Luận án nghiên cứu quy trình phân lập nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm đầu khỉ hericium erinaceus bull fr pers và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh họ

Luận án nghiên cứu quy trình phân lập và nhân giống nấm đầu khỉ Hericium erinaceus, tách chiết polysaccharide có hoạt tính sinh học.

• Tác giả: Cồ Thị Thùy Vân
• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Nấm Dược Liệu
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Nhân Giống Nấm Đầu Khỉ Và Chiết Xuất Polysaccharide
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. Chƣơng 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu
• 1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu
• 1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng
• 1.4. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu
• 1.5. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta
• 1.6. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.
• 1.7. Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.
• 1.8. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học
• 1.9. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm Đầu khỉ
• 1.10. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H.
• 1.11. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ
• 1.12. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ
• 1.13. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước
• 1.14. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả thể và hệ sợi nấm dược liệu
• 1.14.1. Phương pháp tách chiết trong cồn
• 1.14.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng
• 1.14.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm
• 1.14.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm
• 2. Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các loại môi trƣờng
• 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ
• 2.4. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ
• 2.5. Phân lập giống nấm Đầu khỉ
• 2.6. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân lập giống gốc
• 2.7. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ
• 2.8. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp.
• 2.9. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung tích 200 ml)
• 2.10. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung tích 2000 - 5000 ml)
• 2.11. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít)
• 2.12. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể
• 2.13. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
• 2.14. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ
• 2.15. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
• 2.16. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.17. Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit amin trong nấm Đầu khỉ
• 2.18. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
• 2.19. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể nấm nấm Đầu khỉ
• 2.20. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
• 2.21. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp
• 2.22. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
• 2.23. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro
• 2.24. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo
• 2.25. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm
• 2.26. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H.
• 3.2. Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên diện hẹp
• 3.3. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn
• 3.4. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm
• 3.5. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu
• 3.6. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ He1
• 3.7. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ
• 3.8. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ
• 3.9. Xác định thời điểm phân lập
• 3.10. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ
• 3.10.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi giống gốc
• 3.10.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi
• 3.10.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của sợi nấm
• 3.11. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ
• 3.12. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
• 3.13. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích 200ml)
• 3.14. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng
• 3.15. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1
• 3.16. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
• 3.17. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể
• 3.18. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
• 3.19. Chế độ nuôi giống
• 3.19.1. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc
• 3.19.2. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ
• 3.20. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
• 3.21. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích 2000ml – 5000ml)
• 3.22. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng
• 3.23. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
• 3.24. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2
• 3.25. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể
• 3.26. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít
• 3.27. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít
• 3.28. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể
• 3.29. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít
• 3.30. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể tích 120 lit
• 3.31. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng
• 3.32. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít
• 3.33. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120 lít
• 3.34. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của nuôi trồng dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men)
• 3.35. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể.
• 3.36. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm bệnh trong môi trường nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
• 3.37. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể
• 3.38. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
• 3.39. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong nuôi trồng
• 3.40. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể
• 3.41. Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể
• 3.42. Kết quả tách chiết và thử hoạt tính sinh học của polysaccaride từ nấm Đầu khỉ H.
• 3.43. Nghiên cứu quy trình tách chiết
• 3.44. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
• 3.45. Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH
• 3.46. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 trong từng thời điểm nuôi
• 3.47. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng
• 3.48. Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được
• 3.49. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay)
• 3.50. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay)
• 3.51. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid
• 3.52. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm
• 3.52.1. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1
• 3.52.1.1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ
• 3.52.1.2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế phẩm HT1 6 tuần
• 3.52.1.3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần
• 3.52.1.4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT, SGPT của thỏ
• 3.52.1.5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ
• 3.52.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm HT1
• 3.52.3. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu
• 4. Chƣơng 4. KẾT LUẬN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG PHẠM VI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nấm đầu khỉ và quy trình nhân giống

Nấm đầu khỉ, hay còn gọi là Hericium erinaceus, là một loại nấm dược liệu có giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Nghiên cứu về nhân giống nấm này đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Quy trình nhân giống nấm bao gồm nhiều bước từ việc lựa chọn giống, nuôi trồng đến thu hoạch. Việc áp dụng công nghệ sinh học trong quy trình nhân giống giúp tăng năng suất và chất lượng nấm. Theo nghiên cứu, nấm đầu khỉ có chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tốt cho sức khỏe, bao gồm khả năng tăng cường hệ miễn dịch và chống ung thư. Việc phát triển quy trình nhân giống nấm hiệu quả không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu

Nghiên cứu về nấm dược liệu đã diễn ra mạnh mẽ trong những năm gần đây. Nấm đầu khỉ được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, từ việc hỗ trợ điều trị bệnh đến việc cải thiện sức khỏe tổng thể. Tình hình sản xuất nấm dược liệu tại Việt Nam đang trên đà phát triển, với nhiều mô hình nuôi trồng hiện đại. Việc áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nấm giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy, nấm đầu khỉ có thể được nuôi trồng trên nhiều loại cơ chất khác nhau, từ đó mở rộng khả năng sản xuất và đáp ứng nhu cầu thị trường.

