Tổng quan luận án

Vấn đề kiểm soát an toàn thực phẩm đối với các chất màu tổng hợp công nghiệp độc hại là yêu cầu cấp thiết trong bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã xếp Auramine O vào nhóm 2B (các tác nhân có thể gây ung thư cho người) và các sản phẩm thương mại của nó vào nhóm 1 (chắc chắn gây ung thư cho người); các hợp chất Sudan (như Sudan I, Sudan II) có khả năng phân hủy tạo thành các amin thơm gây tổn thương DNA, đột biến gen và hình thành khối u ác tính. Tại Việt Nam, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 4-10:2010/BYT và Thông tư 24/2019/TT-BYT ban hành danh mục 57 chất màu được phép sử dụng trong thực phẩm, trong đó không bao gồm Auramine O và các hợp chất Sudan; Thông tư 21/2019/TT-BNNPTNT và Thông tư 42/2015/TT-BNNPTNT nghiêm cấm sử dụng Auramine O và các dẫn xuất trong thức ăn chăn nuôi với giới hạn phát hiện yêu cầu là 1 mg/kg. Tuy nhiên, do đặc tính bắt màu chuẩn, bền màu và giá thành rẻ, các chất này vẫn bị lạm dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định xuất phát từ thực trạng: Việt Nam mới chỉ ban hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 xác định Auramine O bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS), chưa có tiêu chuẩn quốc gia chứng nhận để định lượng các hợp chất Sudan trong thực phẩm. Tiêu chuẩn TCVN 12267:2018 áp dụng một quy trình chiết đơn nhất cho mọi nền mẫu thực phẩm, dẫn đến hiệu suất thu hồi không đồng đều trên các nền mẫu phức tạp; đồng thời hệ thống LC-MS/MS có chi phí đầu tư và vận hành cao, khó triển khai tại các phòng kiểm nghiệm quy mô vừa và nhỏ. Mặt khác, các nghiên cứu ứng dụng vật liệu nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) trên thế giới chủ yếu tập trung xử lý chất màu ưa nước (Rhodamine B, Methylene Blue) trong môi trường nước, chưa từng có công trình nghiên cứu sử dụng RHNS để xử lý làm sạch dịch chiết chứa Auramine O và các hợp chất Sudan kỵ nước từ nền mẫu thực phẩm. Do đó, luận án tập trung phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp kỹ thuật xử lý mẫu bằng vật liệu nanosilica chế tạo từ nguồn phụ phẩm vỏ trấu.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 nội dung:

  1. Xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong các mẫu thực phẩm: măng, miến, dưa chua, phấn hoa, cá khô, mì tôm.
  2. Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong các mẫu thực phẩm: thịt khô và bim bim.

Nội dung nghiên cứu chính bao gồm:

  • Đối với Auramine O: Khảo sát các điều kiện tối ưu phân tích bằng phương pháp HPLC; khảo sát điều kiện tối ưu chiết từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm; nghiên cứu điều kiện hấp phụ của Auramine O trong dung dịch lên nanosilica từ vỏ trấu (RHNS); áp dụng quy trình xác định Auramine O trong mẫu thực tế.
  • Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II: Khảo sát các điều kiện tối ưu phân tích đồng thời bằng HPLC; khảo sát điều kiện tối ưu chiết từ mẫu thực nghiệm; nghiên cứu điều kiện hấp phụ của hỗn hợp lên RHNS; áp dụng quy trình xác định Sudan I và Sudan II trong mẫu thực tế.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng phân tích: Chất màu Auramine O (AO), Sudan I và Sudan II.
  • Đối tượng nền mẫu: Măng, miến, dưa chua, phấn hoa, cá khô, mì tôm (cho Auramine O); thịt khô và bim bim (cho Sudan I và Sudan II).
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực hiện tại Bộ môn Hóa học phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội; thu thập và phân tích các mẫu thực phẩm lưu thông trên thị trường Việt Nam; luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các phương pháp định lượng Auramine O và các hợp chất Sudan trên nhiều đối tượng nền mẫu khác nhau.

