polymorphic Information Content) theo Botstein và cs. (2009): $$\text{PIC}_{(i)} = 1 - p_i^2 - q_i^2$$ (trong đó $p_i$ là tần số xuất hiện băng, $q_i$ là tần số không xuất hiện băng tại locus $i$).
   • Năng lực phân giải của mồi Rp (Resolving power) theo Prevost và Wilkinson (1999): $$\text{Rp} = \sum I_b$$ với $I_b = 1 - [2 \times |0,5 - p|]$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ vai trò kinh tế, giá trị dinh dưỡng và dược liệu của nấm sò; thực trạng phong phú về nguồn gen nấm tại Việt Nam nhưng thiếu các nghiên cứu phân loại phân tử chi tiết; lý do lựa chọn kỹ thuật RAPD; xác định rõ mục tiêu chung và 4 nhiệm vụ thực nghiệm cụ thể cần hoàn thành.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

• Đặc điểm sinh học và giá trị của nấm sò: Hệ thống hóa vị trí phân loại của chi Pleurotus; mô tả hình thái quả thể (mũ nấm đường kính 5–15 cm, phiến nấm men dọc cuống, bào tử hình trụ elip 8–12 x 3–4 µm); chu trình sống dị tản hai yếu tố; các yếu tố sinh thái tác động (nhiệt độ thích hợp cho nhóm chịu lạnh 13–20°C, nhóm chịu nhiệt 24–28°C; độ ẩm cơ chất 60–62%, độ ẩm không khí tạo quả thể 93–94%; ánh sáng khuếch tán 300–400 lux khi ra quả thể; ngưỡng CO2 nuôi sợi 1500–2000 ppm và ngưỡng ra quả thể dưới 600 ppm; pH thích hợp 6,5–7,0; tỷ lệ C/N = 30/1).
• Tình hình nuôi trồng và nghiên cứu: Tình hình sản xuất nấm sò trên thế giới (Mỹ, châu Á) và các nghiên cứu nuôi trồng trên các phụ phẩm nông lâm nghiệp (lõi ngô, mùn cưa keo, rơm rạ, giấy vụn, bìa các tông); các nghiên cứu nhân giống dịch thể và chọn tạo dòng lai tại Việt Nam.
• Cơ sở lý thuyết về đa dạng di truyền và các loại chỉ thị: Phân tích ưu nhược điểm của các chỉ thị truyền thống (hình thái, tế bào, hóa sinh/allozyme) so với chỉ thị phân tử DNA (RFLP, RAPD, SSR, ISSR, AFLP, SNP); phân tích nguyên lý, ưu thế (không cần biết trước trình tự gen, chi phí thấp, tính đa hình cao) và nhược điểm (chỉ thị trội, độ lặp lại phụ thuộc điều kiện phản ứng) của chỉ thị RAPD; tổng quan các công trình nghiên cứu sử dụng RAPD trên các loài nấm sò như nghiên cứu của Nuhu Alam và cs. (2009) trên Pleurotus nebrodensis, Nguyễn Thị Bích Thùy và cs. (2012) trên Pleurotus eryngii, Nasir Ahmad Khan và cs. (2017) trên các giống nấm sò địa phương và ngoại lai.

Phần III: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết danh mục vật liệu 10 mẫu giống nấm sò; bảng thống kê các hóa chất, bộ kit sinh học phân tử và trang thiết bị nghiên cứu chuyên dụng; danh mục 39 mồi ngẫu nhiên RAPD (trình tự nucleotide từ 5' đến 3', nhiệt độ bắt mồi từ 30°C đến 34°C); mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị môi trường nhân giống cấp 1 PGA, kỹ thuật cấy chuyển vô trùng, quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp nghiền bi kết hợp CTAB/SDS, quy trình đo quang phổ OD260/280, các thông số thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR, kỹ thuật điện di gel agarose và các công thức toán học phân tích thống kê, di truyền học quần thể.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua hai nội dung lớn:

1. Đánh giá sinh trưởng hệ sợi 10 mẫu giống trên môi trường PGA: Ghi nhận thời gian bung sợi (2–8 ngày), thời gian kín đĩa (8,5–17,25 ngày), tốc độ sinh trưởng (2,61–5,31 mm/ngày) và đặc điểm hình thái tản nấm. Mẫu PN1 và PN19 có tốc độ sinh trưởng cao nhất; mẫu PN8 có tốc độ sinh trưởng chậm nhất.
2. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD:
   • Đánh giá chất lượng DNA tách chiết: Tỷ lệ OD260/280 của 10 mẫu dao động từ 2,01 đến 2,24; nồng độ DNA đạt từ 150 đến 286 ng/µl, đáp ứng tiêu chuẩn tinh sạch để làm khuôn cho phản ứng PCR.
   • Kết quả phản ứng PCR với 20 mồi RAPD tuyển chọn: Nhân bản được 1284 băng vạch; phát hiện 302 locus với 294 locus đa hình (tỷ lệ đa hình trung bình đạt 97,26%); chỉ số PIC trung bình đạt 0,38; chỉ số Rp trung bình đạt 12,84.
   • Mối quan hệ di truyền: Hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,464 – 0,775; sơ đồ hình cây UPGMA phân chia 10 mẫu giống nấm sò thành 3 nhóm chính tại ngưỡng tương đồng 0,578.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chi tiết

Kết quả nghiên cứu sinh trưởng hệ sợi của 10 mẫu giống nấm sò trên môi trường nhân giống cấp 1 (môi trường PGA) được tổng hợp tại bảng dưới đây:

Mẫu giống	Nguồn gốc	Tốc độ sinh trưởng hệ sợi (mm/ngày)	Thời gian sinh trưởng kín đĩa (ngày)	Độ dày hệ sợi	Đặc điểm hình thái hệ sợi
PN1	Thái Lan	5,31	8,50	+++	Màu trắng, bông xù, mọc đồng đều
PN2	Mỹ	2,91	15,50	+++	Màu trắng mảnh, mọc đồng đều
PN8	Thái Lan	2,61	17,25	+++	Màu trắng, mảnh, mượt, mọc không đồng đều
PN15	Hàn Quốc	4,11	11,00	++	Màu trắng, bông xù nhẹ, mọc đồng đều
PN19	Thái Lan	5,19	8,75	++	Màu trắng, hơi bông xù, mọc đồng đều
PN28	Trung Quốc	5,00	9,00	+++	Màu trắng, bông xù, mọc đồng đều
PN50	Việt Nam	4,30	10,50	++	Màu trắng, mượt, mọc đồng đều
PN1142	Việt Nam	5,00	9,00	+++	Màu trắng, bông xù, mọc đồng đều
PN20	Nhật Bản	4,88	9,25	+++	Màu trắng, mảnh, bông xù nhẹ, mọc đồng đều
PN30	Thái Lan	2,95	15,25	+++	Màu trắng, bông xù nhẹ, mọc không đồng đều
LSD (0,05)	-	0,38	1,01	-	-
CV (%)	-	6,30	6,20	-	-

Kết quả đo quang phổ kiểm tra chất lượng DNA tổng số của 10 mẫu giống nấm sò:

Mẫu giống	Tỷ lệ OD260/280	Nồng độ DNA (ng/µl)
PN1	2,12	213
PN2	2,19	150
PN8	2,09	286
PN15	2,01	221
PN19	2,13	275
PN28	2,04	284
PN50	2,09	228
PN1142	2,04	215
PN20	2,09	259
PN30	2,24	268

Kết quả phân tích phân tử với 20 mồi RAPD trên 10 mẫu giống nấm sò:

STT	Tên mồi	Trình tự mồi (5' - 3')	Nhiệt độ bắt mồi (°C)	Tổng số locus	Số locus đa hình	Tỷ lệ đa hình (%)	Chỉ số PIC	Chỉ số Rp
1	APG05	CTGAGACGGA	32	18	17	94,44	0,35	18,80
2	APH18	GAATCGGCCA	32	20	19	95,00	0,35	20,60
3	OPA01	CAGGCCCTTC	34	16	16	100,00	0,38	11,00
4	OPA02	TGCCGAGCTG	34	15	15	100,00	0,37	12,80
5	OPA04	AATCGGGCTG	32	12	12	100,00	0,39	10,40
6	OPA05	AGGGGTCTTG	32	14	14	100,00	0,37	11,80
7	OPA18	AGGTGACCGT	32	12	10	83,33	0,33	12,60
8	OPB04	GGACTGGAGT	32	15	15	100,00	0,43	12,00
9	OPB05	TGCGCCCTTC	34	15	15	100,00	0,40	11,40
10	OPB17	AGGGAACGAG	32	14	13	92,86	0,36	11,60
11	OPC01	TTCGAGCCAG	32	14	14	100,00	0,40	10,60
12	OPC03	GGGGGTCTTT	32	14	14	100,00	0,34	11,20
13	OPC04	CCGCATCTAC	32	14	14	100,00	0,38	12,20
14	OPC08	TGGACCGGTG	34	17	17	100,00	0,40	15,60
15	OPC13	AAGCCTCGTC	32	14	13	92,86	0,37	14,20
16	OPD02	GGACCCAACC	34	17	17	100,00	0,46	14,20
17	OPE04	GTGACATGCC	32	13	12	92,31	0,34	9,80
18	OPG11	TGCCCGTCGT	34	18	17	94,44	0,35	13,80
19	OPN03	GGTACTCCCC	34	16	16	100,00	0,40	11,00
20	OPR09	TGAGCACGAG	32	14	14	100,00	0,40	11,20
Tổng	-	-	-	302	294	-	-	-
TB	-	-	-	15,10	14,70	97,26	0,38	12,84

Đóng góp của đề tài

• Khóa luận đã chuẩn hóa quy trình nhân giống cấp 1 trên môi trường PGA bổ sung dịch chiết giá đỗ, pepton và cao nấm men, đồng thời xác định được các thông số sinh trưởng định lượng của 10 mẫu giống nấm sò phục vụ công tác tuyển chọn giống gốc mọc nhanh.
• Thiết lập thành công quy trình tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm sò bằng phương pháp nghiền bi cơ học kết hợp đệm CTAB/SDS cải tiến, cho sản phẩm DNA có nồng độ cao (150–286 ng/µl) và tỷ số OD260/280 đạt từ 2,01 đến 2,24, đáp ứng yêu cầu cho phản ứng PCR.
• Sàng lọc được 20 mồi RAPD có tính đa hình cao (tỷ lệ locus đa hình trung bình 97,26%, chỉ số PIC trung bình 0,38, Rp trung bình 12,84) phục vụ đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử.
• Cung cấp dữ liệu về hệ số tương đồng di truyền (0,464 – 0,775) và sơ đồ phân nhóm di truyền (3 nhóm chính ở mức tương đồng 0,578) của 10 mẫu giống nấm sò, tạo cơ sở khoa học cho công tác phân loại, lưu giữ nguồn gen và định hướng các cặp lai trong công tác chọn tạo giống nấm sò.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Nghiên cứu mới dừng lại ở phạm vi đánh giá đặc điểm sinh trưởng hệ sợi trên môi trường thạch nhân giống cấp 1 (PGA) trong điều kiện phòng thí nghiệm; chưa tiến hành khảo nghiệm sinh trưởng ở các giai đoạn nhân giống cấp 2 (trên hạt ngũ cốc/thóc), cấp 3 (trên mùn cưa) và chưa đánh giá năng suất sinh học cũng như đặc tính hình thái quả thể khi nuôi trồng thực tế trên cơ chất phế phụ phẩm.
  • Kỹ thuật RAPD là chỉ thị trội nên không thể phân biệt được trạng thái đồng hợp tử và dị hợp tử của các cá thể nghiên cứu.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Tiếp tục theo dõi, đánh giá khả năng sinh trưởng, năng suất và hiệu suất sinh học của các mẫu giống nấm sò này trên các loại giá thể nuôi trồng thương phẩm khác nhau (mùn cưa, rơm rạ, bã mía, lõi ngô).
  • Kết hợp sử dụng thêm các loại chỉ thị phân tử đồng trội (như SSR) hoặc giải trình tự vùng gen ITS (Internal Transcribed Spacer) để nâng cao độ phân giải và độ chính xác trong định danh loài và phân tích đa dạng di truyền.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Nông học, Di truyền học và Vi sinh vật học ứng dụng.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn cao gồm:

• Công thức môi trường và kỹ thuật nuôi cấy mô nấm: Quy trình pha chế môi trường PGA cải tiến (kết hợp khoai tây, giá đỗ, pepton, cao nấm men) và phương pháp bố trí thí nghiệm theo dõi tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm bằng thước đo hai trục vuông góc.
• Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm khó phá vỡ: Chi tiết các bước xử lý cơ học bằng máy phá mẫu bi sắt kết hợp đệm CTAB/SDS để thu nhận DNA chất lượng cao từ tản nấm chứa nhiều polysaccharide.
• Dữ liệu mồi và điều kiện PCR-RAPD: Bảng trình tự 20 cặp mồi RAPD đạt độ đa hình cao kèm nhiệt độ bắt mồi và chu trình nhiệt chuẩn hóa có thể ứng dụng trực tiếp cho các nghiên cứu di truyền trên chi nấm sò Pleurotus.
• Phương pháp luận xử lý số liệu phân tử: Cách thức xây dựng ma trận nhị phân từ ảnh điện di, ứng dụng phần mềm NTSYS 2.1 tính toán hệ số tương đồng di truyền, vẽ sơ đồ UPGMA và cách tính các chỉ số di truyền quần thể (PIC, Rp).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu giống nấm sò nào có tốc độ sinh trưởng hệ sợi nhanh nhất và chậm nhất trên môi trường PGA?

Trong 10 mẫu giống khảo sát, mẫu PN1 (nguồn gốc Thái Lan) có tốc độ sinh trưởng hệ sợi nhanh nhất đạt 5,31 mm/ngày và thời gian mọc kín đĩa ngắn nhất là 8,5 ngày. Ngược lại, mẫu PN8 (cũng từ Thái Lan) có tốc độ sinh trưởng chậm nhất đạt 2,61 mm/ngày và thời gian mọc kín đĩa kéo dài nhất là 17,25 ngày (với mức ý nghĩa thống kê LSD0,05 = 0,38 mm/ngày và LSD0,05 = 1,01 ngày).

2. Chất lượng và nồng độ DNA tổng số tách chiết từ các mẫu nấm đạt được như thế nào?

DNA tổng số tách chiết bằng quy trình cải tiến có độ tinh sạch cao với tỷ số OD260/280 của cả 10 mẫu nằm trong khoảng từ 2,01 đến 2,24 (mẫu PN15 đạt 2,01; mẫu PN30 đạt cao nhất 2,24). Nồng độ DNA dao động từ 150 ng/µl (mẫu PN2) đến 286 ng/µl (mẫu PN8), đủ điều kiện pha loãng về nồng độ làm việc 5 ng/µl để thực hiện phản ứng PCR.

3. Trong số 39 mồi RAPD khảo sát ban đầu, có bao nhiêu mồi được lựa chọn và tổng số locus phát hiện được là bao nhiêu?

Sau khi khảo sát 39 mồi RAPD, nghiên cứu đã chọn lọc được 20 mồi cho băng vạch rõ nét và có tính đa hình cao. Tổng số băng vạch nhân bản được từ 20 mồi này trên 10 mẫu giống là 1284 băng; tổng số locus phát hiện được là 302 locus (trung bình 15,1 locus/mồi), trong đó có 294 locus đa hình (trung bình 14,7 locus đa hình/mồi), đạt tỷ lệ đa hình trung bình 97,26%.

4. Mồi RAPD nào có chỉ số đa hình PIC cao nhất và mồi nào có năng lực phân giải Rp lớn nhất?

Mồi có chỉ số đa hình di truyền PIC cao nhất là OPD02 với giá trị 0,46 (mồi OPA18 có PIC thấp nhất là 0,33; trung bình các mồi đạt 0,38). Mồi có năng lực phân giải sai khác Rp lớn nhất là APH18 với giá trị Rp = 20,60 (mồi OPE04 có Rp thấp nhất là 9,80; trung bình các mồi đạt 12,84).

