Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ Wharton's Jelly dây rốn người trong luận văn thạc sĩ

• Tác giả: Trần Thị Dung
• Người hướng dẫn: Ths. Vi Đại Lâm - Khoa Công nghệ sinh học - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Wharton's Jelly dây rốn người
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn của đề tài
• 1.3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.3.1. Cơ sở khoa học
• 1.3.2. Tế bào gốc
• 1.3.2.1. Tế bào gốc trung mô
• 1.3.2.2. Tính mềm dẻo của MSCs
• 1.3.2.3. Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô
• 1.3.3. Tế bào gốc trung mô ở dây rốn
• 1.3.3.1. Dây rốn
• 1.3.3.2. Các chỉ thị phân tử của tế bào gốc trung mô từ chất nền dây rốn
• 1.4. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.4.1.3. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 1.4.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.4.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.4.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 1.5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.5.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào
• 1.5.2. Kĩ thuật cấy chuyển
• 1.5.3. Kết quả tách RNA
• 1.5.4. Biểu hiện các marker của MSCs ở tế bào nuôi cấy
• 1.5.5. Phương pháp lạnh đông
• 1.6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC A

I. Tổng quan về tế bào gốc và Wharton s Jelly

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa, có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành các loại tế bào chuyên biệt. Wharton's Jelly là lớp mô đệm trong dây rốn, chứa nhiều tế bào gốc trung mô (MSCs). Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ Wharton's Jelly của dây rốn người, một nguồn tế bào gốc dồi dào và ít gây tranh cãi về đạo đức. Tế bào gốc từ dây rốn có tiềm năng ứng dụng cao trong y học tái tạo và điều trị bệnh.

1.1. Tế bào gốc và tiềm năng ứng dụng

Tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, từ tế bào máu đến tế bào thần kinh. Chúng được ứng dụng trong công nghệ tế bào gốc, đặc biệt trong y học tái tạo và điều trị các bệnh như ung thư, thoái hóa khớp, và bệnh Alzheimer. Tế bào gốc từ Wharton's Jelly được đánh giá cao do khả năng biệt hóa đa dạng và dễ thu thập.

1.2. Wharton s Jelly và tế bào gốc trung mô

Wharton's Jelly là lớp mô giàu chất nền, bao quanh các mạch máu trong dây rốn. Nó chứa tế bào gốc trung mô (MSCs), có khả năng biệt hóa thành xương, sụn, mỡ, và tế bào thần kinh. Tế bào gốc từ Wharton's Jelly được coi là nguồn tế bào gốc lý tưởng do tính sẵn có và không gây tổn hại đến cơ thể người hiến tặng.

II. Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào gốc

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp nuôi cấy và phân lập tế bào từ Wharton's Jelly của dây rốn người. Quy trình bao gồm việc xử lý mẫu dây rốn, tách lớp Wharton's Jelly, và nuôi cấy tế bào trong môi trường chuyên biệt. Kết quả cho thấy tế bào gốc có khả năng tăng sinh và biệt hóa tốt trong điều kiện in vitro.

2.1. Quy trình phân lập tế bào gốc

Quy trình phân lập tế bào gốc bắt đầu bằng việc thu thập dây rốn từ trẻ sơ sinh. Lớp Wharton's Jelly được tách ra và xử lý bằng enzyme để thu nhận tế bào gốc trung mô. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 bổ sung huyết thanh bào thai bò (FBS) và các yếu tố tăng trưởng.

2.2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc

Nuôi cấy tế bào gốc được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Tế bào được nuôi trong đĩa Petri và theo dõi sự tăng sinh qua các giai đoạn. Khi đạt mật độ 80%, tế bào được cấy chuyển sang đĩa mới để duy trì sự phát triển. Kết quả cho thấy tế bào gốc từ Wharton's Jelly có khả năng tăng sinh mạnh và ổn định.

III. Ứng dụng và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ tế bào gốc và ứng dụng trong y học. Tế bào gốc từ Wharton's Jelly có tiềm năng lớn trong điều trị các bệnh thoái hóa và tái tạo mô. Ngoài ra, việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc từ dây rốn sẽ mở ra hướng nghiên cứu mới trong y sinh học.

3.1. Ứng dụng trong y học tái tạo

Tế bào gốc từ Wharton's Jelly được ứng dụng trong y học tái tạo để điều trị các bệnh như thoái hóa khớp, bệnh Parkinson, và tổn thương tủy sống. Chúng cũng được nghiên cứu để tái tạo các mô và cơ quan bị tổn thương, mang lại hy vọng cho hàng triệu bệnh nhân trên toàn thế giới.

3.2. Xây dựng ngân hàng tế bào gốc

Nghiên cứu này góp phần xây dựng ngân hàng tế bào gốc từ dây rốn, một nguồn tế bào gốc dồi dào và dễ thu thập. Ngân hàng tế bào gốc sẽ là nguồn tài nguyên quý giá cho các nghiên cứu y sinh học và ứng dụng lâm sàng trong tương lai.

Tổng quan nghiên cứu

Tế bào gốc trung mô (MSCs) từ lớp Wharton’s jelly (WJ) của dây rốn người được xem là nguồn tế bào gốc đa năng có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y sinh học và liệu pháp tế bào. Theo ước tính, dây rốn dài khoảng 50 cm, dày 2 cm, chứa lớp WJ giàu MSCs với khả năng biệt hóa đa dòng và tự làm mới cao. Nghiên cứu này tập trung phân lập và nuôi cấy MSCs từ lớp WJ dây rốn người nhằm hoàn thiện quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô, tạo ngân hàng tế bào gốc phục vụ nghiên cứu và ứng dụng trong tương lai.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2015. Mục tiêu cụ thể gồm phân lập thành công MSCs từ lớp WJ, nuôi cấy tế bào trong môi trường in vitro và xây dựng quy trình bảo quản lạnh đông tế bào. Ý nghĩa nghiên cứu không chỉ mở rộng hiểu biết về đặc tính sinh học của MSCs mà còn góp phần phát triển các ứng dụng trong kỹ nghệ mô, liệu pháp tế bào, liệu pháp gen và thử nghiệm độc tố. Ngoài ra, việc sử dụng tế bào gốc từ dây rốn không gây tổn thương cho người hiến, không vi phạm đạo đức và có tiềm năng ứng dụng cao trong điều trị các bệnh lý như suy tủy, ung thư máu, thoái hóa cơ tim, bại não, Parkinson.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về tế bào gốc trung mô (MSCs) và đặc tính sinh học của chúng. MSCs là tế bào đa năng có khả năng tự làm mới (self-renewal), phân chia và biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt như xương, mỡ, sụn, thần kinh, gan. Tính mềm dẻo (plasticity) của MSCs cho phép chúng chuyển biệt hóa khi thay đổi môi trường nuôi cấy. Các khái niệm chính bao gồm:

• Tính tự làm mới: MSCs phân chia tạo ra tế bào con giống hệt tế bào mẹ và tế bào biệt hóa.
• Tiềm năng biệt hóa đa dòng: MSCs có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau dưới tác động của các yếu tố môi trường.
• Chỉ thị bề mặt tế bào (marker): Các marker như CD90, CD73, CD105 biểu hiện trên MSCs, trong khi CD34, CD45 không biểu hiện, giúp phân biệt MSCs với tế bào tạo máu.
• Phương pháp RT-PCR: Kỹ thuật khuếch đại cDNA từ RNA để đánh giá biểu hiện gene marker đặc trưng của MSCs.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu dây rốn tươi hoặc đông lạnh được thu nhận từ bệnh viện, xử lý trong điều kiện vô trùng. Phương pháp phân lập tế bào gồm hai cách chính: nuôi cấy mảnh mô (phương pháp cơ học) và xử lý enzyme (collagenase, hyaluronidase, trypsin). Môi trường nuôi cấy sử dụng DMEM/F12 bổ sung 10-15% huyết thanh bào thai bò (FBS), các yếu tố tăng trưởng như EGF, FGF và kháng sinh để ngăn nhiễm khuẩn.

Cỡ mẫu khoảng 5x10^6 tế bào được sử dụng để tách chiết RNA bằng bộ kit RNeasy® Mini Kit. Phân tích biểu hiện gene marker thực hiện bằng kỹ thuật RT-PCR với các primer đặc hiệu cho CD90, CD73, CD105, Oct-1, GATA4, HNF3β, CD86, AFP, HNF4α. Chu kỳ nhiệt RT-PCR gồm 30 phút phiên mã ngược ở 50°C, 30 chu kỳ khuếch đại với biến tính ở 94°C và bắt cặp ở 58°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1.5%.

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2015, bao gồm thu nhận mẫu, phân lập, nuôi cấy, tách RNA, RT-PCR và phân tích kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và nuôi cấy thành công MSCs từ lớp WJ dây rốn: Sau 3 ngày nuôi cấy, tế bào đơn bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô, hình thái chủ yếu là nguyên bào sợi. Đến ngày 21, tế bào tăng sinh mạnh, tạo thành mảng tế bào với mật độ bao phủ bề mặt khoảng 80%. Phương pháp enzyme rút ngắn thời gian thu nhận tế bào đơn từ 2-3 tuần xuống còn 2-3 giờ.

2. Biểu hiện marker đặc trưng của MSCs: Kết quả RT-PCR và điện di cho thấy các marker MSCs như CD90, CD73, CD105, CD86 đều được biểu hiện rõ ràng. Marker của tế bào gốc phôi như Oct-1, Eras cũng được phát hiện. Marker của tế bào gan (AFP, HNF4α) không biểu hiện, phù hợp với tế bào chưa biệt hóa.

3. Hiệu quả bảo quản lạnh đông: Tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng (-196°C) với dung dịch chứa 10% DMSO duy trì khả năng sống và tăng sinh sau giải đông. Sau 3 ngày nuôi cấy, tế bào đạt mật độ 80% hợp lưu, không có dấu hiệu chết hay nhiễm khuẩn.

4. So sánh phương pháp phân lập: Phương pháp nuôi cấy mảnh mô cho quần thể tế bào đồng nhất hơn, khả năng tăng sinh kéo dài đến 80 ngày, trong khi phương pháp enzyme cho số lượng tế bào ban đầu cao hơn nhưng thời gian tăng sinh ngắn hơn (khoảng 30 ngày).

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân thành công trong phân lập MSCs từ lớp WJ là do cấu trúc đặc biệt của lớp WJ chứa nhiều collagen và nguyên bào sợi, tạo môi trường thuận lợi cho tế bào gốc phát triển. Phương pháp enzyme giúp phá vỡ mô liên kết nhanh chóng, giải phóng tế bào gốc dễ dàng tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, rút ngắn thời gian thu nhận tế bào đơn.

Kết quả biểu hiện marker phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, khẳng định tính đa năng và đặc tính sinh học của MSCs từ dây rốn. Việc không phát hiện marker tế bào gan AFP và HNF4α chứng tỏ tế bào chưa biệt hóa, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

Bảo quản lạnh đông thành công mở ra khả năng xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn, phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng trong tương lai. So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả này tương đồng với báo cáo của các nhà khoa học về khả năng tăng sinh và biểu hiện marker của MSCs từ WJ.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng trưởng tế bào theo thời gian nuôi cấy, bảng so sánh biểu hiện marker giữa các phương pháp phân lập và hình ảnh điện di gel PCR minh họa kết quả RT-PCR.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục duy trì và mở rộng nuôi cấy MSCs: Đề xuất duy trì dòng tế bào qua nhiều lần cấy chuyền để đảm bảo tính ổn định và đồng nhất, đồng thời khảo sát khả năng tăng sinh dài hạn, nhằm phục vụ nghiên cứu chuyên sâu.

2. Thử nghiệm biệt hóa đa dòng: Thực hiện các thí nghiệm biệt hóa MSCs thành tế bào chuyên biệt như tế bào gan, xương, cơ tim để chứng minh tiềm năng đa năng và ứng dụng trong liệu pháp tế bào.

3. Phát triển kỹ thuật chuyển gene: Áp dụng kỹ thuật chuyển gene vào MSCs để nghiên cứu liệu pháp gen, điều trị các bệnh lý di truyền hoặc ung thư, đồng thời đánh giá hiệu quả và an toàn trên mô hình động vật.

4. Xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn: Thiết lập quy trình chuẩn thu nhận, bảo quản và phân phối tế bào gốc dây rốn, đảm bảo chất lượng và an toàn, phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng trong nước.

5. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy không huyết thanh: Phát triển môi trường nuôi cấy MSCs không chứa huyết thanh động vật nhằm giảm nguy cơ lây nhiễm virus và phản ứng miễn dịch khi ứng dụng lâm sàng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và tế bào gốc: Luận văn cung cấp quy trình phân lập, nuôi cấy và đánh giá đặc tính MSCs từ dây rốn, hỗ trợ phát triển các nghiên cứu chuyên sâu về tế bào gốc.

2. Bác sĩ và chuyên gia y học tái tạo: Thông tin về tiềm năng ứng dụng MSCs trong điều trị các bệnh lý thoái hóa, tổn thương mô và liệu pháp tế bào giúp mở rộng hướng điều trị mới.

3. Nhà quản lý và phát triển ngân hàng tế bào gốc: Luận văn cung cấp cơ sở khoa học và kỹ thuật để xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn, đảm bảo chất lượng và an toàn cho việc lưu trữ và sử dụng.

4. Sinh viên và học viên ngành công nghệ sinh học, y học: Tài liệu tham khảo chi tiết về kỹ thuật phân lập, nuôi cấy, bảo quản và phân tích gene của MSCs, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực hành.

Câu hỏi thường gặp

1. Tế bào gốc trung mô từ dây rốn có ưu điểm gì so với nguồn khác?
   Tế bào gốc từ dây rốn dễ thu hoạch, không gây tổn thương người hiến, có tiềm năng biệt hóa đa dòng cao và ít bị đào thải miễn dịch. Ngoài ra, nguồn này không vướng mắc về đạo đức như tế bào gốc phôi.

2. Phương pháp phân lập tế bào gốc nào hiệu quả nhất?
   Phương pháp nuôi cấy mảnh mô cho quần thể tế bào đồng nhất và khả năng tăng sinh lâu dài, trong khi phương pháp enzyme thu được số lượng tế bào ban đầu nhiều hơn và thời gian thu nhận nhanh hơn.

3. Làm thế nào để đánh giá đặc tính của MSCs?
   Đặc tính MSCs được đánh giá qua biểu hiện các marker bề mặt như CD90, CD73, CD105 bằng kỹ thuật RT-PCR và Flow cytometry, đồng thời quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi.

4. Quy trình bảo quản tế bào gốc như thế nào?
   Tế bào gốc được bảo quản lạnh đông trong nitơ lỏng (-196°C) với dung dịch chứa 10% DMSO để duy trì khả năng sống và tăng sinh sau giải đông.

5. MSCs từ dây rốn có thể ứng dụng trong điều trị bệnh gì?
   MSCs có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh suy tủy, ung thư máu, thoái hóa khớp, liệt tủy sống, bỏng da, bệnh Alzheimer, Parkinson và các bệnh thoái hóa cơ tim.

Kết luận

• Phân lập và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người với hình thái đặc trưng và biểu hiện marker MSCs.
• Hoàn thiện quy trình bảo quản lạnh đông tế bào gốc đảm bảo duy trì đặc tính sinh học trong thời gian dài.
• Kết quả nghiên cứu mở rộng hiểu biết về đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của MSCs từ dây rốn.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu biệt hóa đa dòng và chuyển gene để phát triển liệu pháp tế bào và gen.
• Khuyến nghị xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn phục vụ nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng trong tương lai.

Hành động tiếp theo là triển khai các thí nghiệm biệt hóa và chuyển gene, đồng thời phát triển quy trình chuẩn cho ngân hàng tế bào gốc. Các nhà nghiên cứu và chuyên gia y sinh học được khuyến khích áp dụng và phát triển thêm từ kết quả này nhằm thúc đẩy ứng dụng tế bào gốc trong y học tái tạo.