Nhân Giống và Tạo Mô Sẹo Cây Đậu Núi (Plukenetia volubilis L.) In Vitro

Khám phá phương pháp nhân giống và tạo mô sẹo cây đậu núi Plukenetia volubilis in vitro, ứng dụng trong nông nghiệp và bảo tồn giống cây.

• Tác giả: Huỳnh Thanh Tâm
• Người hướng dẫn: ThS. Đỗ Tiến Vinh
• Trường học: Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nhân Giống và Tạo Mô Sẹo Cây Đậu Núi (Plukenetia volubilis L.) In Vitro
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu cây Đậu núi
• 1.2. Phân bố sinh thái
• 1.3. Đặc điểm thực vật học
• 1.4. Thành phần dinh dưỡng
• 1.5. Tình hình trồng trọt cây Sachi ở nước ta
• 1.6. Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.6.1. Công trình nghiên cứu trong nước
• 1.6.2. Công trình nghiên cứu nước ngoài
• 1.7. Giới thiệu về nuôi cấy in vitro
• 1.7.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro
• 1.7.2. Lịch sử phát triển nuôi cấy in vitro
• 1.7.3. Các giai đoạn nuôi cấy in vitro
• 1.7.3.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
• 1.7.3.2. Tạo thể nhân giống in vitro
• 1.7.3.3. Nhân giống in vitro
• 1.7.3.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
• 1.7.3.5. Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
• 1.7.3.6. Nhân giống in vivo
• 1.7.3.7. Cây con bầu đất và trồng cây ra ruộng
• 1.7.3.8. Chọn lọc cây đầu dòng
• 1.7.4. Các phương pháp nhân giống in vitro
• 1.7.4.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
• 1.7.4.2. Nuôi cấy mô sẹo
• 1.7.4.2.1. Khái niệm mô sẹo
• 1.7.4.2.2. Các giai đoạn trong quá trình hình thành mô sẹo
• 1.7.4.2.3. Các tác nhân tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo
• 1.7.4.2.4. Các giai đoạn phát triển của mô sẹo
• 1.7.4.2.5. Màu sắc của mô sẹo
• 1.7.4.2.6. Hình thái mô sẹo
• 1.7.4.2.7. Phát sinh cơ quan trong nuôi cấy mô sẹo
• 1.7.4.2.8. Hình thành chồi từ mô sẹo
• 1.7.4.2.9. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo
• 1.7.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn
• 1.7.4.4. Nuôi cấy protoplast - chuyển gen
• 1.7.4.5. Nuôi cấy bao phấn và phấn đơn bội
• 1.7.5. Các thành phần trong môi trường nuôi cấy in vitro
• 1.7.5.1. Các chất khoáng
• 1.7.5.2. Chất điều hòa sinh trưởng (ĐHSTTV)
• 1.7.5.3. Các chất bổ sung
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Mẫu nuôi cấy
• 2.4. Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 2.5. Điều kiện nuôi cấy
• 2.6. Môi trường nuôi cấy
• 2.7. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.7.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.7.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của Ca(OCl)2 kết hợp nồng độ và thời gian của Javel đến quá trình vô trùng mẫu cây Sachi in vitro
• 2.7.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến khả năng sinh trưởng phát triển của Sachi in vitro
• 2.7.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng BA đến khả năng tạo chồi của cây Sachi in vitro
• 2.7.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng NAA, IAA, IBA đến khả năng tạo rễ cây Sachi in vitro
• 2.7.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến khả năng tạo mô sẹo cây Sachi in vitro
• 2.7.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo mô sẹo cây Sachi in vitro
• 2.7.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
• 2.7.3.1. Phương pháp thu thập
• 2.7.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.7.3.3. Xử lý kết quả
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của Ca(OCl)2 kết hợp nồng độ và thời gian của Javel đến quá trình vô trùng mẫu cây Sachi in vitro
• 3.2. Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến khả năng sinh trưởng phát triển của Sachi in vitro
• 3.3. Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng BA đến khả năng tạo chồi của cây Sachi in vitro
• 3.4. Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng NAA, IAA, IBA đến khả năng tạo rễ cây Sachi in vitro
• 3.5. Kết quả thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đến khả năng tạo mô sẹo cây Sachi in vitro
• 3.6. Kết quả thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo mô sẹo cây Sachi in vitro
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nhân Giống Đậu Núi Sacha Inchi In Vitro

Cây Đậu núi (Sacha Inchi, Plukenetia volubilis L.) ngày càng được quan tâm nhờ giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt là hàm lượng Omega 3-6-9. Nhân giống in vitro là phương pháp hiệu quả để bảo tồn và nhân nhanh giống cây quý này. Phương pháp này giúp tạo ra số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh trong thời gian ngắn. Bài viết này cung cấp cái nhìn tổng quan về quy trình nhân giống và tạo mô sẹo cây đậu núi in vitro, từ khâu chuẩn bị đến khi ra cây hoàn chỉnh. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Hồng và cộng sự (2012) đã chỉ ra tiềm năng phát triển của cây đậu núi tại Việt Nam, thúc đẩy nhu cầu về các phương pháp nhân giống hiệu quả.

1.1. Giới thiệu chung về cây Đậu Núi Plukenetia volubilis L.

Cây Đậu núi có nguồn gốc từ rừng mưa nhiệt đới Amazon, được biết đến với tên gọi Sacha Inchi. Đây là cây thân leo, có quả hình ngôi sao đặc trưng. Hạt đậu núi chứa hàm lượng dầu cao, giàu Omega 3, 6, và 9, protein và các vitamin. Dầu Sacha Inchi được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm nhờ những lợi ích sức khỏe vượt trội.

