Tổng quan nghiên cứu

Các hợp chất dị vòng chứa khung piperazinedione là lớp cấu trúc tự nhiên phong phú, sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý giá như kháng khuẩn, kháng nấm và đặc biệt là khả năng ức chế mạnh mẽ các dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 đạt mức từ 1,4 đến 2,6 nM trong các thử nghiệm tiền lâm sàng. Tuy nhiên, việc tổng hợp và xác định cấu trúc của các sản phẩm ngưng tụ giữa piperazinedione với các hợp chất andehyde gặp rất nhiều trở ngại do phân tử sở hữu nhiều nhân thơm phức tạp, các liên kết đôi liên hợp và nhiều trung tâm lập thể tiềm năng.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Hóa phân tích thực hiện năm 2019 tại Trường Đại học Khoa học thuộc Đại học Thái Nguyên, dưới sự tài trợ kinh phí thực nghiệm từ đề tài Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia mã số 104, đã tập trung giải quyết bài toán phân tích cấu trúc phức tạp này. Mục tiêu nghiên cứu cụ thể là tổng hợp và phân tích, quy gán chính xác toàn bộ cấu trúc của hợp chất trung gian andehit 19 và sản phẩm ngưng tụ piperazinedione 21 bằng cách phối hợp đồng bộ các phương pháp phổ hiện đại gồm hồng ngoại biến đổi Fourier, cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều trên hệ thiết bị từ trường cao 500 MHz.

Nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi cung cấp quy trình phân tích cấu trúc chuẩn xác với độ tin cậy 100%, ghi nhận hiệu suất tổng hợp andehit 19 đạt 80% và sản phẩm ngưng tụ 21 đạt 40%. Kết quả này tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các synthon hóa dược mới có hoạt tính ức chế trùng hợp tubulin để ứng dụng trong điều trị ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng lý thuyết quang phổ phân tử hiện đại kết hợp với hóa học lập thể của các hợp chất dị vòng. Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier vận hành dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ trong dải số sóng từ 4000 đến 400 cm⁻¹, kích thích các dao động hóa trị và dao động biến dạng làm thay đổi momen lưỡng cực của phân tử, qua đó nhận diện chính xác các nhóm chức đặc trưng như carbonyl ở vùng 1700 đến 1750 cm⁻¹ hay liên kết carbon-halogen.

Lý thuyết phổ cộng hưởng từ hạt nhân FT-NMR là công cụ trung tâm để xác định chi tiết khung carbon-hydro. Khi đặt hạt nhân có spin khác 0 vào từ trường ngoài, các hạt nhân chịu hiệu ứng chắn từ khác nhau sẽ cho độ dịch chuyển hóa học delta đặc trưng trong thang đo từ 0 đến 12 ppm đối với proton và từ 0 đến 230 ppm đối với cacbon. Tương tác spin-spin với hằng số tương tác J tính bằng đơn vị Hz giúp làm rõ vị trí tương đối giữa các nguyên tử hydro kề nhau. Hệ phổ hai chiều gồm phổ tương quan dị hạch trực tiếp một liên kết HSQC và phổ tương quan dị hạch tầm xa qua 2 đến 3 liên kết HMBC đóng vai trò quyết định trong việc giải mã các nguyên tử cacbon bậc bốn và liên kết liên hợp phức tạp.

Phương pháp nghiên cứu

Dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ quy trình tổng hợp hữu cơ và đo phổ tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2019. Về cỡ mẫu phân tích, nghiên cứu chuẩn bị 2 mg mẫu sạch nghiền mịn cùng 100 mg KBr tinh khiết để ép viên đo phổ hồng ngoại trên máy FT-IR Spectrum Two PerkinElmer L160; sử dụng từ 25 mg đến 35 mg mẫu hòa tan hoàn toàn trong 0,8 ml dung môi deuterated gồm CDCl3 hoặc DMSO có chứa chất chuẩn nội tetramethylsilane để đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Tổng cộng có 2 mẫu đại diện tinh khiết mang mã hiệu BG06 và PT25V2 được phân tích toàn diện.

Phương pháp chọn mẫu dựa trên kỹ thuật sắc ký cột silica gel kích thước hạt 100 đến 200 mesh với hệ dung môi n-hexane và ethyl acetate theo tỷ lệ thể tích 9/1 đối với chất 19 và 7/3 đối với chất 21, kết hợp kiểm tra độ tinh khiết đơn vết trên bản mỏng tráng sẵn silica gel F254. Phương pháp đo phổ NMR trên máy Bruker Avance II 500 MHz với thời gian ghi phổ HSQC là 3 giờ và phổ HMBC là 4 giờ được lựa chọn vì độ phân giải từ trường cao giúp phân tách triệt để các tín hiệu cộng hưởng bị chồng lấn trong vùng nhân thơm, đảm bảo độ chính xác tuyệt đối cho việc xác định cấu trúc.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã tổng hợp và xác định thành công cấu trúc phân tử của 2 hợp chất hữu cơ mới với độ tinh khiết cao:

Thứ nhất, hợp chất andehit 19 mang mã hiệu BG06 được tạo thành qua phản ứng oxi hóa chất 16 bằng SeO2 với khối lượng thu được 428 mg, đạt hiệu suất phản ứng 80% từ 500 mg chất đầu tương đương 2,6 mmol. Phổ hồng ngoại ghi nhận pic carbonyl andehit đặc trưng tại số sóng 1710 cm⁻¹, liên kết C-H no tại 2964 cm⁻¹ và liên kết C-Cl tại 759 cm⁻¹. Phổ 1H-NMR xác nhận tín hiệu proton andehit tại 10,16 ppm dạng mũi đơn 1H và nhóm methyl tại 2,88 ppm dạng mũi đơn 3H. Phổ 13C-NMR thể hiện đầy đủ 11 nguyên tử cacbon với pic carbonyl tại 193,0 ppm, methyl tại 18,1 ppm và 9 cacbon thơm từ 117,2 đến 151,2 ppm, khẳng định cấu trúc 4-chloro-8-methylquinoline-2-carbaldehyde.

Thứ hai, hợp chất ngưng tụ 21 mang mã hiệu PT25V2 được tổng hợp qua phản ứng đa cấu tử với khối lượng 91 mg ở dạng chất rắn màu vàng, đạt hiệu suất 40% từ 100 mg chất 15 tương đương 0,5 mmol. Phổ 1H-NMR chứng minh sự hình thành 2 liên kết đôi mới qua 2 tín hiệu proton olefin tại 7,27 ppm và 7,36 ppm, cặp tín hiệu methylene tách đôi tại 4,88 ppm với J bằng 2,5 Hz và 4,38 ppm với J bằng 2,0 Hz, cùng nhóm methoxy tại 3,97 ppm. Phổ 13C-NMR ghi nhận 2 pic carbonyl tại 170,3 ppm và 161,3 ppm cùng 2 cacbon liên kết đôi tại 146,6 ppm và 141,6 ppm.

Thứ ba, sự kết hợp giữa phổ HSQC và HMBC đã quy gán chính xác 100% vị trí các nguyên tử, làm rõ tương tác tầm xa của proton H-1 với các cacbon C-3, C-5, C-7 và proton H-8 với C-6, C-7, khẳng định cấu trúc lập thể hoàn chỉnh của hợp chất 21 là (Z)-6-((4-chloro-8-methylquinolin-2-yl)methylene)-3-((Z)-4-methoxybenzylidene)-1-(prop-2-yn-1-yl)piperazine-2,5-dione.

Thứ tư, so sánh hiệu suất cho thấy phản ứng oxi hóa tạo andehit 19 đạt 80%, cao gấp 2 lần tương đương mức chênh lệch 100% so với phản ứng ngưng tụ tạo chất 21 đạt 40%, phản ánh rõ rào cản lập thể khi gắn kết các vòng dị vòng cồng kềnh.

Thảo luận kết quả

Sự hình thành cấu hình đồng phân hình học Z ở cả 2 liên kết đôi ngoại vòng của hợp chất 21 được giải thích bởi hiệu ứng cộng hưởng liên hợp mở rộng và tương tác giảm thiểu lực đẩy không gian giữa khung quinoline, nhân thơm 4-methoxyphenyl và dị vòng diketopiperazine. Khi đối chiếu với các công bố khoa học quốc tế về dẫn xuất plinabulin có hoạt tính kháng u ở nồng độ từ 1,4 đến 4,0 nM, cấu trúc của hợp chất 21 thể hiện sự tương đồng cao về bộ khung dược lực học, đồng thời việc bổ sung nhóm propargyl mở ra khả năng biến đổi hóa học qua phản ứng click chemistry.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan thông qua bảng tương quan dịch chuyển hóa học và sơ đồ tương tác HMBC hai chiều, đi kèm các biểu đồ phổ giãn chi tiết trong các vùng dịch chuyển từ 2,0 đến 5,0 ppm và vùng thơm từ 110 đến 170 ppm. Cách trình bày này giúp chứng minh rõ ràng việc không xuất hiện bất kỳ pic tạp chất nào, xác nhận độ tinh khiết của hợp chất đạt trên 98%.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát triển sâu rộng các kết quả đạt được từ luận văn, bốn giải pháp cụ thể được đề xuất triển khai:

Thứ nhất, tối ưu hóa điều kiện phản ứng tổng hợp hữu cơ. Nhóm nghiên cứu hóa dược cần tiến hành khảo sát các hệ xúc tác base hữu cơ mới và dung môi phân cực nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp hợp chất 21 từ mức 40% hiện tại lên trên 65%, thực hiện trong lộ trình 6 tháng tới.

Thứ hai, triển khai sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro. Các viện nghiên cứu y dược học cần phối hợp với phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ để tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư người và đánh giá khả năng ức chế trùng hợp tubulin của hợp chất 21, hướng tới mục tiêu đạt giá trị IC50 dưới 10 nM trong thời gian 12 tháng.

Thứ ba, thiết lập ngân hàng dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chuẩn. Trung tâm Phân tích cấu trúc cần chuẩn hóa dữ liệu phổ 1D và 2D NMR cho hệ thống hơn 20 dẫn xuất piperazinedione tương tự trong thời gian 9 tháng, phục vụ làm chất chuẩn đối chiếu cho các công trình nghiên cứu phát triển thuốc.

Thứ tư, ứng dụng kỹ thuật nhiễu xạ tia X đơn tinh thể và phổ khối lượng phân giải cao HR-MS. Cơ quan chủ quản cần hỗ trợ phân tích tinh thể học để xác định trực tiếp cấu trúc không gian 3 chiều và đo khối phổ chính xác đến 4 chữ số thập phân cho các sản phẩm ngưng tụ mới trong vòng 1 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo học thuật giá trị cho bốn nhóm đối tượng chính:

Thứ nhất, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa hữu cơ. Tài liệu cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về cách giải mã, quy gán các tín hiệu phổ 1D và 2D NMR phức tạp trên các khung phân tử dị vòng chứa nhiều nhân thơm và nguyên tử dị vòng.

Thứ hai, các nhà khoa học và chuyên gia nghiên cứu phát triển thuốc mới. Luận văn cung cấp quy trình tổng hợp chi tiết các synthon piperazinedione có cấu trúc tương đồng với plinabulin, phục vụ trực tiếp cho việc thiết kế các hoạt chất chống ung thư tiềm năng.

Thứ ba, giảng viên và kỹ thuật viên phân tích cấu trúc tại các trường đại học và viện nghiên cứu. Công trình là giáo trình tình huống thực tế để giảng dạy các học phần phổ nghiệm hiện đại và hướng dẫn kỹ thuật đo đạc trên máy Bruker Avance 500 MHz.

Thứ tư, cán bộ nghiên cứu và phát triển tại các doanh nghiệp hóa dược. Tài liệu hỗ trợ xây dựng quy trình kiểm tra độ tinh khiết và kiểm soát chất lượng các hợp chất trung gian bằng sắc ký bản mỏng và quang phổ hồng ngoại.

Câu hỏi thường gặp

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D có vai trò quyết định như thế nào trong luận văn? Phổ HSQC và HMBC giúp giải quyết triệt để sự chồng lấn tín hiệu proton và cacbon trong vùng nhân thơm. Nhờ phân tích tương tác tầm xa 2 và 3 liên kết trên máy Bruker 500 MHz với thời gian đo từ 3 đến 4 giờ, tác giả đã quy gán chính xác 100% vị trí từng nguyên tử của hợp chất 21.

Vì sao phản ứng oxi hóa hợp chất 16 bằng SeO2 lại đạt hiệu suất cao 80%? Phản ứng oxi hóa nhóm methyl ở vị trí số 2 của khung quinoline bằng SeO2 diễn ra thuận lợi nhờ sự hoạt hóa của nguyên tử nitơ dị vòng lân cận, giúp chuyển hóa 500 mg chất đầu thành 428 mg andehit 19 tinh khiết sau 24 giờ hồi lưu trong dung môi THF.

Dấu hiệu phổ hồng ngoại nào chứng minh sự hình thành của andehit 19? Phổ hồng ngoại ghi nhận vân hấp thụ rất mạnh của liên kết carbonyl andehit tại 1710 cm⁻¹, cùng với các dao động hóa trị C-H no tại 2964 cm⁻¹ và liên kết C-Cl tại 759 cm⁻¹, khẳng định nhóm chức andehit đã được tạo thành thành công.

Làm thế nào để xác định cấu hình đồng phân hình học Z của sản phẩm 21? Cấu hình Z của hai liên kết đôi ngoại vòng được xác định dựa trên độ dịch chuyển hóa học của proton olefin tại 7,27 ppm và 7,36 ppm, kết hợp với các tương tác không gian trên phổ HMBC phù hợp với trạng thái bền vững về mặt năng lượng.

Khung phân tử piperazinedione có tiềm năng ứng dụng thực tế ra sao trong y học? Các dẫn xuất piperazinedione tự nhiên và tổng hợp thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự phân chia tế bào ung thư với IC50 ở mức nanomol từ 1,4 đến 4,0 nM, đóng vai trò là khung cấu trúc then chốt để phát triển các loại thuốc ức chế tubulin thế hệ mới.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra thông qua các đóng góp nổi bật:

  • Tổng hợp thành công hợp chất andehit trung gian 4-chloro-8-methylquinoline-2-carbaldehyde với hiệu suất 80% và sản phẩm ngưng tụ piperazinedione mới mang ký hiệu PT25V2 với hiệu suất 40%.
  • Xác lập phương pháp quy chuẩn phối hợp quang phổ FTIR, 1D-NMR và 2D-NMR trên thiết bị 500 MHz để giải mã cấu trúc phân tử phức tạp chứa nhiều vòng thơm và dị vòng.
  • Quy gán đầy đủ, chính xác toàn bộ vị trí các nguyên tử hydro, cacbon và xác định cấu hình lập thể Z của các liên kết đôi mới hình thành.
  • Đặt nền móng dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về hóa dược và hoạt tính sinh học trong khung thời gian từ 6 đến 12 tháng tới.
  • Mở rộng tiềm năng ứng dụng của khung dị vòng diketopiperazine trong việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư.

Độc giả và các nhà nghiên cứu quan tâm có thể khai thác toàn bộ dữ liệu phổ chi tiết trong luận văn để ứng dụng vào công tác nghiên cứu tổng hợp và phân tích hóa dược.