Đồ án: Phân lập hợp chất từ cao ethyl acetate hạt me (Tamarindus indica L.)

Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao ethyl acetate hạt me (Tamarindus indica L.). Khảo sát cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của chúng.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Trúc
• Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Hóa học và Thực phẩm
• Đề tài: Phân lập hợp chất từ phân đoạn Ti-D của cao ethyl acetate điều chế từ hạt me (Tamarindus indica L.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây me và hạt me Tamarindus indica L

Cây me (Tamarindus indica L.) là một loài thực vật đa năng có nguồn gốc từ châu Phi, được trồng rộng rãi tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Hạt me là phụ phẩm quan trọng trong các ngành sản xuất thực phẩm như bánh, kẹo, mứt và nước ép. Hiện tại, hạt me thường bị thải bỏ, gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy hạt me chứa nhiều hợp chất polyphenol có giá trị sinh học cao. Việc khai thác và phân lập các hợp chất từ hạt me không chỉ giúp giảm thiểu rác thải mà còn mở ra những ứng dụng mới trong công nghệ sinh học và dược phẩm. Các hợp chất tự nhiên từ hạt me có khả năng ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm chức năng và dược phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh thái và phân loại của cây me

Cây me thuộc họ Fabaceae, phân bố chủ yếu ở các vùng khí hậu nóng ẩm. Cây me (Tamarindus indica) là một loài lâu năm có thể sống lâu đến 200 năm. Cây có khả năng thích ứng tốt với đất cằn cỗi, khô hạn. Quả me là một loại quả hỗn hợp chứa thịt quả chua ngọt và nhiều hạt. Trong phân loại khoa học, cây me được phân lập với các đặc điểm hình thái rõ ràng, giúp dễ dàng nhận biết.

1.2. Thành phần hóa học của hạt me

Hạt me chứa thành phần hóa học đa dạng bao gồm polysaccharide, protein, chất béo và các hợp chất polyphenol. Trong đó, polyphenol là nhóm hợp chất quan trọng nhất với hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Các nghiên cứu cho thấy cao ethyl acetate từ hạt me giàu các flavonoid như quercetin và các acid benzoic, đặc biệt là acid 4-hydroxybenzoic. Những hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.

II. Phương pháp phân lập và điều chế cao từ hạt me

Phân lập hợp chất từ hạt me thường bắt đầu bằng quá trình trích ly cao sử dụng các dung môi hữu cơ khác nhau. Thông thường, hạt me được nghiền thành bột mịn, sau đó trích ly với methanol (MeOH) để thu được cao thô. Cao này được tiếp tục phân đoạn bằng các dung môi như ethyl acetate, chloroform và hexane để tách riêng các hợp chất cơ bản. Sắc ký cột (column chromatography) là kỹ thuật chính được sử dụng để phân lập từng hợp chất cụ thể. Quá trình này yêu cầu lựa chọn cẩn thận các dung môi và điều kiện thích hợp. Cao ethyl acetate thường chứa nồng độ cao các flavonoid và được ưu tiên trong các nghiên cứu về hoạt tính sinh học.

2.1. Quy trình trích ly và điều chế cao MeOH

Quy trình bắt đầu với việc nghiền bột hạt me và trích ly bằng methanol lạnh. Hỗn hợp được lọc và tập trung dưới áp lực giảm để thu được cao thô methanol (crude methanol extract). Cao này sau đó được hòa tan trong nước và tiến hành phân đoạn lịch nước-liệu hữu cơ với các dung môi khác nhau như chloroform, ethyl acetate và n-hexane. Mỗi phân đoạn được lưu giữ riêng biệt, làm khô và cân khối lượng để xác định thu suất.

2.2. Kỹ thuật sắc ký cột phân lập hợp chất

Sắc ký cột (SKC) là phương pháp chính để phân lập hợp chất tự nhiên từ cao ethyl acetate. Quá trình sử dụng silica gel hoặc các chất hấp phụ khác làm chất nền. Các hợp chất được rửa lần lượt với các hỗn hợp dung môi có độ cực tăng dần. Các phân đoạn được thu thập, phân tích bằng sắc ký bản mỏng (TLC) để xác định độ tinh khiết. Hợp chất TT01 (acid 4-hydroxybenzoic) và hợp chất TT02 (quercetin) được phân lập từ các phân đoạn khác nhau.

III. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc là bước quan trọng trong quá trình phân lập hợp chất từ hạt me. Các phương pháp phổ học hiện đại được sử dụng bao gồm phổ NMR (Nuclear Magnetic Resonance), phổ MS (Mass Spectrometry) và phổ IR (Infrared Spectroscopy). Phổ NMR 1H và 13C cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc carbon-hydrogen. Phổ MS xác định khối lượng phân tử chính xác. Phổ IR giúp xác định các nhóm chức năng. Các kỹ thuật 2D NMR như HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) và HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) cho phép xác định các mối liên kết multi-bond giữa các nguyên tử. Thông qua các dữ liệu này, hợp chất TT01 được xác định là acid 4-hydroxybenzoic và hợp chất TT02 là quercetin, một flavonoid quan trọng.

3.1. Phân tích phổ NMR của hợp chất TT01

Hợp chất TT01 được xác định thông qua dữ liệu phổ NMR 1H cho thấy các tín hiệu đặc trưng của acid 4-hydroxybenzoic. Phổ 1H cho thấy một cặp mũi đôi (doublet) ở vùng aromatic tương ứng với các proton trên vòng benzene. Phổ 13C cho thấy các carbon aromatic và carbon carboxylic. So sánh với dữ liệu tham khảo, cấu trúc được xác định là acid para-hydroxybenzoic, một acid benzoic có nhóm hydroxyl ở vị trí 4.

3.2. Phân tích phổ NMR của hợp chất TT02 Quercetin

Hợp chất TT02 là một flavonoid có cấu trúc phức tạp hơn. Phổ NMR 1H cho thấy các tín hiệu từ các proton aromatic trên các vòng benzene A, B và C. Dữ liệu HMBC cho thấy các mối liên kết giữa các carbon và proton ở khoảng cách 2-3 liên kết. Phổ MS xác định khối lượng phân tử là 302, phù hợp với quercetin (C15H10O7). Các sắc ký cột và phân tích UV-Vis tiếp theo xác nhận rằng hợp chất là quercetin.

IV. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của các hợp chất phân lập

Các hợp chất phân lập từ hạt me đặc biệt là acid 4-hydroxybenzoic và quercetin sở hữu các hoạt tính sinh học nổi bật. Hoạt tính chống oxy hóa là một trong những hoạt tính quan trọng nhất, được đánh giá bằng phương pháp DPPH (2,2-diphenylpicrylhydrazyl). Các hợp chất này có khả năng quét gốc tự do hiệu quả, với giá trị IC50 thấp. Ngoài ra, các polyphenol từ hạt me còn có hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn. Quercetin đặc biệt được biết đến với khả năng bảo vệ tế bào, tăng cường miễn dịch và làm chậm quá trình lão hóa. Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm. Việc khai thác phụ phẩm hạt me không chỉ tạo giá trị kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

4.1. Hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất TT01 và TT02

Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua phương pháp DPPH radical scavenging. Kết quả cho thấy cả TT01 (acid 4-hydroxybenzoic) và TT02 (quercetin) đều có khả năng quét gốc tự do mạnh mẽ. Quercetin (TT02) cho thấy hoạt tính mạnh hơn với giá trị IC50 thấp hơn, điều này phù hợp với cấu trúc flavonoid phức tạp của nó. Acid 4-hydroxybenzoic cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa đáng kể nhờ nhóm hydroxyl trên vòng benzene.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm

Các hợp chất phân lập từ hạt me có thể được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng như bổ sung dinh dưỡng, nước uống tăng cường sức khỏe. Quercetin được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ sức khỏe tim mạch. Ngoài ra, các polyphenol còn được ứng dụng trong mỹ phẩm nhờ khả năng chống lão hóa da. Trong lĩnh vực dược phẩm, các hợp chất này là tiền chất để tổng hợp các loại thuốc mới. Việc tận dụng phụ phẩm hạt me thể hiện xu hướng phát triển bền vững và kinh tế tuần hoàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học, y học, nhiều loại bệnh đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu thành công các phƣơng thuốc điều trị. Ðể đáp ứng đƣợc hết nhu cầu chăm sóc sức khoẻ của nguời bệnh, các nhà duợc liệu đã nghiên cứu, tổng hợp đƣợc nhiều loại thuốc đặc trị với quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, sau một thời gian sử dụng thì một số loại thuốc tổng hợp lại có tác dụng phụ không mong muốn. Chính vì vậy con nguời có xu hƣớng trở lại với thiên nhiên, từ cây cỏ phân tích, giải mã các thành phần hoá học cũng nhƣ dƣợc tính của chất trong cây với mong muốn tìm ra các phuong thuốc mới an toàn cho sức khoẻ nguời tiêu dùng.

Mặt khác, nuớc ta là một nuớc nhiệt đới gió mùa, có khí hậu nóng và ẩm nên nguồn thực vật tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Vì những lý do này mà việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ ngày càng đƣợc đẩy mạnh. Cây me thuộc chi Tamarindus của họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, các bộ phận của cây me đều đƣợc dùng trong cuộc sống hàng ngày. Trong các bộ phận của cây me, hạt me không chỉ là nguồn dinh dƣỡng giàu protein (13-27%), và chứa một lƣợng lớn các acid amin thiết yếu, nhƣ isoleucine, leucine, lycine, methionine, phenylalanin, valine mà còn là nguồn cung cấp acid béo thiết yếu, khoáng chất đặc biệt là canxi, photpho và kali tƣơng đối cao so với các loại đậu khác.

Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về thành phần hóa học chỉ tập trung vào polysaccharide của hạt me mà chƣa chú trọng tới các thành phần có hoạt tính sinh học nhƣ các polyphenol. Từ kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa và tyrosinase của 60 loại phụ phẩm Việt Nam (2014-2016) của nhóm tác giả P. Đào và cộng sự[1] đã phát hiện ra cao chiết ethanol từ hạt me có hoạt tính cao tƣơng ứng giá trị IC50 đối với phép thử ức chế gốc tự do DPPH là 6,91 µg/mL, phép thử ức chế H2O2 là 113,8 µg/mL, tổng hàm lƣợng flavonoid là 848,8 CE/100 g mẫu. Đây là một phát hiện quan trọng, và là lý do cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của hạt me nhằm góp phần mở rộng khả năng ứng dụng của hạt me Việt Nam trong thực tiễn.

1 Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài " phân lập chất từ phân đoạn TI-D của cao ethyl acetate điều chế từ hạt me (Tamarindus indica L.)" để tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: - Phân lập các hợp chất tinh khiết từ hạt me bằng các phƣơng pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập đƣợc bằng các phƣơng pháp phổ nghiệm hiện đại nhƣ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật 1.1 Phân loại khoa học Me (Tamarindus indica L.) là một loại cây nhiệt đới đƣợc trồng rất nhiều ở các nƣớc châu Á[2], có phân loại khoa học[3] là: - Giới: Plantae - Bộ: Fabales - Họ: Fabaceae - Chi: Tamarindus - Loài: Tamarindus indica L Hình 1.1 Ảnh minh họa cây me Cây me cao 15-30 m, đƣờng kính 60-100 cm, thân thẳng không tròn, hơi vặn xoắn, nhiều cành tán cây rộng, nhiều lá. Lá cây me có dạng kép lông chim chẵn, dài từ 8 đến 10 cm, gồm 10 đến 20 đôi lá chét thuôn không cân xứng, chóp lõm, dài 20 mm, rộng 2 mm.

Hoa trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá hay thành chùy tận cùng. Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt, dài 7-12 cm, rộng 25 mm, dày 10 mm. Vỏ quả ngoài mỏng, cứng, giòn, màu hung đỏ, vỏ quả giữa có xơ, vị chua, sau khi loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu nâu nhạt hay vàng nhạt. Quả chứa 3-5 hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng.

Mùa quả vào tháng 10-11.2 Ảnh minh họa quả me và hạt me 1.2 Phân bố và sinh thái Họ Đậu (Fabaceae) là một họ thực vật lớn với khoảng 500 chi và gần 1.200 loài, phân bố rộng, chủ yếu ở vùng ôn đới. Ở nƣớc ta có khoảng 90 chi và 450 loài. Theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, họ Đậu rất phong phú về dạng sống: cây gỗ, cây bụi, thân thảo, dây leo, dây leo thân thảo. Cây me là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhƣng đƣợc phân bố rộng rãi trên toàn thế giới với trên 50 quốc gia.

Diện tích trồng phần lớn tập trung tại các nƣớc châu Á nhƣ Ấn Độ, Thái Lan, Băng La Đét, Srilanka và Indonecia. Cây me là cây ƣa sáng, ƣa nhiều kiểu đất khác nhau. Ở nƣớc ta, cây me đƣợc trồng nhiều ở các vùng nhƣ ở Hà Giang, Tuyên Quang, Vĩnh Phú, Quảng Ninh, Hải Phòng, Bắc Thái, Lai Châu, Sơn La, Hà Tây, Hoà Bình, Nam Hà, Ninh Bình, Thanh Hóa và các tỉnh phía nam, còn đƣợc trồng ở các vƣờn quanh nhà hoặc trồng ở ven đƣờng và trong các vƣờn hoa làm cây cho bóng mát.[2] Gỗ thân cây me cứng, không mịn, có thể đóng đồ đạc bàn ghế thông thƣờng. Đối với quả me, phần thịt me đƣợc sử dụng chủ yếu để phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm nhƣ kẹo, mứt, nƣớc giải khát,.

Vỏ me, hạt me đƣợc xem nhƣ là phụ phẩm. Phụ phẩm hạt me đƣợc thải bỏ và một phần rất nhỏ đƣợc thu gom làm hạt giống. Hiện nay, nguồn phụ phẩm hạt me đang thải bỏ ra môi trƣờng không chỉ gây tác động ô nhiễm tới môi trƣờng mà còn gây lãng phí một nguồn tài nguyên các hoạt chất sinh học quý báu.3 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của T.1 Thành phần dinh dưỡng của me Hạt me không chỉ là nguồn dinh dƣỡng giàu protein (13-27%), và chứa một lƣợng lớn các acid amin thiết yếu, nhƣ isoleucine, leucine, lycine, methionine, phenylalanin, valine mà còn là nguồn cung cấp axit béo thiết yếu, khoáng chất đặc biệt là canxi, photpho và kali tƣơng đối cao so với các loại đậu khác. Trong quả me, thịt quả chiếm 30-50% của quả chín; vỏ và xơ chiếm khoảng 11-30% và hạt khoảng 25- 40% .1) Trong quả me chứa hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali bitactrat 3,25%, đƣờng 12,5%, gum 4,70%, pectin 6,25%.

Ngoài ra còn có 34,35% xơ, nƣớc 27,55%. Trong hạt có glucozan, xylan, protein, chất béo, muối vô cơ.1 Thành phần hóa học trong hạt me Protein 13-27% Lipid 4,5-16% Tổng lƣợng đƣờng 11-29% Carbonhydrate 50-57% Albuminoids 14-18% Smidrying oil 4,5-6,5% 1.2 Thành phần hóa học của me Bằng các phƣơng pháp sắc ký, phổ nghiệm, GC-MS các nhà khoa học đã xác định đƣợc các hợp chất từ cao methanol và cao nƣớc của các bộ phận khác nhau (lá, hạt, vỏ hạt) từ cây T.2 Các hợp chất trong cây T. indica STT Bộ phận Hợp chất 1-Metyl-4-propylbenzene (1), limonene (2), geraniol (3), 1 Lá longifolene (4), caryophylene (5), 2,6-di-tert-butyl-4- methylphenol (6), methyl 3,5-di-tert-butyl-4- 5 hydroxybenzoate (7), methyl hexadecanoate (8), 6,10,14- trimetylpentadeca-5,9, 13-trien-2-one (9), p-cymene (10), lupanone (11), lupeol (12), methyl 9,12,15- octadecatrienoate (13), phytol (14), methyl 7, 10- octadecadienoate (15), 10-octadecenoic acid (16), Cryptopinone (17), methyl 15-tricosenoate (18) , diphenyl-ether (19), 10-octadecenoic acid (20), hexadecanoic acid (21), 3-eicosine (22), methyl 9,12,15- octadecenotrienoate ester (23), methyl 7, 10- octadecenotrienoate ester (24), malic acid (25), tartaric acid (26), benzene-1,2-dicarboxylic acid (27), nonadecanoic acid (28), luteolin 7-o-glucoside (29), luteolin (30), apigenin (31), iso-orientin (32), orientin (33), vitexin (34), pipecolic acid (35) Phlorotannins (36), succinic acid (37), citric acid (38), tartaric acid (26), formic acid (39), malic acid (40), 2 Quả pectin (41), trans-2-hexanal (42), 2-ethylthiazole (43), 2- methylthiazole (44) Campesterol (45), β-amyrin (46), β-sitosterol (47), palmitic acid (48), oleic acid (49), eicosanoic acid (50), uzarigenin-3-O-β-D-xylopyranosyl (1-2)-α-L rhamnopyranoside (51), 2-hydroxy-3’,4’- 3 Hạt dihydroxyacetophenone(52); methyl 3,4- dihydroxybenzoate (53), 3,4-dihydroxyphenylacetat (54), (+)-epicatechin (55), procyanidin B2 (56), procyanidin trimer (57), procyanidin tetramer (58), procyanidin pentamer (59), procyanidin hexamer (60) n-hexacosane (61), eicosanoic acid (51), β-sinosterol 4 Rễ (47), (+)-pinitol (62), octacosanyl ferulate (63), 21- oxobehenic acid (64), apigenin (31), vitexin (34) 6 Limonene (2) geraniol (3) p-cymene (10) caryophylene (5) longifolene (4) lupeol (12) lupanone (11) Campesterol (45) β-sitosterol (47) palmitic acid (48) Hình 1.3 Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpen và chất béo từ cây T. Indica 7 Procyanidin B2 (56) Procyanidin trimer (57) Apigenin (31) Vitexin (34) (+)-Epicatechin (55) 8 (58), (59), (60) n (58) n=1: Procyanidin tetramer (59) n=2: Procyanidin pentamer (60) n=3: Procyanidin hexamer (52) R= COCH2OH: 2-hydroxy-3’,4’-dihydroxyacetophenone (53) R= COOCH3: methyl 3,4-dihydroxybenzoate (54) R= OCOCH3: 3,4-dihydroxyphenylacetate Luteolin 7-o-glucoside (29) 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (6) 9 Iso-orientin (32) Orientin (33) Phlorotannins (36) Hình 1.4 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol và flavonoid từ cây T.4 Những nghiên cứu về dược học 1.1 Những kinh nghiệm dân gian[4] Ở Việt Nam, me đƣợc trồng phổ biến từ lâu, từng hàng me xanh mƣớt dọc đƣờng phố, đƣờng làng ngõ xóm, trong các vƣờn cây ăn quả.

Các bộ phận của cây đều dùng làm thuốc. Thanh nhiệt, giải độc, giải rƣợu: Từ lá đến quả me đều chứa một lƣợng acid amin nên có thể nấu thành một món ăn bổ dƣỡng, thanh mát, giải nhiệt và thơm dịu. Chất axit trong quả me có thể giải độc, loại bỏ các cơn đau họng, giúp tiêu hóa, giải rƣợu. Bổ sung dinh dƣỡng: Cùi thịt quả me rất giàu đƣờng, acid acetic, acid tartaric, acid formic, acid citric và các thành phần khác, là gia vị chủ yếu trong ngành công nghiệp thực phẩm nhƣ đồ uống, mứt và các sản phẩm khác.

Ngoài ra, quả rất giàu canxi, phốt pho, sắt và các yếu tố vi lƣợng khác, bao gồm tỷ lệ canxi đứng đầu trong tất cả các loại trái cây. Hỗ trợ tiêu hóa: Trong y học, quả me cũng đƣợc sử dụng rộng rãi để chữa tiêu chảy, nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu. Ngƣời ta có thể pha bột me trong nƣớc để uống, 10 có tác dụng chữa chứng mất cảm giác ngon miệng và kén ăn. Những ngƣời bị khô miệng, dễ bị kích ứng, dùng me sắc thành nƣớc uống, thêm đƣờng để làm thành món đồ uống ngọt ngào.

Ngƣời bị táo bón có thể nấu me thành nƣớc để uống thay nƣớc. Tăng cƣờng khả năng miễn dịch: quả me giàu vitamin C nên me giúp tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho cơ thể, hạn chế các nguy cơ mắc bệnh. Chữa cảm lạnh: Bột và thịt me có thể làm món súp nóng dùng để trị bệnh cảm lạnh theo cách chữa bệnh cổ truyền của ngƣời Ấn Độ. Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của các bộ phận cây me và đƣợc đƣa vào sử dụng trong cuộc sống.

Tuy nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá trị của cây me đặc biệt là trong lĩnh vực dinh dƣỡng và dƣợc phẩm.