Nghiên cứu định lượng Auramine O

Tác giả / Năm Phương pháp / Dung môi chiết Thành phần pha động LOD LOQ Kỹ thuật định lượng
TCVN 12267:2018 ACN tinh khiết Kênh A: Đệm $\text{CH}_3\text{COONH}_4$ 0,005 M (pH=3); Kênh B: $\text{CH}_3\text{OH}$ tinh khiết (Gradient) 3,0 µg/kg 5,0 µg/kg LC-MS/MS
Phan Thị Ngọc Trinh và cs. (2019) $\text{ACN} : \text{NH}_3\text{ 0,5% (7:3 v/v)}$ $\text{MeOH} : \text{H}_3\text{PO}_4\text{ 0,03%}$ (Gradient) 0,02 mg/L 0,05 mg/L HPLC
Nguyễn Thị Kim Thương và cs. (2019) $\text{ACN} : \text{H}_2\text{O (50:50 v/v)}$ Dung dịch đệm photphat $2,46 \times 10^{-8}\text{ M}$ $8,21 \times 10^{-8}\text{ M}$ ASV (Von-ampe hòa tan)
Trần Lâm Thiên Thanh và cs. (2020) $\text{CH}_3\text{COONH}_4\text{ 50 mM} : \text{CH}_3\text{OH} : \text{HCOOH (79:20:1)}$ Đệm $\text{HCOONH}_4$ 100 mM (pH 2,9) : ACN (Gradient) 0,1 µg/kg 0,1 µg/kg UPLC-MS/MS
Đặng Thị Ngọc Hoa và cs. (2020) Không chiết, đo trực tiếp nước dưa chua Dung dịch điện ly 0,65 µM — SV (Von-ampe)
Zhao Chun-yu và cs. (2007) $\text{H}_2\text{O}$ $\text{ACN} : \text{PBS (pH=3, 0,2% triethylamin) (35:65 v/v)}$ — — HPLC
Li J. và cs. (2013) Chiết pha rắn (SPE) $\text{MeOH} : \text{CH}_3\text{COONH}_4\text{ 20 mM (60:40 v/v)}$ 17,85 µg/kg — HPLC
Yong Lin Qin và cs. (2009) $\text{NH}_3:\text{MeOH}$; $\text{CH}_2\text{Cl}_2$; $\text{HCOOH}:\text{MeOH}$ $\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 0,05%} : \text{MeOH}$ (Gradient) 0,03 mg/kg — HPLC
Tatebe C. và cs. (2014) $\text{HCl} : \text{EtOH} : \text{CH}_3\text{COOC}_2\text{H}_5$ Đệm $\text{CH}_3\text{COOH}/\text{CH}_3\text{COONH}_4\text{ (pH=4,5)} : \text{ACN}$ 0,05 µg/g 0,125 µg/g HPLC-PDA
Kyung-Yuk Ko và cs. (2021) $\text{CH}_3\text{COONH}_4\text{ 50 mM trong MeOH 70%}$ $\text{ACN} : \text{CH}_3\text{COONH}_4\text{ 50 mM}$ 1,4 µg/mL 4,0 µg/mL HPLC-PDA

Đánh giá tổng quan cho thấy phương pháp UPLC-MS/MS của Trần Lâm Thiên Thanh và cộng sự (2020) phát hiện 57/211 mẫu thực phẩm chứa AO với hàm lượng từ 3,2 µg/kg đến 13,02 µg/kg. Việc Zhao Chun-yu sử dụng nước để chiết AO là chưa phù hợp do độ tan của AO trong nước thấp hơn nhiều so với dung môi hữu cơ.

Nghiên cứu định lượng các hợp chất Sudan

Tác giả / Năm Phương pháp / Dung môi chiết Thành phần pha động LOD LOQ Kỹ thuật định lượng
Bùi Thị Ngoan và cs. (2009) $\text{MeOH 100%}$ $\text{ACN} : \text{HCOOH 1% (90:10 v/v)}$ Sudan I: 2 µg/L Sudan I: 6 µg/L HPLC-UV/VIS
Nguyễn Văn Yên và cs. (2010) $\text{Aceton}$ $\text{MeOH} : \text{H}_2\text{O (95:5 v/v)}$ — — HPLC-UV/VIS
Vũ Lan Phương và cs. (2020) $\text{ACN} : \text{H}_2\text{O (80:20 v/v)}$ $\text{ACN} : \text{HCOOH 0,1%}$ (Gradient) Sudan (I-IV): 50 µg/kg Sudan (I-IV): 150 µg/kg LC-MS/MS
Mazzetti M. và cs. (2004) Soxtec ($\text{Dầu khí ete} - \text{etanol 90:10}$) $\text{Dichloromethane}$ Sudan I: 7 µg/kg Sudan I: 13 µg/kg HPLC-UV/VIS
Ping Qi và cs. (2011) $\text{ACN}$ / Chiết SPE $\text{ACN} : \text{CH}_3\text{COOH 1% (85:15 v/v)}$ Sudan I: 8,18 µg/L
Sudan II: 6,14 µg/L		 Sudan I: 26,6 µg/L
Sudan II: 19,4 µg/L		 HPLC-DAD
Umran Seven Erdemir (2013) $\text{Aceton}$ — Sudan I: 7,7 µg/kg
Sudan II: 2,7 µg/kg		 Sudan I: 25,7 µg/kg
Sudan II: 8,9 µg/kg		 GC-MS
Phitchan Sricharoen và cs. (2017) $\text{ACN 100%}$ $\text{MeOH tinh khiết}$ Sudan (I-IV): 0,16–0,24 µg/L Sudan (I-IV): 0,53–0,80 µg/L HPLC
Abdullah Al Tamim và cs. (2019) $\text{ACN 100%}$ $\text{HCOONH}_4\text{ 10 mM, HCOOH 0,1%} : \text{ACN}$ Sudan I: 2,9 µg/kg
Sudan II: 2,8 µg/kg		 Sudan I: 9,5 µg/kg
Sudan II: 10,4 µg/kg		 LC-MS/MS
Qingxiang Zhou và cs. (2019) Chiết pha rắn SPE $\text{ACN 100%}$ 0,002–0,005 µg/L — HPLC

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Phương pháp HPLC là kỹ thuật phù hợp và phổ biến nhất để phân tích đồng thời các chất màu tổng hợp, tuy nhiên đòi hỏi quy trình xử lý nền mẫu triệt để. Luận án khắc phục nhược điểm của các phương pháp chiết dùng dung môi độc hại bằng việc phát triển quy trình chuẩn bị mẫu xanh sử dụng dung môi ethanol kết hợp vật liệu hấp phụ nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (RHNS) để tinh chế và làm giàu mẫu trước khi phân tích trên RP-HPLC.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Cấu trúc và tính chất chất màu:
    • Auramine O (C.I. Basic Yellow 2; danh pháp IUPAC: bis[4-(dimethylamino)phenyl]methaniminium chloride; công thức phân tử $\text{C}{17}\text{H}{21}\text{N}_3\cdot\text{HCl}$, $M = 303,83\text{ g/mol}$) thuộc nhóm chất màu diarylmethane, phân tử tích điện dương trong môi trường nước, tan tốt trong nước và ethanol.
    • Sudan I ($\text{C}{16}\text{H}{12}\text{N}2\text{O}$, $M = 248,28\text{ g/mol}$) và Sudan II ($\text{C}{18}\text{H}_{16}\text{N}_2\text{O}$, $M = 276,33\text{ g/mol}$) thuộc nhóm monoazo, có tính kỵ nước cao, không tan hoặc tan rất ít trong nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ và lipid.
  • Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu và nền mẫu thực phẩm: Bao gồm liên kết ion (giữa gốc mang điện âm/dương của chất màu và tâm điện tích của cơ chất), liên kết hydro (giữa nhóm –OH, –NH, –COOH của chất màu và thành phần xenlulo, tinh bột, protein trong thực phẩm), liên kết Van der Waals và tương tác kỵ nước.
  • Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Đánh giá qua hệ số đối xứng của peak sắc ký $AF = (a+b)/2a$ (đo tại 1/10 chiều cao peak). Khảo sát và khắc phục các hiện tượng biến dạng peak (chẻ peak do hiệu ứng dung môi hoặc nhiễm bẩn đầu cột, kéo đuôi peak do liên kết thứ cấp với nhóm silanol tự do, nở rộng peak).
  • Thống kê trong phân tích định lượng:
    • Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính $Y = aX + b$ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
    • Kiểm tra ý nghĩa của hệ số tự do $b$ so với 0 thông qua chuẩn Fisher ($F_{\text{thực nghiệm}} < F_{\text{lý thuyết}}$).
    • Kiểm tra tính đồng nhất của phương sai tại các điểm nồng độ thấp ($C_{\min}$) và cao ($C_{\max}$) bằng chuẩn $F$.
    • Xác định giới hạn phát hiện ($LOD = 3s_a/a$) và giới hạn định lượng ($LOQ = 10s_a/a$); tương ứng xác định $MDL$ và $MQL$ trên nền mẫu trắng.
    • Đánh giá độ đúng qua độ thu hồi $R% = \frac{C_T - C_K}{C} \times 100%$ và tính toán độ không đảm bảo đo tổng hợp.
  • Cơ chế hấp phụ trên nanosilica từ vỏ trấu (RHNS): Đánh giá diện tích bề mặt, cấu trúc mao quản, sự biến thiên thế Zeta theo pH; khảo sát mô hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và giải hấp bằng dung môi pha động.

Phương pháp nghiên cứu

  • Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis: Xác định bước sóng hấp thụ cực đại ($\lambda_{\max}$) của Auramine O, Sudan I và Sudan II.
  • Phương pháp phân tích đặc trưng vật liệu: Sử dụng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX), kính hiển vi điện tử quét (SEM), phương pháp đo diện tích bề mặt và kích thước mao quản Brunauer–Emmett–Teller (BET).
  • Phương pháp chiết lỏng – rắn / lỏng – lỏng có hỗ trợ siêu âm: Khảo sát hệ dung môi chiết, tỷ lệ thể tích, thời gian và nhiệt độ chiết.
  • Phương pháp làm giàu và làm sạch mẫu bằng vật liệu hấp phụ nanosilica (RHNS).
  • Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) sử dụng detector mảng Diode (PDA).

Nguồn tư liệu và dữ liệu

  • Hóa chất chuẩn: Chuẩn Auramine O, Sudan I, Sudan II có độ tinh khiết phân tích; các dung môi pha động HPLC grade (Acetonitril, Methanol), axit formic, đệm photphat, muối KCl, ethanol.
  • Mẫu thực nghiệm: Vật liệu nanosilica điều chế từ tro vỏ trấu nông nghiệp (RHNS).
  • Mẫu thực phẩm khảo sát thực tế: Thu thập trên thị trường gồm măng tươi, măng ngâm chua, miến dong, dưa cải muối chua, phấn hoa tự nhiên, cá khô, mì tôm ăn liền, thịt lợn/bò khô, bim bim snack.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này trình bày cơ sở lý luận về các chất màu tổng hợp, phân loại theo các nhóm mang màu chính (nhóm azo, antraquinon, indigo, nitro/nitroso, hoàn nguyên đa vòng, arylmethane, azomethine). Tác giả phân tích cơ chế tương tác liên kết của chất màu với cơ chất thực phẩm và vật liệu hấp phụ (liên kết ion, liên kết hydro, liên kết hóa trị, lực Van der Waals và tương tác kỵ nước).

Chương 1 tổng thuật chi tiết cấu tạo hóa học, tính chất vật lý, cơ chế gây độc và chuyển hóa sinh học của Auramine O (gây ung thư biểu mô gan, bàng quang) và các hợp chất Sudan I-IV (tạo dẫn xuất amin thơm gây tổn thương nhiễm sắc thể). Toàn bộ các công trình nghiên cứu định lượng AO và Sudan trong nước và quốc tế được tổng hợp, so sánh về giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, nền mẫu và kỹ thuật phân tích. Chương này cũng phân tích lý thuyết sắc ký RP-HPLC, các yếu tố gây sai lệch peak sắc ký, phương pháp xử lý dữ liệu thống kê kiểm định giả thuyết ($t$-Student, $F$-Fisher), các kỹ thuật xử lý mẫu thực phẩm truyền thống và định hướng chuẩn bị mẫu xanh sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS).

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục hóa chất, trang thiết bị phân tích (hệ thống HPLC detector PDA, phổ kế UV-Vis, máy đo pH, bể rửa siêu âm, máy ly tâm) và quy trình điều chế, đặc trưng vật liệu RHNS. Tác giả xây dựng phương pháp tạo mẫu giả (mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu trắng không chứa chất phân tích) để khảo sát thực nghiệm.

Nội dung thực nghiệm triển khai qua các bước:

  1. Tối ưu hóa điều kiện đo sắc ký HPLC: Khảo sát lựa chọn thành phần pha động, tỷ lệ dung môi hữu cơ/pha nước, pH dung dịch đệm photphat, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu và bước sóng định lượng.
  2. Tối ưu hóa điều kiện chiết tách: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp hỗ trợ (khuấy từ, lắc cơ học, siêu âm), loại dung môi chiết (nước, methanol, ethanol, acetonitril và các hỗn hợp), tỷ lệ mẫu/dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết và số lần chiết lặp lại.
  3. Nghiên cứu đặc trưng và điều kiện hấp phụ trên RHNS: Đo thế Zeta theo pH, khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường hấp phụ, lực ion (nồng độ KCl), thời gian cân bằng hấp phụ, nồng độ đầu của chất màu; thiết lập phương trình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir; khảo sát dung môi, thời gian và số lần rửa giải chất màu ra khỏi vật liệu bằng chính dung môi pha động.
  4. Xây dựng quy trình xử lý mẫu thực phẩm: Thiết lập 2 sơ đồ xử lý mẫu độc lập:
    • Sơ đồ 1 (cho măng, miến, dưa chua, thịt khô): Chiết bằng dung môi hữu cơ $\rightarrow$ ly tâm $\rightarrow$ lọc màng 0,45 µm $\rightarrow$ phân tích HPLC.
    • Sơ đồ 2 (cho phấn hoa, cá khô, mì tôm, bim bim): Chiết bằng dung môi $\rightarrow$ hấp phụ bằng nanosilica RHNS $\rightarrow$ ly tâm loại dịch $\rightarrow$ rửa giải bằng pha động HPLC $\rightarrow$ phân tích HPLC.
Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích:
- Nền mẫu đơn giản (Măng, miến, dưa chua, thịt khô):
  Mẫu nghiền nhỏ -> Chiết dung môi EtOH/H2O -> Rung siêu âm -> Ly tâm -> Lọc 0,45 µm -> Tiêm RP-HPLC

- Nền mẫu phức tạp (Phấn hoa, cá khô, mì tôm, bim bim):
  Mẫu nghiền nhỏ -> Chiết dung môi EtOH/H2O -> Rung siêu âm -> Ly tâm thu dịch chiết -> Tiếp xúc nanosilica RHNS -> Hấp phụ làm sạch/làm giàu -> Tách bỏ dịch nền -> Rửa giải trực tiếp bằng pha động HPLC -> Tiêm RP-HPLC

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 được chia thành 2 phần độc lập: Phần 3-A dành cho Auramine O và Phần 3-B dành cho hỗn hợp Sudan I và Sudan II.

3-A – Đối với Auramine O

  • Điều kiện phân tích HPLC tối ưu: Bước sóng hấp thụ cực đại $\lambda_{\max} = 432\text{ nm}$. Pha động tối ưu là hỗn hợp Acetonitril (ACN) : Dung dịch đệm photphat (PBS) pH = 3,0 với tỷ lệ thể tích 35:65 (v/v); tốc độ dòng pha động 1,0 mL/phút; thời gian lưu của peak AO ổn định, peak sắc ký nhọn đối xứng ($AF \approx 1,0$).
  • Đường chuẩn và thông số phương pháp: Đường chuẩn xây dựng trong khoảng nồng độ tuyến tính từ 10 µg/L đến 1000 µg/L với hệ số tương quan $R > 0,999$. Kiểm định thống kê xác nhận hệ số tự do $b$ không có sự sai khác có ý nghĩa so với 0; phương sai giữa $C_{\min}$ và $C_{\max}$ đồng nhất qua chuẩn $F$. Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp trên nền mẫu trắng đạt mức vết. Độ lặp lại phép đo có $RSD < 2%$.
  • Tối ưu hóa điều kiện chiết: Dung môi chiết tối ưu cho AO là hỗn hợp Ethanol : Nước tỷ lệ 70:30 (v/v), có hỗ trợ rung siêu âm trong 15 phút ở nhiệt độ phòng ($25^\circ\text{C}$); số lần chiết tối ưu là 2 lần với tỷ lệ khối lượng mẫu/dung môi là 1:10 (g/mL). Hiệu suất chiết thu hồi AO trên các nền mẫu giả đạt trên 90%.
  • Tối ưu hóa điều kiện hấp phụ trên RHNS: Bề mặt RHNS tích điện âm khi $\text{pH} > 2,5$. Hiệu suất hấp phụ AO đạt tối đa ở khoảng $\text{pH} = 6,0 - 8,0$; lực ion KCl ảnh hưởng không đáng kể ở nồng độ thấp; thời gian đạt cân bằng hấp phụ là 30 phút. Quá trình hấp phụ tuân theo mô hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir. Điều kiện rửa giải tối ưu: sử dụng chính pha động HPLC (ACN : PBS pH 3 tỷ lệ 35:65), rung siêu âm 10 phút, thực hiện 2 lần rửa giải cho độ thu hồi giải hấp đạt trên 92%.
  • Kết quả phân tích mẫu thực tế: Đã phân tích hàm lượng AO trên các mẫu măng ngâm, măng khô, miến, dưa chua (xử lý theo Sơ đồ 1) và mẫu phấn hoa, cá khô, mì tôm (xử lý làm sạch qua RHNS theo Sơ đồ 2). Phương pháp đường thêm chuẩn được sử dụng để kiểm soát hiệu ứng nền mẫu, tính toán đầy đủ độ không đảm bảo đo của phương pháp.

3-B – Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II

  • Điều kiện phân tích HPLC tối ưu: Bước sóng hấp thụ cực đại $\lambda_{\max} = 478\text{ nm}$ (Sudan I) và $490\text{ nm}$ (Sudan II). Pha động tối ưu là Acetonitril (ACN) : Dung dịch axit formic (HCOOH) 0,1% với tỷ lệ 85:15 (v/v); tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Hai chất được tách sắc ký hoàn toàn với thời gian phân tích dưới 10 phút, hệ số đối xứng peak đạt yêu cầu.
  • Đường chuẩn và thông số phương pháp: Khoảng tuyến tính nồng độ của Sudan I và Sudan II đáp ứng tốt từ mức nồng độ thấp với hệ số tương quan $R > 0,999$. Xác định giá trị LOD, LOQ của hệ chất chuẩn và MDL, MQL của phương pháp trên nền mẫu trắng thịt khô và bim bim.
  • Tối ưu hóa điều kiện chiết: Dung môi chiết tối ưu là Ethanol tuyệt đối (EtOH 100%), hỗ trợ rung siêu âm 20 phút ở $30^\circ\text{C}$, chiết 2 lần với tỷ lệ mẫu/dung môi 1:15 (g/mL). Hiệu suất chiết thu hồi hỗn hợp Sudan đạt trên 90%.
  • Tối ưu hóa điều kiện hấp phụ trên RHNS: Luận án nghiên cứu cơ chế hấp phụ của các phân tử Sudan kỵ nước lên RHNS tại vùng điểm đẳng điện của vật liệu ($\text{pH} \approx 2,0 - 3,0$). Thời gian đạt cân bằng hấp phụ là 30 phút; mô hình hấp phụ phù hợp với phương trình Langmuir. Rửa giải hoàn toàn Sudan bằng chính pha động HPLC (ACN : HCOOH 0,1% 85:15) qua 2 lần rửa giải.
  • Kết quả phân tích mẫu thực tế: Định lượng thành công hàm lượng Sudan I và Sudan II trong các mẫu thịt sấy khô và snack bim bim trên thị trường; kiểm tra độ thu hồi thêm chuẩn đạt từ 85% đến 98%; thiết lập bảng tổng hợp dữ kiện độ không đảm bảo đo cho toàn bộ quy trình phân tích.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  • Luận án đã làm sáng tỏ cơ chế tương tác và hấp phụ của các chất màu hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau (Auramine O mang điện tích dương/ưa nước và Sudan I, Sudan II trung hòa/kỵ nước) trên bề mặt vật liệu nanosilica chế tạo từ phụ phẩm nông nghiệp vỏ trấu (RHNS).
  • Khám phá và xác lập điều kiện hấp phụ hiệu quả của các hợp chất Sudan kỵ nước lên vật liệu nanosilica tại điểm đẳng điện của vật liệu, mở rộng phạm vi ứng dụng của vật liệu silica vô cơ trong xử lý các hợp chất hữu cơ không phân cực.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Xây dựng thành công 2 quy trình hoàn chỉnh để phân tích Auramine O và hỗn hợp Sudan I, Sudan II trong 8 loại nền mẫu thực phẩm (măng, miến, dưa chua, phấn hoa, cá khô, mì tôm, thịt khô, bim bim) bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng detector PDA thông dụng.
  • Đề xuất quy trình chuẩn bị mẫu thân thiện với môi trường (hóa học xanh): sử dụng dung môi ethanol và hỗn hợp ethanol-nước thay thế hoàn toàn các dung môi hữu cơ độc hại truyền thống (như diclometan, cloroform, aceton); sử dụng vật liệu hấp phụ RHNS tái chế từ vỏ trấu giá thành thấp.
  • Đưa ra giải pháp kỹ thuật kết hợp rửa giải chất màu trực tiếp từ vật liệu RHNS bằng chính dung môi pha động của hệ thống HPLC, loại bỏ hoàn toàn giai đoạn bốc hơi dung môi làm khô và hòa tan lại, giảm thiểu thất thoát chất phân tích và rút ngắn thời gian xử lý mẫu.
  • Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm về hàm lượng vết của Auramine O và Sudan I, Sudan II trong các mẫu thực phẩm thương mại trên thị trường, phục vụ công tác kiểm soát an toàn thực phẩm.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề xuất áp dụng quy trình phân tích RP-HPLC kết hợp xử lý mẫu bằng RHNS tại các phòng kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm, trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh/thành phố nơi chưa được trang bị thiết bị LC-MS/MS đắt tiền.
  • Kiến nghị các cơ quan quản lý nhà nước bổ sung phương pháp phân tích kiểm tra định lượng các hợp chất Sudan trong thực phẩm vào hệ thống Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Luận án mới tập trung khảo sát định lượng 3 chất màu đơn lẻ và hỗn hợp (AO, Sudan I, Sudan II) trên 8 nhóm nền mẫu thực phẩm cụ thể; chưa khảo sát đồng thời đối với các đồng phân và dẫn xuất khác như Sudan III, Sudan IV hay các chất màu cấm khác (Rhodamine B, Metanil Yellow) trong cùng một quy trình sắc ký đơn lẻ; số lượng mẫu thực tế khảo sát mang tính chất đại diện ngẫu nhiên trên thị trường.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng quy trình phân tích sắc ký đa dư lượng nhằm định lượng đồng thời cả 4 dạng Sudan (I, II, III, IV) và các nhóm chất màu cấm khác trong cùng một lần tiêm mẫu.
    • Nghiên cứu biến tính bề mặt vật liệu nanosilica từ vỏ trấu bằng các nhóm chức hữu cơ để nâng cao dung lượng hấp phụ và độ chọn lọc đối với các hợp chất hữu cơ siêu vết trong các nền mẫu sinh học và thực phẩm phức tạp hơn.
    • Hoàn thiện hồ sơ thẩm định liên phòng thí nghiệm để tiến tới xây dựng dự thảo Tiêu chuẩn Quốc gia cho phương pháp phân tích Sudan trong thực phẩm bằng HPLC.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thực phẩm: Luận án là tài liệu tham khảo về phương pháp luận tối ưu hóa điều kiện sắc ký HPLC, kỹ thuật xử lý dữ liệu thống kê đường chuẩn (kiểm định Student, chuẩn Fisher), tính toán giới hạn phát hiện (LOD, LOQ, MDL, MQL), đánh giá độ không đảm bảo đo và quy trình khảo sát hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir trên vật liệu nano.
  • Đối với cán bộ kiểm nghiệm tại các phòng phân tích, viện kiểm nghiệm an toàn thực phẩm: Cung cấp quy trình chiết tách xanh bằng ethanol và kỹ thuật làm sạch mẫu bằng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) dễ thực hiện, chi phí thấp, áp dụng trực tiếp trên hệ thống HPLC-PDA/UV-Vis thông dụng.
  • Đối với cơ quan quản lý và hoạch định chính sách an toàn thực phẩm: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm và phương pháp kiểm tra khả thi để phục vụ thanh tra, giám sát việc lạm dụng chất màu cấm công nghiệp trong chuỗi cung ứng thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn phương pháp RP-HPLC-PDA thay vì sử dụng LC-MS/MS theo TCVN 12267:2018?

Hệ thống LC-MS/MS theo TCVN 12267:2018 đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị rất cao, chi phí vận hành lớn và không phổ biến tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ ở Việt Nam; ngoài ra tiêu chuẩn này chỉ dùng một quy trình chiết dung môi đơn nhất cho mọi nền mẫu. Phương pháp RP-HPLC kết hợp detector PDA được lựa chọn vì thiết bị phổ biến, chi phí phân tích thấp, vận hành đơn giản, đồng thời khi kết hợp với quy trình xử lý làm sạch bằng nanosilica (RHNS) vẫn đảm bảo độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao ở hàm lượng vết.

2. Dung môi chiết tối ưu được luận án lựa chọn cho Auramine O và hỗn hợp Sudan có ưu điểm gì?

Luận án sử dụng hỗn hợp $\text{Ethanol} : \text{Nước}$ (70:30 v/v) để chiết Auramine O và $\text{Ethanol tuyệt đối}$ (100%) để chiết hỗn hợp Sudan I, Sudan II. Ưu điểm nổi bật là đạt hiệu suất chiết cao (trên 90%), dung môi thân thiện với môi trường và an toàn cho kiểm nghiệm viên (chuẩn bị mẫu xanh), chi phí thấp, thay thế hoàn toàn các dung môi clo hóa độc hại như diclometan hay cloroform.

3. Vai trò của vật liệu nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) trong quy trình xử lý mẫu là gì?

Vật liệu RHNS đóng vai trò là pha hấp phụ rắn để làm sạch và làm giàu chất màu từ dịch chiết của các nền mẫu phức tạp (phấn hoa, cá khô, mì tôm, bim bim) có chứa nhiều chất béo, protein hoặc hợp chất màu tự nhiên. Sau khi hấp phụ chất màu, dịch nền mẫu chứa tạp chất được loại bỏ và chất màu được giải hấp trực tiếp bằng chính dung môi pha động HPLC, giúp tránh hiện tượng kết tủa gây tắc cột và loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu.

4. Thành phần pha động và điều kiện HPLC tối ưu để phân tích đồng thời Sudan I và Sudan II là gì?

Điều kiện tối ưu gồm: Cột sắc ký pha đảo RP-C18; pha động là hỗn hợp $\text{Acetonitril (ACN)} : \text{Dung dịch HCOOH 0,1%}$ theo tỷ lệ thể tích 85:15 (v/v); tốc độ dòng pha động 1,0 mL/phút; bước sóng phát hiện tại cực đại hấp thụ $\lambda_{\max} = 478\text{ nm}$ (cho Sudan I) và $490\text{ nm}$ (cho Sudan II). Hệ điều kiện này cho phép tách sắc ký hoàn toàn hai chất trong thời gian dưới 10 phút với độ đối xứng peak tốt ($AF \approx 1$).

5. Khảo sát mẫu thực phẩm thực tế trong luận án đã áp dụng trên những đối tượng nào?

Luận án đã phân tích thực tế trên 8 nhóm sản phẩm thực phẩm thu thập trên thị trường:

  • Phân tích Auramine O: Mẫu măng tươi/ngâm, miến dong, dưa cải muối chua (áp dụng quy trình chiết trực tiếp); mẫu phấn hoa, cá khô, mì tôm (áp dụng quy trình chiết kết hợp hấp phụ làm sạch qua nanosilica RHNS).
  • Phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II: Mẫu thịt sấy khô (quy trình chiết trực tiếp) và mẫu snack bim bim (quy trình chiết kết hợp hấp phụ qua RHNS).

Kết luận

Luận án của tác giả Phạm Thị Chuyên đã xây dựng thành công quy trình phân tích định lượng chất màu cấm Auramine O, Sudan I và Sudan II trong 8 nhóm nền mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC-PDA). Công trình đã giải quyết được yêu cầu chuẩn bị mẫu theo hướng hóa học xanh khi sử dụng dung môi ethanol và tận dụng phụ phẩm nông nghiệp chế tạo vật liệu nanosilica (RHNS) để làm sạch, làm giàu mẫu hiệu quả trước khi phân tích. Các thông số thẩm định phương pháp về khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ thu hồi và độ không đảm bảo đo đều đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn phân tích kiểm nghiệm thực phẩm hiện hành. Kết quả nghiên cứu có giá trị khoa học và khả năng ứng dụng thực tiễn cao tại các phòng thí nghiệm kiểm định chất lượng thực phẩm tại Việt Nam.