5. Mức độ tương đồng di truyền giữa 10 mẫu giống nấm sò dao động trong khoảng nào và được phân thành mấy nhóm?

Hệ số tương đồng di truyền giữa 10 mẫu giống nấm sò biến động trong khoảng từ 0,464 đến 0,775. Dựa trên sơ đồ quan hệ di truyền thiết lập theo phương pháp UPGMA, tại giá trị hệ số tương đồng di truyền 0,578, 10 mẫu giống nấm sò được phân chia thành 3 nhóm chính.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Ngọc Ánh đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra về việc đánh giá đặc tính sinh trưởng hệ sợi cấp 1 và phân tích đa dạng di truyền của 10 mẫu giống nấm sò (Pleurotus spp.). Nghiên cứu đã xác định được sự phân hóa rõ rệt về tốc độ mọc của hệ sợi trên môi trường PGA (dao động từ 2,61 đến 5,31 mm/ngày) và tối ưu hóa thành công quy trình tách chiết DNA cùng phản ứng PCR-RAPD. Với 20 mồi RAPD tuyển chọn phát hiện 294 locus đa hình (tỷ lệ đa hình 97,26%) và hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,464 đến 0,775, kết quả nghiên cứu cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm quan trọng phục vụ công tác quản lý nguồn gen, giám định và định hướng chọn tạo giống nấm sò tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nấm lớn có ý nghĩa và vai trò rất quan trọng trong đời sống, cũng như trong nền kinh tế và trong nghiên cứu khoa học. Trên thế giới đã xác định được khoảng gần 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc. Trong đó, số loài nấm được nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhân tạo là trên 80 loài. Nấm sò Pleurotus spp.

được nuôi trồng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam do có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, có khả năng thích ứng với với nhiều điều kiện sinh thái và nguồn nguyên liệu nuôi trồng khác nhau. Nấm sò có tên khoa học chung là Pleurotus spp., thuộc chi Pleurotus, họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomycota, ngành Nấm thật – Eumycota, giới Nấm – Fungi. Hiện nay, con người đã thu thập và nuôi trồng nhiều loài nấm sò khác nhau về màu sắc, hình dạng. Chúng là những loài nấm sò tím (P.

ostreatus), nấm sò trắng (P. florida), nấm sò nâu ( P. Nấm sò đã được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo, sử dụng các nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên, phế phẩm trong quá trình sản xuất nông nghiệp và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Việt Nam là nước có mức độ đa dạng rất cao về nguồn gen nấm lớn trong đó có nấm sò.

Do đó, việc phân tích đa dạng di truyền các giống nấm sò phục vụ công tác bảo tồn, tuyển chọn và lai tạo ra các giống nấm sò có phẩm chất tốt và năng suất cao có ý nghĩa cực kì quan trọng. Thêm vào đó, việc xác định được một số đặc điểm hình thái của các mẫu giống nấm sò trong giai đoạn nhân giống cấp 1 cũng góp phần quan trọng trong quy trình nhân nhanh và sản xuất nấm sò trong thực tiễn. Chỉ thị RAPD dựa trên kết quả khuếch đại DNA trong phản ứng PCR. Đó là quá trình nhân bản các đoạn DNA đặc trưng của cơ thể nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên (thường từ 8-10 nucleotide).

RAPD cho khả năng phân tích đa hình rất cao (Williams et al.,1990), thiết kế mồi dễ dàng, vì vậy, RAPD được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật, trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền và trong xác định loài. 1 Với mục đích phân tích sự đa dạng di truyền của 10 mẫu giống nấm sò thu thập được, tôi đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD để xác định hệ số tương đồng di truyền của một số mẫu nấm sò do Viện Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu – Học viện Nông nghiệp Việt Nam thu thập và chọn tạo. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bảo tồn, phân loại và phát triển nguồn gen nấm sò phục vụ cho khoa học và thực tiễn sản xuất. Mục tiêu Đánh giá sự sinh trưởng của các mẫu giống nấm sò trong giai đoạn nhân giống cấp 1 và xác định được sự đa dạng di truyền của 10 mẫu giống nấm sò bằng chỉ thị phân tử RAPD.

Yêu cầu Đánh giá sự sinh trưởng của các mẫu giống nấm sò trong giai đoạn nhân giống cấp 1. Xác định được quy trình tách chiết DNA phù hợp để thu được DNA tổng số có chất lượng tốt cho phản ứng PCR. Xác định quy trình chạy PCR với chỉ thị RAPD cho sản phẩm có tính lặp cao, băng vạch sắc nét, rõ ràng. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu giống nấm sò nghiên cứu.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về nấm sò 2. Khái quát chung Nấm sò có tên khoa học chung là Pleurotus spp., là một loài nấm ăn được thuộc họ Pleurotaceae. Nấm sò có tên tiếng Anh là oyster mushroom.

Nó còn được gọi là nấm bào ngư, nấm tai lệch, nấm xòe, nấm bèo. Nấm sò có nhiều loại khác nhau về màu sắc, hình dạng, khả năng thích nghi với các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Nấm sò có hình dạng phễu lệch, mọc thành cụm, mỗi cánh nấm gồm 3 phần: mũ, phiến, cuống. Khi trưởng thành nấm sò sẽ phát tán bào tử nhờ gió,bào tử gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm thành hệ sợi sơ cấp với một nhân.

Các sợi sơ cấp phát triển đầy đủ tạo nên hệ sợi thứ cấp, sau đó có sự kết hợp của hệ sợi nấm thứ cấp hình thành quả thể nấm hoàn chỉnh. Nấm sò được nuôi trồng nhân tạo Nấm sò là loài sống hoại sinh. Nó có khả năng thích nghi với nhiều loại giá thể nuôi trồng và các điều kiện sinh thái khác nhau. Phân loại Nấm sò có tên khoa học chung là Pleurotus spp.

Theo Trịnh Tam Kiệt (2011), nấm sò (Pleurotus ostreatus) được phân loại như sau: Ngành: Basidiomycota R.Moore (1980); ngành phụ Agaricomycotina Doweld (2001); lớp Agaricomycetes; lớp phụ: Agaricomycetidae Parmasto (1986); bộ: 3 Agaricales Underw, (1899); họ:Pleurotaceae Kühner(1980); chi: Pleurotus (Fr. (1871); Loài: Pleurotus ostreatus (Jacq. Theo Kirk và cs. Đặc điểm hình thái Nấm sò khác nhau về màu sắc, hình dạng và khả năng thích nghi với các điều kiện nhiệt độ khác nhau.

Nấm sò có dạng phễu lệch, có màu trắng, xám, xám nâu, nâu tím đến tím, vàng, hồng. Mức độ màu sắc có thể thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố môi trường như ánh sáng và nhiệt độ. Nhìn chung màu sắc sẽ tối hơn trong điều kiện nhiều ánh sáng, nhiệt độ lạnh; sáng hơn khi ánh sáng yếu và thời tiết nóng. Tai nấm còn non có màu sắc tối, nhưng khi trưởng thành, màu trở nên sáng hơn.

Nấm sò thường mọc thành cụm, mỗi cụm thường có nhiều cánh nấm, mỗi cánh nấm gồm 3 phần: mũ, phiến, cuống. Mũ nấm thường đạt kích thước 5 – 15 cm đường kính. Bề mặt mũ phẳng, không có lông. Phiến nấm mọc ở dưới mặt mũ, men dài xuống cuống màu trắng hoặc xám.

Cuống nấm ngắn, hình trụ đính giữa, đính lệch đến đính bên mũ, phần gốc có phủ lông ngắn. Thịt nấm màu trắng, lúc đầu nạc, mềm, sau già chuyển sang dai. Đảm nấm sò hình chùy, bụi bào tử màu trắng đến màu xám. Bào tử trong suốt (dưới kính hiển vi), hình trụ - elip, kích thước 8 - 12 x 3 - 4 μm.

Chu trình sống của nấm sò Hình 2. Chu trình sống của nấm sò (Nguồn Martinez – Carrera, 1999) 4 Nấm sò là loại dị tản hai yếu tố (bifactorial heterothallism). Chu kỳ sống được bắt đầu từ khi quả thể trưởng thành, hình thành và phóng bào tử. Trên lớp tế bào sinh sản tế bào mẹ của đảm tăng kích thước chứa đầy chất nguyên sinh có dạng hình chùy chuyển thành đảm non.

Các đảm ban đầu có hai nhân, sau đó xảy ra quá trình dung hợp nhân. Tiếp theo đó có sự phân chia giảm nhiễm để cho 4 nhân con. Lúc này, ở phần đỉnh của đảm mọc ra 4 mấu lồi, nội chất cũng như nhân từng chiếc một đi qua mấu lồi, hình thành nên 4 đảm bào tử ngoại sinh bằng cách nảy chồi phình lên và thắt dần lại. Khi phóng bào tử, một lớp trong suốt được hình thành giữa vùng rốn của bào tử đảm và đỉnh của tiểu bính, lớp trong suốt này sau đó được tách thành đôi, từ đó giải phóng bào tử.

Sau khi giải phóng một bào tử đảm, lớp màng sinh chất ở đỉnh của tiểu bính có dạng lồi và thành tế bào của tiểu bính mở rộng để bao lấy lớp màng này. Khi gặp điều kiện thuận lợi các bào tử đảm này nảy mầm tạo ra hệ sợi đơn bội, có vách ngăn, không có khóa. Các sợi đơn bội này nếu mọc riêng rẽ nhìn chung bất thụ và không hình thành bào tử hữu tính. Khi hai sợi nấm đơn bội khác tính tiếp xúc với nhau, chúng hòa tan màng, đổ nội chất tạo nên sợi song hạch (2 nhân) có vách ngăn với khóa điển hình.

Khi gặp điều kiện thuận lợi sợi song hạch liên kết lại tạo nên mầm mống quả thể dạng mấu lồi nhỏ, màu trắng. Từ mầm mống quả thể này phát triển nhanh chóng tạo nên mầm mống đơn độc dạng búp măng hay phân nhánh dạng san hô có chung gốc. Sau phía đỉnh của nấm phình ra dạng đầu đinh đó là các quả thể nấm non, chúng phát triển to dần lên, phần mầm nấm dưới tạo nên cuống nấm, phần mũ đỉnh phát triển thành mũ nấm với các phiến ở phía dưới. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm sò 2.

Yếu tố ngoại cảnh a. Nhiệt độ Nấm sò có thể trồng quanh năm nhưng thuận lợi nhất từ tháng 9 năm trước đến tháng 4 năm sau. Nhiệt độ thích hợp với nấm sò: - Nhóm chịu lạnh từ 13 – 20oC. - Nhóm chịu nhiệt độ cao từ 24 – 28oC.

Độ ẩm Độ ẩm cơ chất thích hợp cho sự mọc của hệ sợi là 60 - 62%. Để hình thành 5 mầm mống quả thể và mầm nấm cần độ ẩm cao đến 93 – 94% nhưng khi nấm đã gần trưởng thành lại thấp hơn (khoảng 80%). Ánh sáng Ánh sáng không cần thiết trong quá trình nuôi sợi. Ánh sáng là yếu tố khởi đầu cho sự hình thành mầm quả thể, mầm nấm và cần thiết cho sự phát triển bình thường của quả thể.

Nếu thiếu ánh sáng hoàn toàn, nấm sẽ không hình thành quả thể hoặc dạng mô sẹo; nếu quá ít sẽ hình thành quả thể dạng san hô; nếu quá thiếu nấm sẽ có mũ nhỏ, cuống dài. Do vậy khi nấm hình thành quả thể cần ánh sáng khuếch tán (300 - 400 lux). Độ thông thoáng Hệ sợi nấm sò có thể chịu được nồng độ CO2 khá lớn. Sợi nấm vẫn có thể sinh trưởng mảnh ở nồng độ CO2 1500 – 2000 ppm.

Chỉ khi nồng độ CO2 tăng lên tới 3000 ppm sinh trưởng của hệ sợi nấm mới suy giảm. Quả thể nấm sò lại không chịu được nồng độ CO2 cao. Khi nồng độ CO2 trong nhà nuôi trồng hoặc trong bịch nấm cao hơn 600 ppm thì cuống nấm sẽ dài ra và sự sinh trưởng của mũ nấm bị ngăn cản. Độ pH Cơ chất trồng nấm và nước tưới cần pH = 6,5 – 7,0.

Yếu tố dinh dưỡng Nấm sò có hệ enzyme rất mạnh, không những phân hủy được cellulose, hemicellulose mà còn phân hủy được cả lignin. Sợi nấm mọc nhanh, khỏe, tạo ra một lượng sinh khối lớn trong giá thể. Vì vậy có thể sử dụng nhiều loại giá thể có nguồn gốc khác nhau để trồng nấm sò: mùn cưa (sawdust), rơm (paddy straw), bông phế loại (waste cotton), bã mía (bagasse),. Tỷ lệ C/N = 30/1 (cần ít N) Muối khoáng và vitamin: trong nuôi trồng không cần bổ sung muối khoáng, có thể bổ sung lượng nhỏ cám để cung cấp vitamin.

Giá trị dinh dưỡng và giá trị dược liệu của nấm sò 2.