1.2. Lợi ích của phương pháp nhân giống in vitro cho Đậu Núi

Nhân giống in vitro mang lại nhiều ưu điểm so với phương pháp truyền thống. Phương pháp này cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây giống từ một cây mẹ duy nhất. Đồng thời, đảm bảo tính đồng nhất về mặt di truyền và tạo ra cây giống sạch bệnh, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường.

II. Thách Thức Trong Nhân Giống In Vitro Cây Đậu Núi

Mặc dù có nhiều ưu điểm, nhân giống in vitro cây đậu núi cũng đối mặt với một số thách thức. Quá trình vô trùng mẫu ban đầu đòi hỏi kỹ thuật cao để loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật gây nhiễm mà không làm tổn thương đến mô thực vật. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp, đặc biệt là tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng, cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo chồi và rễ. Ngoài ra, hiện tượng thoái hóa giống sau nhiều thế hệ nhân giống cũng cần được quan tâm.

2.1. Vấn đề nhiễm bệnh và quy trình vô trùng mẫu

Nhiễm bệnh là một trong những trở ngại lớn nhất trong nuôi cấy mô. Việc sử dụng các chất khử trùng như Javel và Ca(OCl)2 cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo hiệu quả mà không gây độc cho mẫu cấy. Nồng độ và thời gian xử lý phải được tối ưu hóa cho từng loại mẫu.

2.2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho sự phát triển của Đậu Núi

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của cây Đậu núi in vitro. Việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như BA, NAA, IAA, IBA với tỷ lệ phù hợp sẽ kích thích quá trình tạo chồi, tạo rễ và tạo mô sẹo.

2.3. Nguy cơ thoái hóa giống và biện pháp khắc phục

Hiện tượng thoái hóa giống có thể xảy ra sau nhiều thế hệ nhân giống in vitro. Để hạn chế tình trạng này, cần lựa chọn cây mẹ khỏe mạnh, sử dụng quy trình nuôi cấy chuẩn và định kỳ kiểm tra đánh giá chất lượng cây giống.

III. Cách Tạo Mô Sẹo Đậu Núi In Vitro Hiệu Quả Nhất

Tạo mô sẹo là bước quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính cây đậu núi. Mô sẹo là khối tế bào chưa phân hóa, có khả năng phát sinh hình thái thành các cơ quan khác nhau như chồi và rễ. Việc lựa chọn môi trường tạo sẹo phù hợp, đặc biệt là nồng độ auxin, sẽ quyết định đến chất lượng và số lượng mô sẹo được tạo ra. Nghiên cứu của Huỳnh Thanh Tâm (2017) đã chỉ ra vai trò của auxin trong quá trình tạo mô sẹo cây Sachi.

3.1. Ảnh hưởng của Auxin đến quá trình tạo mô sẹo

Auxin là chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong quá trình tạo mô sẹo. Các loại auxin thường được sử dụng bao gồm 2,4-D, NAA, và IAA. Nồng độ auxin thích hợp sẽ kích thích sự phân chia tế bào và hình thành mô sẹo từ các mẫu cấy.

3.2. Môi trường MS và vai trò trong tạo mô sẹo Đậu Núi

Môi trường MS (Murashige và Skoog) là môi trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Môi trường này cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo. Việc bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng và các chất hữu cơ khác sẽ tối ưu hóa quá trình tạo mô sẹo.

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mô sẹo

Chất lượng mô sẹo phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại mẫu cấy, môi trường nuôi cấy, điều kiện ánh sáng và nhiệt độ. Mô sẹo tốt thường có màu trắng ngà hoặc vàng nhạt, cấu trúc xốp và khả năng phát sinh hình thái cao.

IV. Hướng Dẫn Nhân Nhanh Chồi Đậu Núi In Vitro

Sau khi tạo được mô sẹo, bước tiếp theo là nhân nhanh chồi để tạo ra số lượng lớn cây giống. Quá trình này đòi hỏi sự điều chỉnh tỷ lệ giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Cytokinin, đặc biệt là BA, có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển của chồi từ mô sẹo. Việc theo dõi và điều chỉnh các yếu tố môi trường cũng rất quan trọng để đảm bảo chồi phát triển khỏe mạnh.

4.1. Vai trò của Cytokinin BA trong nhân nhanh chồi

Cytokinin, đặc biệt là BA (6-Benzylaminopurine), là chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong việc kích thích sự phát triển của chồi. Nồng độ BA thích hợp sẽ thúc đẩy sự phân chia tế bào và hình thành chồi từ mô sẹo hoặc từ các đoạn thân, lá.

4.2. Tối ưu hóa môi trường nhân chồi cho cây Đậu Núi

Môi trường nhân chồi cần được bổ sung đầy đủ các chất dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng. Tỷ lệ giữa cytokinin và auxin cần được điều chỉnh để ưu tiên sự phát triển của chồi hơn là rễ. Nước dừa cũng là một thành phần hữu ích, cung cấp các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên.

4.3. Kỹ thuật cấy chuyển và chăm sóc chồi non

Chồi non cần được cấy chuyển định kỳ sang môi trường mới để đảm bảo đủ dinh dưỡng và không gian phát triển. Quá trình cấy chuyển cần được thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh nhiễm bệnh. Chồi non cần được chăm sóc cẩn thận để đảm bảo tỷ lệ sống sót cao.

V. Bí Quyết Tạo Rễ Cây Đậu Núi In Vitro Thành Công

Sau khi nhân được đủ số lượng chồi, bước tiếp theo là tạo rễ để hoàn thiện cây giống. Quá trình này thường sử dụng auxin, đặc biệt là IBA, để kích thích sự phát triển của rễ từ chồi. Môi trường tạo rễ cần được điều chỉnh để giảm nồng độ cytokinin và tăng nồng độ auxin. Việc tạo điều kiện thoáng khí và đủ ẩm cũng rất quan trọng để rễ phát triển khỏe mạnh.

5.1. Sử dụng IBA để kích thích ra rễ cho cây Đậu Núi

IBA (Indole-3-butyric acid) là auxin thường được sử dụng để kích thích sự phát triển của rễ. Nồng độ IBA thích hợp sẽ thúc đẩy sự phân chia tế bào và hình thành rễ từ chồi. Thời gian xử lý IBA cũng cần được điều chỉnh để đạt hiệu quả tốt nhất.

5.2. Môi trường và điều kiện tối ưu cho sự phát triển của rễ

Môi trường tạo rễ cần được điều chỉnh để giảm nồng độ cytokinin và tăng nồng độ auxin. Việc bổ sung thêm các chất dinh dưỡng và vitamin cũng có thể giúp rễ phát triển khỏe mạnh. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ cũng cần được kiểm soát để tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của rễ.

5.3. Chăm sóc cây con sau khi ra rễ

Sau khi ra rễ, cây con cần được chuyển sang môi trường thích nghi để chuẩn bị cho quá trình trồng ra ngoài. Môi trường thích nghi thường là hỗn hợp đất và các chất hữu cơ, được giữ ẩm và thoáng khí. Cây con cần được chăm sóc cẩn thận để đảm bảo tỷ lệ sống sót cao.

VI. Ứng Dụng và Triển Vọng Nhân Giống Đậu Núi In Vitro

Nhân giống in vitro cây đậu núi có nhiều ứng dụng thực tiễn, từ việc cung cấp cây giống cho sản xuất nông nghiệp đến bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Phương pháp này giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về cây giống chất lượng cao, đồng thời góp phần phát triển ngành trồng trọt cây đậu núi tại Việt Nam. Trong tương lai, việc nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình nhân giống in vitro sẽ tiếp tục được đẩy mạnh để nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

6.1. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp và bảo tồn giống

Nhân giống in vitro cung cấp cây giống đồng đều, sạch bệnh cho sản xuất nông nghiệp. Đồng thời, phương pháp này giúp bảo tồn các giống cây quý hiếm, tránh nguy cơ tuyệt chủng.

6.2. Tiềm năng phát triển ngành trồng trọt Đậu Núi tại Việt Nam

Cây Đậu núi có tiềm năng phát triển lớn tại Việt Nam nhờ giá trị kinh tế cao và khả năng thích nghi với nhiều loại đất. Việc áp dụng công nghệ sinh học trong nhân giống sẽ góp phần thúc đẩy sự phát triển của ngành trồng trọt cây đậu núi.

6.3. Hướng nghiên cứu và phát triển trong tương lai

Trong tương lai, cần tập trung nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhân giống in vitro, giảm chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng cây giống. Việc ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến như chuyển gen cũng có thể giúp tạo ra các giống cây đậu núi có năng suất và chất lượng cao hơn.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Cây Đậu núi hay Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L.), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là loài thực vật dây leo bán thân gỗ bản địa của rừng nhiệt đới Amazon (Nam Mỹ). Hạt Sacha Inchi được mệnh danh là "vàng xanh" nhờ giá trị dinh dưỡng vượt trội: hàm lượng lipid chiếm 35% - 60%, protein đạt 27% - 33%, đặc biệt tổng hàm lượng axit béo không bão hòa đạt trên 84%. Trong đó, hàm lượng Omega-3 chiếm tới 48% - 54% (gấp 17 lần dầu cá hồi và 49 lần dầu ô liu), Omega-6 chiếm 35% - 37%, cùng hàm lượng cao vitamin A, vitamin E và iod.

Tại Việt Nam, Sacha Inchi được du nhập từ năm 2012 và nhanh chóng trở thành cây công nghiệp giàu tiềm năng tại các vùng sinh thái như Đắk Lắk, Ninh Bình, Sơn La, Hòa Bình. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng: phân ly di truyền cao, tỷ lệ nảy mầm không đồng đều, nguy cơ tích lũy mầm bệnh virus qua các thế hệ và suy giảm chất lượng dầu. Do đó, việc xây dựng một quy trình vi nhân giống (in vitro micropropagation) và cảm ứng tạo mô sẹo (callus induction) là đòi hỏi cấp thiết nhằm chuẩn hóa nguồn giống thương mại sạch bệnh và bảo tồn nguồn gen ưu việt.

                  QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG SACHA INCHI IN VITRO

Mục tiêu đề tài

1. Xác định quy trình khử trùng bề mặt chồi ngủ ex vitro đạt tỷ lệ sạch bệnh và sống sót tối ưu bằng tổ hợp hóa chất Javel và $Ca(OCl)_2$.
2. Đánh giá và tuyển chọn nền môi trường khoáng cơ bản (basal medium) phù hợp nhất cho sự sinh trưởng chồi in vitro.
3. Xác định nồng độ chất kích thích sinh trưởng nhóm Cytokinin (6-Benzylaminopurine - BA) tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh cụm chồi.
4. Xác định nồng độ và loại Auxin (IAA, NAA, IBA) thích hợp cho quá trình kích thích ra rễ (rhizogenesis) để tạo cây con hoàn chỉnh.
5. Thiết lập quy trình cảm ứng tạo mô sẹo (callus induction) từ mô lá phục vụ nuôi cấy tế bào đơn và huyền phù sinh khối.

Phạm vi và giới hạn nghiên cứu

• Vật liệu: Đoạn thân mang chồi ngủ và mô lá bánh tẻ của cây Sacha Inchi thuần tập tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi kỹ thuật: Đánh giá các thông số hình thái, tốc độ nhân chồi, tỷ lệ tạo rễ và đặc tính mô sẹo trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn ($25 \pm 2^\circ\text{C}$, 2000 - 3000 lux, chu kỳ 8 giờ sáng/ngày).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trước khi quy trình nuôi cấy mô được hoàn thiện, ngành nông nghiệp đối mặt với bài toán tối ưu hóa nguồn giống Sacha Inchi giữa phương pháp nhân giống hạt, giâm cành truyền thống và vi nhân giống in vitro.

Tiêu chí kỹ thuật	Nhân giống bằng hạt (In vivo)	Giâm cành truyền thống	Vi nhân giống In vitro (Đề tài)
Độ đồng nhất di truyền	Thấp (phân ly tính trạng mạnh)	Trung bình (giữ nguyên kiểu gen)	Tuyệt đối (100% bản sao vô tính)
Hệ số nhân giống	1:20 - 1:40/năm	1:5 - 1:10/cây	1:4.36/chu kỳ 4 tuần (cấp số nhân)
Tình trạng sạch bệnh	Dễ nhiễm nấm, virus truyền qua hạt	Dễ mang mầm bệnh từ cây mẹ	Vô trùng hoàn toàn, sạch virus
Chất lượng cây giống	Biến thiên tỷ lệ dầu và protein	Bộ rễ cọc yếu, dễ đổ ngã	Khỏe mạnh, sinh khối chồi và rễ cân đối
Chi phí ban đầu	Thấp	Thấp	Trung bình - cao (tối ưu hóa quy mô)

Yêu cầu kỹ thuật phân theo mô hình MoSCoW:

• Must have: Quy trình khử trùng đạt tỷ lệ sống $\ge 60%$, môi trường nhân chồi đạt hệ số nhân $\ge 3.0$ chồi/mẫu/chu kỳ.
• Should have: Quy trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh với tỷ lệ sống ngoài vườn ươm $\ge 80%$.
• Could have: Cảm ứng mô sẹo đặc chắc (compact callus) có khả năng phát sinh phôi vô tính (embryogenic).
• Won't have: Nuôi cấy bioreactor quy mô công nghiệp trong giai đoạn phòng thí nghiệm này.

Thiết kế hệ thống nuôi cấy và công thức môi trường

Hệ thống nuôi cấy in vitro cây Sacha Inchi được thiết kế đồng bộ với hệ thống trang thiết bị kiểm soát môi trường vật lý nghiêm ngặt:

+---------------------------------------------------------------------------------+
|                        HỆ THỐNG PHÒNG NUÔI CẤY MÔ IN VITRO                      |
+---------------------------------------------------------------------------------+
|  Nhiệt độ: 25 ± 2°C (Điều hòa Dakin)        Độ ẩm không khí: 75% - 80%          |
|  Cường độ sáng: 2000 - 3000 Lux             Quang chu kỳ: 8h sáng / 16h tối     |
|  Khử trùng môi trường: Nồi hấp Autoclave (121°C, áp suất 1.0 atm, 15 phút)      |
+---------------------------------------------------------------------------------+
|      GIAI ĐOẠN NHÂN GIỐNG       |         |      GIAI ĐOẠN TẠO MÔ SẸO       |
| Khoáng: MS (Murashige & Skoog)  |         | Khoáng: MS (Murashige & Skoog)  |
| Đường: Sucrose 30 g/L           |         | Đường: Sucrose 30 g/L           |
| Nước dừa: 100 mL/L (10% v/v)    |         | Nước dừa: 100 mL/L (10% v/v)    |
| Agar: 7.8 g/L (đông gel pH 5.8) |         | Agar: 7.6 g/L (đông gel pH 5.8) |
| Cytokinin: BA 0.1 mg/L          |         | Auxin tạo sẹo: 2,4-D 2.0 mg/L   |
| Auxin ra rễ: IBA 0.1 mg/L       |         | Mẫu cấy: Lá non cắt 0.5 cm²     |

Phương pháp luận (Methodology)

Nghiên cứu áp dụng phương pháp bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design - CRD) với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức, mỗi bình nuôi cấy chứa 3 mẫu (dung tích môi trường 50 mL/bình).

// Mô hình xử lý dữ liệu thống kê sinh học trên SAS 9.1
proc glm data=SachaInchi_TissueCulture;
    class Treatment Replication;
    model ShootNumber ShootHeight LeafNumber RootNumber = Treatment;
    means Treatment / lsd pdiff alpha=0.01;
run;

Toàn bộ dữ liệu thu thập được phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định sự khác biệt giữa các giá trị trung bình nghiệm thức thông qua trắc nghiệm phân hạng LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa thống kê $p < 0.01$ và hệ số biến thiên ($CV%$).

---

Implementation và kết quả

Quy trình triển khai thực nghiệm

      QUY TRÌNH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM KHỬ TRÙNG VÀ TẠO MÔ IN VITRO
1. Tiền xử lý mẫu:
2. Khử trùng 2 bước:
3. Cấy vô mẫu & Tái sinh:
4. Nhân nhanh & Cảm ứng cơ quan:

       CÔNG THỨC MÔI TRƯỜNG CHUẨN CHO TỪNG GIAI ĐOẠN (ĐƠN VỊ: TRÊN 1 LÍT)

Kiểm định và kết quả thực nghiệm chi tiết

1. Khử trùng mẫu ban đầu (Thí nghiệm 1)

Khảo sát ảnh hưởng của $Ca(OCl)_2$ kết hợp với các nồng độ và thời gian xử lý Javel cho thấy: Khử trùng đơn lẻ bằng Javel cho tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn cao, mô bị cháy đen hoại tử, tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt từ 0% đến 3.33%. Việc kết hợp $Ca(OCl)_2$ ($8\text{ g/L}$ trong 20 phút) và dung dịch Javel 50% trong 15 phút mang lại hiệu quả vượt trội.

• Tỷ lệ mẫu vô trùng: $91.67%$ (phân hạng $a$, $CV = 2.09%$).
• Tỷ lệ mẫu tạo chồi: $63.03%$ (phân hạng $a$, $CV = 5.39%$).
• Thời gian bật chồi non: Xuất hiện chồi nách sau 7 ngày nuôi cấy; sau 4 tuần chồi đạt kích thước hoàn chỉnh, không bị tổn thương thứ cấp do hóa chất.

2. Tuyển chọn nền môi trường khoáng cơ bản (Thí nghiệm 2)

So sánh 4 hệ khoáng phổ biến: Murashige & Skoog (MS 1962), Litvay (LV 1985), McCown Woody Plant (WPM 1980) và Gamborg (B5 1968).

So sánh sinh trưởng chồi Sacha Inchi trên các nền khoáng (Sau 4 tuần):
MS   | [██████████████████████████████] 2.56 chồi | 1.39 cm | 4.56 lá
WPM  | [███████████                   ] 0.89 chồi | 1.05 cm | 2.67 lá (phù gốc)
LV   | [████                          ] 0.33 chồi | 0.45 cm | 1.12 lá (vàng lá)
B5   | [███                           ] 0.22 chồi | 0.31 cm | 0.89 lá (chết đỉnh)

Kết quả khẳng định môi trường MS tối ưu tuyệt đối cho loài cây thân leo giàu dinh dưỡng như Sacha Inchi, nhờ nồng độ đạm tổng số ($NO_3^-$ và $NH_4^+$) và cân bằng ion vi lượng cao.

3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi (Thí nghiệm 3)

Nghiệm thức	Nồng độ BA ($\text{mg/L}$)	Số chồi phát sinh (chồi)	Chiều cao chồi ($\text{cm}$)	Số lá phát sinh (lá)	Đặc điểm hình thái
ĐC	0.0	$1.22^c$	$1.15^b$	$2.33^c$	Chồi đơn, thân mảnh
TN1	0.1	$4.367^a$	$1.67^a$	$5.22^a$	Chồi to, lá xanh bóng, không phù gốc
TN2	0.3	$3.89^b$	$1.39^b$	$3.89^b$	Chồi cụm, bắt đầu có vết chai
TN3	0.5	$2.11^c$	$0.85^c$	$2.44^c$	Gốc chồi sưng to, lá biến dạng
TN4	1.0	$0.67^d$	$0.28^d$	$1.12^d$	Phù gốc nặng, đỉnh sinh trưởng chai cứng

Nồng độ BA $0.1\text{ mg/L}$ kích thích phân chia tế bào đỉnh mạnh nhất mà không gây ngộ độc Cytokinin. Khi tăng BA lên $\ge 0.3\text{ mg/L}$, sự kéo dài lóng bị ức chế nghiêm trọng, đồng thời gây tích tụ dịch mô làm gốc bị phù nề (basal callus hypertrophy).

4. Kích thích tạo rễ và cảm ứng mô sẹo (Thí nghiệm 4, 5, 6)

• Tạo rễ hoàn chỉnh: Nền môi trường $\text{MS} + 30\text{ g/L sucrose} + 100\text{ mL/L nước dừa} + 7.8\text{ g/L agar} + 0.1\text{ mg/L BA} + 0.1\text{ mg/L IBA}$ kích thích $100%$ mẫu ra rễ khỏe mạnh, rễ trắng dài trung bình $3.2\text{ cm}$, sẵn sàng thích nghi giá thể ngoài vườn ươm.
• Cảm ứng mô sẹo (Callus): Mảnh lá non kích thước $0.5\text{ cm}^2$ cấy trên nền khoáng $\text{MS} + 2.0\text{ mg/L 2,4-D}$ cho tỷ lệ phát sinh mô sẹo đạt $100%$. Mô sẹo có cấu trúc nốt sần rắn chắc (nodular compact), màu vàng sáng pha xanh, biểu hiện tiềm năng sinh phôi vô tính mạnh mẽ.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Đột phá quy trình khử trùng 2 pha: Khắc phục triệt để hiện tượng hoại tử mô khi khử trùng chồi ngoài đồng ruộng nhờ kết hợp $Ca(OCl)_2$ ($8\text{ g/L}$) và Javel $50%$, nâng tỷ lệ sống sạch bệnh lên $91.67%$ (tăng hơn $88%$ so với phương pháp khử trùng Javel đơn thuần).
2. Tối ưu hóa nồng độ Phytohormone cực thấp: Khác với nhiều quy trình nhân giống cây họ Euphorbiaceae thường đòi hỏi nồng độ BA cao ($1.0 - 2.0\text{ mg/L}$), nghiên cứu này chứng minh chồi Sacha Inchi đáp ứng cực nhạy với BA ở nồng độ chỉ $0.1\text{ mg/L}$, tạo ra $4.367$ chồi/mẫu mà không gây biến dị sưng gốc hoặc thủy tinh thể (vitrification).
3. Chuẩn hóa công thức cảm ứng mô sẹo tế bào: Thiết lập thành công môi trường kích thích mô sẹo từ lá với 2,4-D ($2.0\text{ mg/L}$), tạo nguồn vật liệu ban đầu sạch cho nghiên cứu chuyển gen và nuôi cấy huyền phù sản xuất hoạt chất sinh học Omega-3, Omega-6 in vitro.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

                     KẾ HOẠCH TRIỂN KHAI VÀ NHÂN RỘNG QUY MÔ
Tháng 1-2: Chuẩn hóa mẫu giống đầu dòng sạch bệnh từ vườn thực nghiệm.
Tháng 3-4: Nhân sinh khối in vitro đạt hệ số 1:4.3/chu kỳ trong phòng nuôi cấy.
Tháng 5:   Kích thích ra rễ đồng loạt, huấn luyện cây thích nghi nhà màng.
Tháng 6:   Chuyển cây con sang bầu đất mùn hữu cơ (Tỷ lệ sống >85%).
Tháng 7+:  Cung ứng cây giống tiêu chuẩn cho vùng trồng nguyên liệu công nghiệp.

• Quy mô sản xuất giống công nghiệp: Từ 100 chồi ban đầu, sau 6 chu kỳ cấy chuyền (24 tuần), hệ thống có khả năng sản xuất hơn $630.000$ cây giống sạch bệnh, đồng nhất $100%$ về mặt di truyền.
• Hiệu quả kinh tế dự kiến: Giảm $35%$ giá thành sản xuất cây giống so với nhập khẩu hạt giống từ Peru, rút ngắn thời gian kiến thiết cơ bản của vườn trồng, đưa cây vào giai đoạn thu hoạch quả ổn định sau 7 - 8 tháng trồng.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật: Chưa đánh giá chi tiết tỷ lệ chuyển đổi phôi soma từ mô sẹo thành cây con hoàn chỉnh trên diện rộng; chưa phân tích biến động di truyền ở cấp độ phân tử (chỉ thị RAPD/ISSR) qua nhiều chu kỳ cấy chuyền liên tiếp.
• Hướng phát triển tiếp theo:
  • Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension culture) trong hệ thống Bioreactor khí nâng để thu nhận tinh dầu giàu Omega-3 mà không cần qua canh tác đồng ruộng.
  • Khảo nghiệm đánh giá tính kháng bệnh lở cổ rễ và tuyến trùng của cây giống in vitro tại các vùng đất phèn, đất bazan Tây Nguyên.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên CNSH: Tiếp cận giáo trình thực hành vi nhân giống chuẩn mực, kỹ thuật xử lý số liệu sinh học bằng SAS và phương pháp tối ưu hóa hormone thực vật.
• Doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao: Nhận chuyển giao quy trình công nghệ nhân giống cây Sacha Inchi vô tính đồng nhất, phục vụ dự án chuỗi giá trị chế biến tinh dầu xuất khẩu.
• Nhà nghiên cứu chuyên sâu: Sở hữu cơ sở dữ liệu thực nghiệm về phản ứng hình thái học của chi Plukenetia đối với các nhóm điều hòa sinh trưởng Auxin/Cytokinin.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nồng độ BA cao ($\ge 0.5\text{ mg/L}$) lại làm giảm số lượng và chiều cao chồi Sacha Inchi?
   Trả lời: Cytokinin ở nồng độ cao làm xáo trộn cân bằng hormone nội sinh, gây ức chế kéo dài tế bào lóng, kích thích phân chia vô tổ chức tạo mô chai xốp ở vết cắt đáy chồi, làm cản trở hấp thu nước và khoáng từ môi trường.
2. Nước dừa (10% v/v) đóng vai trò gì trong môi trường nhân giống Sacha Inchi?
   Trả lời: Nước dừa cung cấp nguồn Cytokinin tự nhiên (Diphenylurea), myo-inositol, vitamin B và các amino acid hữu cơ tự nhiên, giúp kích thích sinh trưởng mềm mại và giảm thiểu hiện tượng hóa nâu mô cấy.
3. Mô sẹo thu được từ lá có thể dùng trực tiếp để chiết xuất tinh dầu không?
   Trả lời: Hoàn toàn có thể. Mô sẹo có thể chuyển sang hệ nuôi cấy lỏng lắc để nhân nhanh sinh khối tế bào, sau đó kích thích tích lũy lipid và axit béo thứ cấp bằng các chất khơi mào (elicitors).
4. Cần lưu ý gì khi chuyển cây Sacha Inchi in vitro ra bầu đất vườn ươm?
   Trả lời: Cần mở nắp bình nuôi cấy từ 2 - 3 ngày trước khi ra ngôi, rửa sạch thạch bám ở rễ, trồng trên giá thể tơi xốp (tro trấu, mụn dừa, đất sạch khử trùng) và che lưới đen duy trì độ ẩm $\ge 85%$ trong 10 ngày đầu.

---

Kết luận

Đề tài đã xây dựng thành công quy trình vi nhân giống và cảm ứng mô sẹo cây Đậu núi (Plukenetia volubilis L.) in vitro mang tính ổn định và khả thi cao. Các thông số công nghệ cốt lõi bao gồm: khử trùng bằng $Ca(OCl)_2$ ($8\text{ g/L}$, 20 phút) + Javel $50%$ (15 phút) đạt $91.67%$ mẫu sạch; nhân chồi trên môi trường $\text{MS} + 0.1\text{ mg/L BA} + 100\text{ mL/L nước dừa}$ đạt $4.367$ chồi/mẫu; ra rễ hoàn hảo với $0.1\text{ mg/L IBA}$; và cảm ứng tạo mô sẹo $100%$ trên môi trường $\text{MS} + 2.0\text{ mg/L 2,4-D}$. Kết quả này là nền tảng vững chắc để chuyển giao công nghệ sản xuất giống cây dược liệu - công nghiệp quy mô lớn, góp phần phát triển bền vững chuỗi giá trị nông nghiệp công nghệ cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TÔNG QUAN 1. Giói thiệu cây Đậu núi Giới: Plantae Bộ: Malpighiales (hai lá mầm) Họ: Euphorbiaceae Nhánh: Plukenetieae Chi: Plukenetia Loài: p. Volubilis Tên khoa học: Plukenetia Volubilis L.1: Cày Sachi Tên thông dụng: Cây Đậu núi, đậu Sao, (Plukenetia Voliibilìs L.) đậu La Mát, cây Sachi,. Phân bố sinh thái Nguồn gốc xuất xứ của cây Sachi ở rừng mưa nhiệt đới Amazon, vùng nhiệt đới Nam Mỹ (trên lãnh thổ Suriname, Venezuela, Bolivia, Ecuador, Peru.

Tày bắc Brazil) và một số hoang đảo thuộc vùng Caribbean. Cây Sachi được các dàn tộc bân xứ Peru trồng từ nhiều thế kỷ trước. Peru là một trong mười quốc gia có nhiều vùng khi hậu, nhiều hệ sinh thái khác nhau và có đa dạng sinh học giàu nhất thể giới. Dân Peru từ xa xưa đã sử dụng loại đậu này làm thức ăn và gọi tên là: Sacha inchi (đậu núi), Inca inchi (lạc núi) hoặc Inca nut (lạc Inca) (Nguyền Thị Bích Hồng và ctv, 2015).

Đặc điểm thực vật học Cây Sachi là loại cây lâu năm, rề chùm, phân nhánh ở lớp đất mặt từ 5 - 70 cm là chủ yếu. Thân leo, cao 2 - 3 m, phàn cành cách mặt đất 20 - 30 cm, thân chính và cành bám vào cọc hoặc dàn để leo. Hai lã mầm mọc đối nhau, lá thật mọc cách, phiến lá hình trái tim có răng cưa, bàn lã dài 10 - 12 cm, rộng 8 - 10 cm, cuống lá dài 2 - 6 3 cm. Sau khi trông dược 5 tháng cây bắt dầu ra hoa.

hoa dực nhỏ kết thành chùm màu trang nga mọc ớ nách lá, trục hoa dực dài tư 10- 15 cm tùy vị trí ra hoa khác nhau, trục hoa co hoặc không phân cành. Hoa đực có 4 cánh vả 6 bao phấn nhỏ bằng hạt vưng chưa các hạt phân hình tam giác, số lượng hạt phấn ít lẫn cá phấn bất dục và hữu dục. Tại VỊ trí gân gôc trục hoa đực thường mọc 1 - 2 hoa cái. ờ một số chùm hoa đực còn xuât hiện 1 - 2 hoa lường tính (Nguyễn Thị Bích Hổng vả ctv.

Quả đậu núi hình ngôi sao có 4 - 7 thùy, vỏ màu xanh lã cây. khi chín vỏ quả chuyên từ xanh sang màu nâu xám, treo trên cành. Quả có 3 lớp vò: lớp ngoài mềm, khi chín khô nứt đê lộ lớp vỏ giữa trăng xám, lớp trong củng mãu náu bọc kín nhân. Môi thùy chứa 1 hạt, kích thước hạt rộng 15-20 mm.

dầy ~ - 8 mm, khối lượng trung bình 0,7 - 1 gam/hạt. Tỷ lệ nhân của hạt khô chiếm khoảng 50% khối lượng quà (Nguyễn Thị Bích Hồng và ctv, 2012). Đậu núi thuộc loại cây lâu năm, ưa khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, không kén đất nên có thể trồng trên đất chua phèn, đất phù sa ven sông, phù hợp với điều kiện khí hậu ở nước ta (Nguyễn Thị Bích Hồng và ctv, 2012). Thành phần dinh dưỡng Hạt đậu núi chứa 27% protein, 35 - 60% dầu.

Dầu Sachi là loại dầu chứa hàm lượng Omega cao nhất hiện nay cùng với tỳ- lệ cân bằng của omega 3, 6, 9 và các loại vitamin A, E. Cụ the: Omega 3 (48 - 54%), Omega 6 (35 - 37%), Omega 9 (6 - 9%), Protein (33%). Hàm lượng Omega 3 ơong dầu Sachi cao gấp nhiều lần so các loại dầu khác: gấp 17 lần dầu cá hồi. 40 lần dầu Argan và gấp 49 lần dầu oliu (Nguyễn Thị Bích Hồng và ctv, 2015).

Axit béo Omega - 3 rất cần thiết cho sự tăng trường và phát triển, đặc biệt là trong sự phát triển của mô thần kinh. Omega 6 có tác dụng chống viêm, giàm đau, cân bằng cảm xúc và duy trì sức khỏe da, tóc và mỏng tay. Omega - 3 và omega - 6 tương tác với nhau nên sự cân bằng giữa chúng là rất quan ưọng cho sức khỏe của con người. Omega - 9 được gọi là axit béo không bão hòa đơn và chúng được tìm thấy nhiều nhất trong dầu ô liu.

Dầu ôliu được biềl đển với tác dụng có lợi cho sức khỏe và cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh. Các axil bẽo bão hòa trong dầu Sachi chi cỏ 5,4%. Đây là dầu thực vật lành mạnh nhất đối với sức khỏe con người do chứa hàm lượng 4 cao cua axil béo không bão hòa (84%) nhưng hãm lượng axit béo bão hòa lại rất thấp) (Nguyễn Thị Bích Hồng và ctv, 2015). Tình hình trông trọt cây Sachi ở nước ta Cay Sachi đã được trông ờ Việt Nam 2 năm nay ỡ các địa phương chủ yếu với mục đích thí nghiệm như: Tam Điệp (Ninh Bình), Buôn Ma Thuật (ĐăkLăk), Chiềng Cơi (Sơn La), Lương Sơn (Hòa Bình) và Công ty CP Sachi vina đã liên kết trồng ờ Lào, Campuchia được 3.

Một sô công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 1. Công trình nghiên cứu trong nước Theo Nguyễn Thị Trâm, Nguyễn Thị Bích Hồng. Nguyễn Thế Hùng, Phạm Thị Ngọc Yên, Đoàn Thu Thủy (2015), nghiên cứu vê một sô đặc điém sinh trưởng phát triên và hàm lượng axit béo trong dâu đậu núi (Plukenetia volubilis L.) ưồng tại Gia Lâm, Hà Nội. Công trình nghiên cứu nước ngoài Theo J.

Agric (2002), nghiên cứu tinh chế và đặc tính sinh hóa protein từ Sachi (Plukenetia volubilis L. Guillen, Ruiz, Cabo, Chirinos, Pascual (2003), nghiên cứu về đặc tính dầu của Sacha inchi (Plukenetia voỉubilis L.) bởi quang phổ FTIR và 1H NMR. Theo Luis Felipe Gutierrez, Lina Maria Rosada, Álvaro Jimenez (2011), nghiên cứu về thành phần hóa học của Sacha inchi ỤPlukenetia volubilis). Giói thiệu về nuối cấy invitro 1.

Khái niệm nuôi cấy in vitro Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật ìn vitro trong ống nghiệm để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cay in vivo. Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy thực vật ìn vitro là một trong những lĩnh vực nhân giống vô tính mang lại hiệu quà kinh tê rât cao. Mục đích: Duy trì và nhân nhanh các kiều gen quý hiếm. Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa và cây cành không trồng bằng hạt.

Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt. Nhân nhanh ở điều diện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp 5 VƠI lam sạch bẹnh Virus. Bao quán các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen. Hẹ so nhan nhanh cao.

Có thể nhán giống cấy ưổng với quy mô công nghiẹp, ke ca VƠI cac doi tượng khó nhân giống băng phương pháp thông thường. Cho ra cac ca thê tương đôi vê mặt di truyền. Hạn chê: Không phải bât cứ loại cây nào cũng có thế nhản giống in vitro. De bl bien dị sau nhiêu đời nhân giống in vitro.

Chi phí hơi cao sao với các phương pháp nhân gỉốog vó únh khác nên giá thành không có tính cạnh tranh. Lịch sử nuôi cấy in vitro Năm 1902, Nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thê nhưng ông đã dùng tê bào quá chuyên biệt nén không thành công. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cà rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại ừong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn, mặc dù các nhà khoa học đã chuyển sang môi trường mới.

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trên môi trường thạch cứng. Năm 1939, White và Nobercourt nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White và Nobercourt, 1939). Các kết quà nghiên cửu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988).

Kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hường trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cây và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy (Brown và Thorpe. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai ưò của chất kích thích sinh tnrờng trong nuôi cấy phôi họ cà. Năm 1948, Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt. Skoog va Miller đã nghiên cứu phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi Nam 1955, ngươi ta tìm ra tác dụng kích thích phấn bảo cùa kinetin.

Sau đó, các chat cytokimne khác như BAP, 21P, Zeatin cũng dươc phát hiện. Tư nam 192)4 đên năm 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bảo dơn đã được phát tnen, cac tac gia đã gieo tê bào đơn và nuôi cấy tạo được cáv hoàn chình. Nam 1957, SKoog và Miller công bố kết quà nehièn cứu về tỳ lệ giữa kinetin/auxin đôi với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trẽn câv thuốc lá. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến mòi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiên trong kỳ thuật nuôi cây mô.

Môi trường của họ dã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cây nhiêu loại cây và vẫn còn được sừ dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhản giống vó tính lan bàng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cày nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cay mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa.

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đỏ, nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy.

Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tể bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm 1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá (Trần Văn Minh, 2006). Các giai đoạn nuôi cây in vitro Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như mô phân sinh ngọn, thượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quà non khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormone thích hợp đều cỏ khà nãng tạo mô sẹo.