II. Quy trình chiết xuất polysaccharide từ nấm đầu khỉ

Quy trình chiết xuất polysaccharide từ nấm đầu khỉ bao gồm nhiều phương pháp khác nhau, như chiết xuất bằng nước nóng, cồn, và kiềm. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến hàm lượng và hoạt tính của polysaccharide thu được. Nghiên cứu cho thấy, phương pháp chiết xuất bằng nước nóng cho hàm lượng polysaccharide cao nhất, đồng thời giữ được các hoạt tính sinh học của nấm. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất không chỉ giúp tăng hiệu suất thu hồi mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm. Các polysaccharide thu được từ nấm đầu khỉ đã được chứng minh có tác dụng kháng vi sinh vật và chống ung thư, mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong y học.

2.1. Phương pháp chiết xuất polysaccharide

Các phương pháp chiết xuất polysaccharide từ nấm đầu khỉ bao gồm chiết xuất trong nước nóng, cồn và kiềm. Mỗi phương pháp có những đặc điểm riêng, ảnh hưởng đến chất lượng và hàm lượng polysaccharide thu được. Nghiên cứu cho thấy, chiết xuất bằng nước nóng cho kết quả tốt nhất về hàm lượng và hoạt tính sinh học. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, polysaccharide từ nấm đầu khỉ có khả năng kháng vi sinh vật và có tác dụng tích cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh.

III. Tác dụng và ứng dụng của polysaccharide từ nấm đầu khỉ

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng polysaccharide từ nấm đầu khỉ có nhiều tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người. Chúng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, chống viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu cũng cho thấy, polysaccharide có thể hỗ trợ điều trị một số loại ung thư thông qua cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Việc ứng dụng polysaccharide trong y học cổ truyền và hiện đại đang được quan tâm nghiên cứu. Sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và y học có thể tạo ra những sản phẩm mới, an toàn và hiệu quả cho sức khỏe.

3.1. Tác dụng kháng vi sinh vật và chống ung thư

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng polysaccharide từ nấm đầu khỉ có tác dụng kháng vi sinh vật mạnh mẽ. Các thử nghiệm cho thấy, chúng có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và nấm gây hại. Bên cạnh đó, polysaccharide cũng cho thấy hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong các nghiên cứu in vitro và in vivo. Điều này mở ra triển vọng cho việc phát triển các sản phẩm chức năng từ nấm đầu khỉ, phục vụ cho việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học" do nghiên cứu sinh Cồ Thị Thùy Vân thực hiện thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học / Vi sinh vật học và Công nghệ thực phẩm.

Ngành sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu tại Việt Nam sở hữu tiềm năng lớn nhờ nguồn phế phụ liệu nông - lâm nghiệp dồi dào (rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân bắp, lõi ngô). Tuy nhiên, thực tế sản xuất trong nước chủ yếu áp dụng phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn truyền thống (môi trường thạch, mùn cưa, thóc hạt, que sắn). Phương pháp này tồn tại nhiều nhược điểm: chu kỳ nhân giống kéo dài, tuổi giống không đồng nhất trong chai/túi, hệ số nhân giống thấp, khó cơ giới hóa - tự động hóa, nguy cơ nhiễm tạp cao và chi phí nhân công, điện năng lớn. Công nghệ nhân giống dạng dịch thể (lên men chìm/tầng sâu) giải quyết được các hạn chế trên nhờ rút ngắn chu kỳ sinh trưởng, đảm bảo độ đồng đều sinh lực hệ sợi, dễ kiểm soát chất lượng và hạ giá thành sản xuất. Nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus) là loài nấm dược liệu quý có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính trị liệu cao, nhưng các nghiên cứu nhân giống dịch thể trước đó tại Việt Nam mới ở quy mô thăm dò, chưa hoàn thiện quy trình đồng bộ từ phòng thí nghiệm đến sản xuất lớn.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 4 nội dung:

1. Đưa ra được quy trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus;
2. Đưa ra được quy trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus dạng dịch thể các cấp với dung tích từ 200 ml đến 120 lít;
3. Đưa ra được quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể;
4. Đưa ra được quy trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus thành phẩm và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này.

Đối tượng nghiên cứu là loài nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc khảo nghiệm 4 chủng giống (He1, He2, He3, He4), tối ưu hóa các thông số nhân giống dịch thể 3 cấp độ (200 ml, 2.000–5.000 ml, 120 lít), khảo sát điều kiện nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp dạng bịch, chiết tách polysaccharide tổng số (ký hiệu HT1) bằng dung dịch kiềm NaOH và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro, in vivo. Nghiên cứu gắn liền với Đề tài trọng điểm cấp nhà nước KC.06/11-15 (mã số KC06.01/11-15, thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014) và Đề tài Nghị định thư cấp nhà nước (2011–2013), thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm (Trường Đại học Bách khoa Hà Nội), Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật (Viện Di truyền Nông nghiệp).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng hợp có hệ thống các công trình nghiên cứu về công nghệ nhân giống, nuôi trồng và hoạt tính dược lý của nấm dược liệu nói chung và nấm Đầu khỉ nói riêng:

• Về công nghệ nhân giống dịch thể: H. Humfeld (1947) là người đầu tiên báo cáo kỹ thuật lên men tầng sâu giống nấm Mỡ (Agaricus bisporus) tại Mỹ, mở ra hướng sản xuất sinh khối dạng lỏng. Tại các quốc gia như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đức, công nghệ này đã được áp dụng trên hơn 50 loài nấm ăn và nấm dược liệu (Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes, Ganoderma lucidum, Auricularia auricula). Tại Việt Nam, các đơn vị như Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật (Viện Di truyền Nông nghiệp) đã thử nghiệm nhân giống dịch thể quy mô 200 ml – 100 lít trên nấm Sò, nấm Mỡ, nấm Linh chi, nhưng tỷ lệ nhiễm còn cao (>30%) và chưa thương mại hóa.
• Về nuôi trồng nấm Đầu khỉ: Chang S. (1989), Ahmed Imtiaj và cs (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của 10 nguồn carbon đến hệ sợi H. erinaceus. Burkhard Kirchhoff nghiên cứu 15 chủng nấm Đầu khỉ, xác định môi trường mùn cưa dẻ phối trộn 20% cám ngô cho năng suất cao nhất (400 g/túi 2 kg), phân lập các chủng He1 (Bỉ), He2 (Đức), He6 (Hà Lan), He13 (Nhật Bản) và nuôi cấy giống lỏng trong bình lên men 12 lít Braun (theo phương pháp của Song và Cho, 1987). Hassan (Ai Cập) nghiên cứu nuôi trồng trên mùn cưa. Ở Việt Nam, Nguyễn Lân Dũng và Đinh Xuân Linh tổng kết 10 công thức phối trộn cơ chất (mùn cưa, vỏ hạt bông, rơm rạ, lõi ngô, bã mía phối hợp cám gạo, bột ngô, thạch cao) và quy trình nuôi cấy chìm thu sinh khối.
• Về hoạt tính sinh học và tách chiết polysaccharide: Ikekawa và cs (1969) chứng minh hoạt tính kháng u thực nghiệm sarcoma 180 của nấm lớn họ Polyporaceae. Mizuno (1999) xây dựng quy trình chiết đa bước (etanol nóng, nước nóng, NaOH 5%, axit oxalat 1%). Yap và Ng (2001) tinh chế $\beta$-glucan từ nấm Hương bằng kết tủa cồn và đông khô nitơ lỏng (độ tinh khiết 87,5%). Carbonero và cs (2006) chiết $\beta$-glucan từ Pleurotus. Sheng-Quan Huang và cs (2010) tối ưu hóa chiết polysaccharide từ Ganoderma lucidum bằng NaOH 5,1% kết hợp vi sóng và siêu âm (hiệu suất 8,21%). Yilin M. kết hợp vi sóng, siêu âm và nước nóng chiết polysaccharide từ H. erinaceus. Wong và cs, Kolotushkina và cs, Han và cs chứng minh dịch chiết H. erinaceus có tác dụng tái tạo màng myelin tế bào thần kinh, chống oxy hóa và giảm tổn thương thận do thiếu máu cục bộ. Ở Việt Nam, Nguyễn Thượng Dong và Bùi Thị Bằng (2005), Lê Mai Hương và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi và một số loài nấm lớn.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết là: Xây dựng hoàn chỉnh chuỗi quy trình công nghệ khép kín từ phân lập giống gốc, nhân giống dịch thể 3 cấp mở rộng từ 200 ml lên quy mô bán công nghiệp 120 lít, ứng dụng trực tiếp giống dịch thể vào nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên cơ chất tổng hợp tại Việt Nam; đồng thời tối ưu hóa quy trình chiết kiềm thu nhận polysaccharide tổng số HT1 và kiểm tra toàn diện tính an toàn cũng như hiệu lực sinh học (kháng vi sinh vật, độc tế bào ung thư, ức chế u 3 chiều, bảo vệ phóng xạ, phục hồi tạo máu) trên mô hình thực nghiệm in vitro và in vivo.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết về polysaccharide và $\beta$-glucan: Polysaccharide trong nấm lớn là các phức hợp carbohydrate trọng lượng phân tử cao cấu tạo từ các đơn vị monosaccharide liên kết bằng cầu nối glycoside. Trong đó, $\beta$-glucan có cấu trúc trục chính liên kết $\beta$-(1,3) và các nhánh bên $\beta$-(1,6) giữ vai trò then chốt trong hoạt tính sinh học. $\beta$-glucan không tan hoặc tan tạo dung dịch keo, có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch thông qua gắn kết đặc hiệu với thụ thể trên bề mặt đại thực bào (Macrophage) và tế bào sát thủ tự nhiên (NK Cell), kích thích giải phóng cytokine, tăng sinh tế bào miễn dịch tủy xương, ức chế tế bào ung thư và bảo vệ tế bào lành trước tác hại của tia phóng xạ.
• Nguyên lý lên men chìm (nhân giống dịch thể): Hệ sợi nấm phát triển dưới dạng sinh khối hạt/cầu (pellet/khuẩn lạc cầu) phân tán đều trong môi trường lỏng giàu dinh dưỡng được cung cấp oxy hòa tan liên tục qua khuấy lắc hoặc sục khí vô trùng, loại bỏ giới hạn truyền khối và pha sinh trưởng kéo dài của phương pháp nuôi cấy cơ chất rắn.

Vật liệu và phương pháp thực nghiệm

• Nguồn giống nấm: 4 chủng Hericium erinaceus lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp gồm: He1, He2 (du nhập từ Trung Quốc năm 2009) và He3, He4 (du nhập từ Nhật Bản năm 1998).
• Vi sinh vật kiểm định: Vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923); Vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis ATCC 27212, Staphylococcus aureus ATCC 12222); Nấm sợi (Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum M42); Nấm men (Candida albicans ATCC 7754, Saccharomyces cerevisiae SH20).
• Dòng tế bào ung thư người: MCF7 (ung thư biểu mô vú), Lu (ung thư phổi) từ ĐH Dược Illinois; HepG2 (ung thư gan người), RD (ung thư mô liên kết) từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Động vật thực nghiệm: Thỏ khỏe mạnh (2,0 $\pm$ 0,2 kg), Chuột nhắt trắng (20,0 $\pm$ 2,0 g).
• Môi trường và điều kiện nuôi cấy: Môi trường PGA (khoai tây 20 g, glucose 20 g, agar 20 g, nước 1.000 ml); môi trường Czapek cải tiến đối chứng; các môi trường dịch thể CT8 (cấp 1), CT12 (cấp 2), CT16 (nồi lên men 120 lít); cơ chất nuôi trồng phối trộn từ mùn cưa (cao su, keo, bồ đề), cám gạo, bột ngô, bã mía, lõi ngô, thạch cao ($CaSO_4$).
• Kỹ thuật chiết tách và phân tích: Tách chiết bằng dung dịch kiềm NaOH nóng, đo độ nhớt bằng nhớt kế Ubbelohde, định lượng polysaccharide tổng số bằng phương pháp phenol - axit sulfuric ($H_2SO_4$), phân tích phổ khối lượng (MS).
• Kỹ thuật đánh giá hoạt tính sinh học: Phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định hoạt tính kháng khuẩn/nấm; thử nghiệm độc tính tế bào in vitro (Cytotoxicity assay, xác định $IC_{50}$); thử nghiệm ức chế tạo khối u 3 chiều trên thạch mềm in vitro (Anti-tumor promoting assay); thử nghiệm độc tính bán trường diễn trên thỏ (theo dõi thể trọng, điện tim DII, công thức máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin; hoạt độ enzym SGOT, SGPT; nồng độ creatinin huyết thanh); thử nghiệm in vivo bảo vệ phóng xạ và phục hồi tạo máu trên chuột nhắt trắng bị chiếu xạ.
• Phương pháp xử lý số liệu: Thống kê sinh học xử lý số liệu thực nghiệm.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng thuật chi tiết bức tranh sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu toàn cầu và tại Việt Nam. Trung Quốc dẫn đầu thế giới với sản lượng 25,71 triệu tấn nấm (năm 2011), chiếm 60% toàn cầu, đạt giá trị ròng 28.500 Nhân dân tệ/mẫu/năm (cao gấp 3,8 lần cà chua nhà kính, 29,4 lần bông, 53,8 lần ngô và 67,1 lần lúa mì). Việt Nam đạt sản lượng 250.000 tấn nấm năm 2011, xuất khẩu đạt 90 triệu USD/năm, phân bố theo vùng: nấm Rơm ở miền Tây/Đông Nam Bộ (chiếm 90%), Mộc nhĩ ở miền Đông Nam Bộ (chiếm 70%), nấm Mỡ, Sò, Hương ở miền Bắc (khoảng 30.000 tấn). Chương 1 phân tích cơ chế miễn dịch của $\beta$-(1,3/1,6)-glucan, các đặc điểm sinh học của nấm Đầu khỉ và tổng kết các phương pháp chiết polysaccharide của Mizuno, Yap - Ng, Sheng-Quan Huang và Yilin M.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc 4 chủng nấm Đầu khỉ (He1–He4), 8 chủng vi sinh vật kiểm định, 4 dòng tế bào ung thư người và động vật thí nghiệm (thỏ, chuột). Thiết lập các công thức môi trường giữ giống, môi trường dịch thể trung gian cấp 1 (CT8, dung tích 200 ml), cấp 2 (CT12, dung tích 2.000–5.000 ml) và môi trường nồi lên men 120 lít (CT16). Chi tiết hóa các phương pháp bố trí thí nghiệm: phân lập mô/bào tử, tối ưu hóa thông số sục khí (0,4–0,5 l khí/l dịch/phút), chất phá bọt (Tween 80, antifoam, dầu đậu tương), phối trộn cơ chất nuôi trồng dạng bịch, quy trình chiết kiềm NaOH, đo độ nhớt Ubbelohde, phổ MS, thử hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, ức chế tạo u thạch mềm và thử nghiệm dược lý in vivo trên động vật.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 4 nhóm nội dung lớn:

1. Tuyển chọn và phân lập lại giống nấm Đầu khỉ

Khảo nghiệm diện hẹp 4 chủng giống (He1, He2, He3, He4) trên môi trường PGA và cơ chất tổng hợp CTNT1 xác định chủng He1 (nguồn gốc Trung Quốc) có ưu thế vượt trội: hệ sợi mọc dày đặc, phân nhánh khỏe, tốc độ lan sợi nhanh nhất, thời gian nuôi sợi ngắn (35 ngày so với 40–45 ngày ở các chủng khác), năng suất đạt cao nhất và khả năng kháng bệnh mốc xanh (Trichoderma sp.), mốc đen tốt. Phân tích thành phần dinh dưỡng của He1 cho thấy hàm lượng protein, khoáng chất, vitamin và các axit amin thiết yếu đạt mức cao. Phương pháp phân lập từ mô thịt quả thể ở giai đoạn bánh tẻ (khi quả thể đạt kích thước chuẩn, tua nấm chưa chuyển vàng và chưa phóng thích bào tử mạnh) cho tỷ lệ mọc sợi thuần khiết 100% và chất lượng giống gốc ổn định nhất. Môi trường Czapek bổ sung đường maltose hoặc glucose kết hợp nguồn nitơ hữu cơ (cao nấm men, bột đậu tương) và nhiệt độ 22–25°C là tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi giống gốc.

Chỉ tiêu theo dõi	Chủng He1 (Trung Quốc)	Chủng He2 (Trung Quốc)	Chủng He3 (Nhật Bản)	Chủng He4 (Nhật Bản)
Đặc điểm hệ sợi trên PGA	Mọc đều, dày đặc, trắng tuyền	Mọc khá dày, sợi mịn	Sợi mỏng, mọc chậm hơn	Sợi thưa, tốc độ trung bình
Thời gian nuôi sợi (ngày)	35	38	42	45
Năng suất quả thể thương phẩm	Cao nhất	Khá	Trung bình	Trung bình
Khả năng chống chịu sâu bệnh	Kháng tốt mốc xanh, mốc đen	Kháng trung bình	Dễ nhiễm khi ẩm độ cao	Nhiễm nhẹ mốc xanh

2. Xây dựng quy trình nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 3 cấp

• Cấp 1 (dung tích 200 ml): Môi trường CT8, khử trùng ở 115–121°C, pH 5,5–6,0, tỷ lệ cấy chuyển 3–5 miếng thạch giống gốc/bình, nuôi lắc ở 140–160 vòng/phút, nhiệt độ 24–26°C. Sau 5–7 ngày thu được sinh khối sợi dạng khuẩn lạc cầu đồng nhất, giàu hoạt lực.
• Cấp 2 (dung tích 2.000–5.000 ml): Môi trường CT12, tỷ lệ tiếp giống từ cấp 1 là 5–10% (thể tích/thể tích), chế độ sục khí vô trùng 0,4–0,5 lít khí/lít dịch/phút, bổ sung chất phá bọt dầu đậu tương (0,5 ml/l) hoặc antifoam. Thời gian nuôi cấy 6–7 ngày đạt đỉnh đường cong sinh trưởng.
• Quy mô bán công nghiệp (nồi lên men 120 lít): Môi trường CT16, tỷ lệ giống cấy từ cấp 2 là 10%, áp suất làm việc 0,5 $\times$ $10^5$ Pa, nhiệt độ 24–26°C. Sau 5 ngày lên men, sinh khối sợi nấm đạt cực đại, sẵn sàng đưa vào cấy chuyển nuôi trồng đại trà.

Thông số công nghệ	Giống dịch thể Cấp 1	Giống dịch thể Cấp 2	Lên men Pilot Cấp 3
Dung tích môi trường	200 ml (bình tam giác)	2.000 – 5.000 ml	120 lít (nồi lên men)
Công thức môi trường	CT8	CT12	CT16
Chế độ cung cấp oxy	Lắc cơ học 140–160 rpm	Sục khí 0,4–0,5 l/l/phút	Sục khí + khuấy cơ học
Tỷ lệ cấy giống	3–5 miếng thạch giống gốc	5 – 10% dịch cấp 1	10% dịch cấp 2
Thời gian nuôi cấy	5 – 7 ngày	6 – 7 ngày	5 ngày
Hình thái sinh khối thu nhận	Khuẩn lạc cầu nhỏ, nhiều tua gai	Hạt cầu phân tán đồng đều	Sinh khối sợi đậm đặc

3. Quy trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ bằng giống dịch thể trên cơ chất tổng hợp

Cơ chất nuôi trồng tối ưu gồm: mùn cưa cao su/keo/bồ đề (78%), cám gạo (15–20%), bột ngô (3–5%), thạch cao (1%), độ ẩm nguyên liệu đạt 60–65%. Nguyên liệu đóng bịch chịu nhiệt (khối lượng 1,2–1,5 kg/bịch), khử trùng nhiệt. Khi cấy giống dịch thể với tỷ lệ 15–20 ml/bịch, thời gian sợi nấm lan kín cơ chất rút ngắn xuống còn 28–32 ngày (so với 42–45 ngày khi dùng giống hạt cơ chất rắn). Giai đoạn ra quả thể duy trì nhiệt độ 16–20°C, độ ẩm không khí 85–95%, thông khí định kỳ kiểm soát $CO_2 < 0,1%$. Năng suất nấm tươi trung bình qua 3 đợt sản xuất lặp lại đạt 220–250 kg nấm tươi/1 tấn nguyên liệu khô (hiệu suất sinh học đạt 40–45%), cao hơn rõ rệt so với phương pháp truyền thống.

Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật	Quy trình dùng giống cơ chất hạt	Quy trình dùng giống dạng dịch thể
Thời gian lan kín bịch sợi (ngày)	42 – 45	28 – 32
Tỷ lệ nhiễm bệnh trong ươm sợi	8 – 12%	< 3%
Thời gian xuất hiện mầm quả thể	10 – 14 ngày sau mở nút	5 – 7 ngày sau mở nút
Năng suất nấm tươi / 1 tấn nguyên liệu	160 – 180 kg	220 – 250 kg
Hiệu quả kinh tế (lợi nhuận ròng)	Mức cơ sở	Tăng 25 – 30% do giảm chi phí và tăng sản lượng

4. Tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của Polysaccharide HT1

• Quy trình chiết: Dung dịch kiềm NaOH cho hiệu suất chiết và độ nhớt cao nhất so với KOH hay $Na_2CO_3$. Nồng độ NaOH tối ưu là 4–5%, chiết ở 80°C trong 4–6 giờ. Quả thể thu hái đúng độ chín chứa hàm lượng polysaccharide tổng số cao nhất (đạt 6,5–7,8% trọng lượng khô); mẫu nấm bảo quản sau 6 tháng có sự suy giảm nhẹ hàm lượng polysaccharide.
• Hoạt tính kháng vi sinh vật: Phân đoạn polysaccharide HT1 thể hiện khả năng ức chế rõ rệt đối với vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và nấm men Candida albicans.
• Hoạt tính độc tế bào và ức chế tạo khối u: Thử nghiệm in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư người cho thấy HT1 có tác dụng gây độc tế bào với các giá trị $IC_{50}$ cụ thể trên dòng MCF7 (ung thư vú), Lu (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) và RD (ung thư mô liên kết). Thử nghiệm trên thạch mềm chứng minh HT1 ức chế hiệu quả sự tạo cụm/khối u 3 chiều của tế bào ung thư.
• Độc tính và tính an toàn in vivo trên thỏ: Chế phẩm HT1 dùng đường uống liên tục trong 6 tuần không làm thay đổi bất thường về thể trọng, không gây rối loạn tần số tim, biên độ sóng hay xuất hiện sóng bệnh lý trên điện tim đạo trình D II. Các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, nồng độ hemoglobin), chỉ số enzym gan (SGOT, SGPT) và chỉ số chức năng thận (creatinin) duy trì ổn định trong giới hạn sinh lý bình thường tại các thời điểm kiểm tra (XPĐ, 3 tuần, 6 tuần).
• Tác dụng bảo vệ phóng xạ và phục hồi tạo máu trên chuột: Chuột nhắt trắng uống HT1 liều 0,5 g/kg thể trọng/24 giờ liên tục trong 30 ngày trước khi chiếu xạ có tỷ lệ sống sót cao hơn rõ rệt so với lô đối chứng chiếu xạ đơn thuần; số lượng tế bào tủy xương và tế bào máu ngoại vi phục hồi nhanh chóng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đạt được những kết quả và đóng góp mới về mặt khoa học cũng như thực tiễn:

1. Tuyển chọn được chủng nấm Đầu khỉ He1 có nguồn gốc rõ ràng, thích nghi tốt với điều kiện khí hậu Việt Nam, sinh trưởng nhanh, năng suất cao và phẩm chất tốt; xác lập chuẩn xác phương pháp phân lập lại từ mô thịt quả thể bánh tẻ để duy trì và bảo tồn nguồn gen giống gốc ổn định lâu dài.
2. Xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 3 cấp độ đồng bộ (200 ml, 2.000–5.000 ml và 120 lít). Quy trình kiểm soát chính xác các thông số môi trường, khử trùng, tỷ lệ giống cấy, tốc độ lắc, chế độ sục khí và chất chống tạo bọt, tạo cơ sở đưa công nghệ lên men lỏng vào sản xuất nấm dược liệu quy mô công nghiệp.
3. Hoàn thiện quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên cơ chất tổng hợp (mùn cưa kết hợp cám gạo, bột ngô, thạch cao) sử dụng giống dịch thể, giúp rút ngắn thời gian lan sợi 10–14 ngày, giảm tỷ lệ nhiễm bệnh xuống dưới 3% và nâng cao năng suất quả thể thương phẩm so với giống cơ chất rắn truyền thống.
4. Tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết tách polysaccharide tổng số (HT1) từ quả thể nấm Đầu khỉ bằng dung dịch kiềm NaOH nóng; chứng minh chế phẩm HT1 an toàn trên động vật thực nghiệm (không độc với tim, gan, thận, hệ tạo máu của thỏ sau 6 tuần sử dụng) và sở hữu các hoạt tính sinh học giá trị: kháng khuẩn, gây độc tế bào ung thư in vitro (MCF7, Lu, HepG2, RD), ức chế u 3 chiều trên thạch mềm, bảo vệ động vật chống bức xạ và kích thích quá trình tạo máu.

Kiến nghị của luận án: Triển khai chuyển giao công nghệ nhân giống dịch thể và nuôi trồng nấm Đầu khỉ cho các trung tâm, doanh nghiệp sản xuất nấm tập trung; tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học chi tiết của các phân đoạn $\beta$-glucan trong HT1 và phát triển các dạng bào chế thực phẩm chức năng hỗ trợ miễn dịch cho bệnh nhân ung thư hoặc người làm việc trong môi trường bức xạ.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu khảo sát trên tập hợp 4 chủng nấm Đầu khỉ xác định (He1–He4) và thực hiện trên các nguồn cơ chất phụ phẩm nông - lâm nghiệp tại khu vực phía Bắc. Các thử nghiệm hoạt tính sinh học và an toàn dược lý của chế phẩm polysaccharide HT1 mới dừng lại ở mô hình tế bào in vitro và động vật thực nghiệm (thỏ, chuột nhắt trắng), chưa tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên người.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng quy mô nồi lên men nhân giống dịch thể lên dung tích lớn hơn (>500–1.000 lít) để phục vụ các tổ hợp sản xuất công nghiệp;
  • Nghiên cứu tinh chế sâu từng phân đoạn polysaccharide đơn phân, giải mã cấu trúc phân tử bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR);
  • Tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng và thử nghiệm lâm sàng đối với các chế phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ polysaccharide nấm Đầu khỉ.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo giá trị cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Công nghệ thực phẩm, Dược học và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp phương pháp luận và số liệu thực nghiệm chi tiết về động thái sinh trưởng lên men chìm nấm lớn, kỹ thuật chiết tách kiềm và mô hình đánh giá dược lý in vitro/in vivo.
• Kỹ sư, cán bộ kỹ thuật tại các trung tâm công nghệ sinh học, trại sản xuất nấm: Có thể áp dụng trực tiếp quy trình nhân giống dịch thể 3 cấp (200 ml, 2–5 lít, 120 lít) và công thức cơ chất nuôi trồng bịch để nâng cao năng suất, hạ tỷ lệ nhiễm tạp và tự động hóa sản xuất.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Tham khảo quy trình công nghệ chiết xuất polysaccharide HT1 và các dẫn liệu an toàn - hoạt tính sinh học để định hướng nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ miễn dịch và hỗ trợ điều trị bệnh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng nấm Đầu khỉ nào được luận án tuyển chọn để xây dựng quy trình công nghệ và vì sao?
Luận án tuyển chọn chủng nấm Đầu khỉ ký hiệu He1 có nguồn gốc từ Trung Quốc (du nhập vào Việt Nam từ năm 2009). Chủng He1 vượt trội so với các chủng He2, He3, He4 về tốc độ sinh trưởng hệ sợi trên môi trường thuần khiết, sức sống sợi nấm cao, khả năng chống chịu sâu bệnh (đặc biệt là nấm mốc xanh, mốc đen) tốt nhất, thời gian nuôi sợi ngắn (35 ngày) và cho năng suất quả thể thương phẩm cao nhất.

2. Quy trình nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể được thiết lập qua các cấp dung tích nào?
Quy trình nhân giống dịch thể được thiết lập qua 3 cấp kế tiếp:

• Giống trung gian cấp 1: Dung tích 200 ml (nuôi lắc 140–160 rpm trong bình tam giác trên môi trường CT8, thời gian 5–7 ngày);
• Giống trung gian cấp 2: Dung tích 2.000 – 5.000 ml (lên men có sục khí 0,4–0,5 l/l/phút trên môi trường CT12, thời gian 6–7 ngày);
• Giống sản xuất cấp 3: Dung tích 120 lít (lên men trong nồi chuyên dụng trên môi trường CT16, tỷ lệ tiếp giống 10%, thời gian lên men 5 ngày).

3. Nuôi trồng nấm Đầu khỉ bằng giống dịch thể mang lại những ưu thế kỹ thuật và kinh tế nào so với giống hạt truyền thống?
Việc dùng giống dịch thể giúp rút ngắn thời gian lan kín hệ sợi trong bịch cơ chất từ 42–45 ngày xuống còn 28–32 ngày; giảm tỷ lệ nhiễm bệnh xuống dưới 3%; thời gian xuất hiện mầm quả thể nhanh hơn (5–7 ngày so với 10–14 ngày); năng suất nấm tươi tăng từ 160–180 kg lên 220–250 kg trên 1 tấn nguyên liệu khô (tăng hiệu quả kinh tế từ 25–30%).

4. Chế phẩm polysaccharide HT1 được chiết xuất bằng phương pháp nào và nồng độ hóa chất tối ưu là bao nhiêu?
Chế phẩm HT1 được chiết tách từ bột quả thể nấm Đầu khỉ khô bằng phương pháp chiết trong dung dịch kiềm NaOH nóng ở 80°C. Nồng độ NaOH tối ưu được xác định là 4–5%, cho hiệu suất chiết và độ nhớt dung dịch chiết đạt giá trị cao nhất.

5. Kết quả thử nghiệm an toàn và bảo vệ phóng xạ của chế phẩm HT1 trên động vật thí nghiệm cho thấy điều gì?
Thử nghiệm trên thỏ uống HT1 liên tục trong 6 tuần chứng minh chế phẩm an toàn: không gây biến đổi điện tim (đạo trình D II), không gây hại chức năng gan (SGOT, SGPT), thận (creatinin) và các chỉ số máu. Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng uống liều 0,5 g/kg/24 giờ trong 30 ngày cho thấy HT1 bảo vệ động vật trước tác hại chiếu xạ, tăng tỷ lệ sống sót và đẩy nhanh quá trình phục hồi tế bào tạo máu tủy xương.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Cồ Thị Thùy Vân đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc tuyển chọn thành công chủng nấm Đầu khỉ He1 và xây dựng hoàn chỉnh quy trình phân lập, bảo tồn giống gốc. Công trình đã chuẩn hóa thành công quy trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể 3 cấp độ mở rộng đến dung tích 120 lít và quy trình nuôi trồng nấm trên cơ chất tổng hợp, chứng minh ưu thế vượt trội về mặt sinh học và hiệu quả kinh tế so với phương pháp nhân giống cơ chất rắn truyền thống. Đồng thời, luận án đã tối ưu hóa quy trình chiết kiềm thu nhận chế phẩm polysaccharide tổng số HT1, xác lập đầy đủ dẫn liệu khoa học về tính an toàn và các hoạt tính sinh học quý giá (kháng khuẩn, độc tế bào ung thư, chống khối u, bảo vệ phóng xạ và phục hồi tạo máu). Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc phục vụ việc công nghiệp hóa nghề trồng nấm và phát triển các sản phẩm dược liệu từ nấm Đầu khỉ tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên. Nhiều loài nấm lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương… Trên thế giới có khoảng hơn 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai [16]. Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh đó điều kiện tự nhiên của nước ta rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm.

Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến cũng như thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu. Công nghệ nhân giống và nuôi trồng nấm ở nước ta hiện nay chỉ sử dụng giống nhân trên cơ chất rắn như nhân giống trên môi trường thạch, trên mùn cưa, thóc, que sắn; đây là phương pháp truyền thống tuy được sử dụng một cách phổ biến do quá trình sản suất đơn giản nhưng lại có một số nhược điểm sau: + Thời gian nhân giống các cấp kéo dài; + Giống nấm nhân trên cơ chất rắn có chất lượng không ổn định, tuổi giống không đồng nhất trong toàn bộ chai giống hay túi giống; + Phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn gặp nhiều khó khăn trong việc sản xuất giống với số lượng lớn do hệ số nhân giống thấp; + Thao tác cấy chuyển giống khó tự động hóa, chịu nhiều tác động của yếu tố ngoại cảnh làm tăng nguy cơ nhiễm. Việc kiểm soát nhiễm đối với giống nấm nhân trên cơ chất rắn cũng gặp nhiều khó khăn; + Nguyên liệu nhân giống đắt, chi phí nhân công, chi phí khấu hao điện năng, khấu hao nhà xưởng cao; Hiện nay, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống trên cơ chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội như: + Chu kỳ phát triển của giống nấm trong môi trường dịch thể nhanh, qua đó rút ngắn được thời gian nhân giống các cấp và nuôi trồng nấm; + Tuổi giống nấm dạng dịch thể đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định do được kiểm soát một cách nghiêm ngặt với các phương pháp thử đơn giản, có kết quả tức thì, độ chính xác cao; 1 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ + Sinh lực giống khỏe do giống phát triển trong môi trường dịch thể được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và được sử dụng trong đúng giai đoạn sinh trưởng mạnh nhất của hệ sợi; + Công nghệ nhân giống dạng dịch thể đáp ứng được mọi nhu cầu về giống từ qui mô nhỏ đến lớn, với hệ số nhân giống cao; + Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên vật liệu nhân giống, điện năng, nhân công. Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công nghiệp.

Đối tượng nghiên cứu của Luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull., đây là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để hỗ trợ điều trị hiệu quả một số bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh mất trí nhớ… Với các lợi ích lớn về giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đang rất quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống, nuôi trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe cộng đồng. Nhận định được tầm quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ mới vào sản xuất giống nấm và nấm thương phẩm, góp phần thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa ngành sản xuất nấm trong nước, qua đó tạo ra nguồn nguyên liệu có giá trị dược học cao cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm, tạo ra các sản phẩm chức năng phục vụ mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng, Nghiên cứu sinh đã lựa chọn thực hiện Luận án: “Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học” Luận án là một phần nội dung của Đề tài thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC.06/11-15 do Bộ Khoa học và Công nghệ chủ trì: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể để sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu”; mã số KC06.01/11-15; thời gian thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014, do Nghiên cứu sinh làm chủ nhiệm và Đề tài nghị định thư cấp nhà nước: “Nghiên cứu quá trình chuyển hóa các polymer tự nhiên bởi enzyme từ nấm Việt Nam”, thời gian thực hiện 2011-2013, do PGS.TS Lê Mai Hương làm chủ nhiệm. Mục tiêu của Luận án - Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus; - Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H.

erinaceus dạng dịch thể các cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít; - Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể; - Đưa ra được qui trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này; 2 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Nội dung của luận án - Xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus nhằm lựa chọn được giống nấm Đầu khỉ có chất lượng tốt, năng suất cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam, chủ động trong việc nhân giống, duy trì, bảo tồn nguồn giống ổn định cung cấp cho sản xuất; - Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể các cấp (giống trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 ml, giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít) để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp; - Nghiên cứu xây dựng qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống dạng dịch thể, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn; - Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ thành phẩm, đánh giá một số hoạt tính sinh học của hợp chất này.

Kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn như sau: - Ý nghĩa khoa học: + Đánh giá một số đặc tính sinh học và đưa ra một số kỹ thuật tuyển chọn, phân lập, nhân giống, nuôi trồng nấm Đầu khỉ là cơ sở cho việc định hướng tuyển chọn nguồn giống nấm dược liệu mới phù hợp để triển khai sản xuất đại trà trong điều kiện môi trường sinh thái của nước ta. + Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ góp phần làm thay đổi phương thức nhân giống nấm, sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm theo định hướng công nghiệp, áp dụng công nghệ sinh học vào sản xuất để dần thay thế phương pháp nhân giống nấm truyền thống (nhân giống trên cơ chất rắn như mùn cưa, thóc, đậu tương, đỗ xanh, kê, que gỗ…); đây là phương pháp nhân giống mới đang được các nước có ngành sản xuất nấm phát triển quan tâm nghiên cứu, ứng dụng do phương pháp nhân giống này có rất nhiều ưu điểm so với phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn. + Đưa ra qui trình tách chiết polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm Đầu khỉ nhằm khẳng định giá trị dược liệu của loại nấm này, kết quả nghiên cứu của luận án là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực sản xuất các thực phẩm chức năng từ nấm dược liệu phục vụ nền y học hiện đại, nâng cao sức khỏe cộng đồng. - Ý nghĩa thực tiễn: + Kết quả của luận án phù hợp với định hướng chính sách phát triển ngành nông nghiệp công nghệ cao, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất nông nghiệp nhằm tạo ra nguồn sản phẩm hàng hoá ổn định, thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp đặc biệt là tại các vùng nông thôn; + Kết quả của luận án là cơ sở thúc đẩy sự phát triển nghề trồng nấm ở Việt Nam, góp phần xúc tiến quá trình tuần hoàn sinh học có ích trong nông nghiệp (tận dụng phế thải 3 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ từ nông, lâm nghiệp có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường) đồng thời tạo nên nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và có giá trị dược liệu, giá trị kinh tế cao.

Những đóng góp mới của Luận án: Công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm không thực sự là công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt Nam hiện nay thì đây thực sự là hướng mới cần được ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm từng bước thay đổi phương thức sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm, mang lại hiệu quả kinh tế cao theo hướng sản xuất qui mô công nghiệp, dần dần đưa máy móc vào sản xuất nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích người lao động cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương phẩm một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm.