Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật và các vấn đề liên quan a, Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật * Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng.
Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn không mất đi khả năng phân chia của mình. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Sơ đồ hoá như sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, phân hoá gen. Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh.
Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho các gen được hoạt hoá. Quá trình phân hoá được xảy ra theo một chương trình định sẵn [21]. 4 b, Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. • Các chất điều tiết sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng không thể thiếu trong các quá trình nuôi cấy mô thực vật là các chất thuộc hai nhóm auxin và cytokinin.
Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn [22]. Các chất thuộc nhóm auxin thường được sử dụng là: NAA, IAA và 2,4D. Trong đó, IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ [15].
Mặt khác, một số loài như đậu, cà chua,. có khả năng tạo rễ trong môi trường không có auxin. Còn 2,4D được sử dụng có hiệu quả với mục đích tạo mô sẹo ở thực vật và không dùng trong môi trường tái sinh cơ quan [21]. Các cytokinin thường gặp là kinetin và BAP, cả hai đều có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hoá già của tế bào.
Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym [21]. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của Skoog cho thấy, tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho hình thành rễ, thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi và ở mức cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển của mô sẹo [21]. c, Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống cây bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào • Lựa chọn mẫu cấy Việc lựa chọn mẫu nuôi cấy có ý nghĩa rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu trong suốt quá trình nuôi cấy.
Mẫu non trẻ có sự phản ứng với 5 các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [21]. Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỷ lệ sống càng thấp và các mô có nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách [41]. • Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy mô tế bào có thành phần thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [21]. Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, LS, WP. Ví dụ, môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm.
Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [3]. • Các muối khoáng đa lượng và vi lượng Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ, magiê là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein. - Các nguyên tố khoáng đa lượng: Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là trên 30mg/l.
Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg và Ca. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng. 6 + Nitơ (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR).
Điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi độ pH của môi trường. Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat và ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp. + Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4-2.
Các dạng ion khác như SO3 hoặc SO2 thường kém tác dụng, thậm chí còn độc. + Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao. Phospho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nucleic. Ngoài ra khi phospho ở dạng H2PO4- và HPO4-2 còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy.
- Các nguyên tố vi lượng: Là những nguyên tố được sử dụng ở nông độ thấp hơn 30 ppm. Đó là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co. + Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào.
Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng phức chất với citrat hoặc với ETDA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). + Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự do và DNA tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào. 7 + Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây lên biểu hiện như thừa auxin vì thực chất B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh [3].
• Nguồn cacbon Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu trong bất kỳ môi trường dinh dưỡng nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [20]. Loại đường được sử dụng phổ biến là saccarozơ với hàm lượng từ 2- 6% (W/v). Trong nuôi cấy chồi cây dâu tằm (mulberry bud), môi trường có fructozơ cho kết quả tốt hơn những loại đường khác [21].
• Các vitamin và axit amin Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau. Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino axít. Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và pyridoxune (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô.
• Các chất bổ sung + Dịch nghiền của khoai tây: Có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza, glucose và fructose, amino axít (21 loại bao gồm cả lysine là một axít amin thường không có trong protein thực vật), các muối khoáng (K, Fe, Mg…). Dịch nghiền khoai tây thường được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan và đặc biệt có hiệu quả với một số loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis (Thorpe và cộng sự, 2008). + Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 8 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và các chất làm nền môi trường.
NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính. Than hoạt tính cũng giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì. + Nước dừa: Có tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [39].
Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi. + Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào.