Chương 1.1 Giới thiệu về cây Lan một lá Lan một lá (Nervilia fordii) (Hance) Schltr., tên thường gọi: Lan cờ, Lan một lá, Trân châu trắng… Thuộc chi Nervilia Comm.1 Vị trí phân loại Giới (regnum) Plantae Bộ (ordo) Asparagales Họ (familia) Orchidaceae Chi (genus) Nervilia Loài (species) N.2 Đặc điểm sinh học Thân rất ngắn, củ tròn to, có thể nặng tới 1,5 – 20 g. Thẳng từ củ, chỉ mọc đến có một lá riêng lẻ sau khi hoa tàn. Lá hình tim tròn, xếp theo các gân lá hình chân vịt, đường kính 10 – 25 cm mép uốn lượn. Gân lá toả đều từ cuống lá, cuống lá dài 10 – 20 cm, màu tím hồng.
Cụm hoa có cán dài 20 – 30 cm. Hoa thưa 15 – 20 hoa, mọc thành chùm hay bông màu trắng, đốm tím hồng hay màu vàng hơi xanh lục. Lá đài và cánh hoa giống nhau. Cánh môi 3 thuỳ, có rất nhiều gân, có lông ở quãng giữa, thuỳ bên và thuỳ tận cùng hình ba cạnh, cột dài 6 mm, phồng ở đỉnh.
Ra hoa tháng 3 – 4 – 5, quả nang vào các tháng 4 – 5 – 6. Khi hoa nở, đầu cánh hoa phía trên chụm lại làm toàn hoa giống như chiếc đèn lồng. Quả hình thoi, trên có múi trông giống như quả khế con, dài 2-3cm. Thường sau khi hoa tàn rồi, lá mới phát triển do đó hoặc ta chỉ thấy cây mang hoa, hoặc quả, không có lá, hoặc chỉ thấy cây có lá, thường một lá.
Cây Lan một lá N.2 Thân rễ cây Lan một lá N. fordii Cây được phát hiện mọc ở nhiều vùng tại châu Á: phía đông Saharan Châu phi, bán đảo Đông Nam Á (gồm Myanmar, Thái lan, Việt Nam, Campuchia, Lào và Malasia), vùng Nam Á (như Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản) và một số hòn đảo nhỏ Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương. Ở Việt Nam, lan một lá mọc nhiều vùng ở biên giới Tràng Định, Văn Uyên, Cao Lộc, Đổng mỏ, Hữu Lũng (Lạng sơn), Trùng Khánh, Quảng Uyên (Cao Bằng). Thanh thiên quỳ có ở nhiều vùng núi các tỉnh Lào Cai, Hà Gang, Tuyên Quang, Hà Tây, Hoà Bình, Sơn La, Lai Châu v.3 Thành phần hóa học Trong các loài Lan một lá, cây N.
fordii là cây được nghiên cứu nhiều nhất về thành phần hóa học và dược tính, phần khí sinh của N. fordii chứa khoảng 58 hợp chất trong đó có 24 flavonoid, 10 terpenes cùng những sterols và amino 4 acid. Dịch chiết bằng petroleum ether cho những hợp chất như Cyclohomonervinol, Octacosanoid acid, Stigmasterol, Cyclohomonervilol-(E)- p-hydroxy cinnamate. Dịch chiết bằng ethanol 60 % cho những glycoside loại labdane diterpenoi).
Hợp chất loại flavonoid 8-C- glycoside và triterpenoid cinnamate được cô lập (Li Qiu và cộng sự, 2013). Nước sắc phần khí sinh N. fordii chứa những glycosides loại cycloartane như Nervisides A, B và C (Liu-Bin Wei và cộng sự,2012). Sắc ký trên cột (HPLC) ghi nhận một số flavonoid có trong N.
fordii như rhamnazin, rhamnocitrin, rhamnetin cùng những hợp chất flavonoid liên kết với beta-D-glucopyranoside. Một số glycosides được ghi nhận như 7-O- methylkaemferol và những – quercetin glycosides: nervillifordins từ A-E, hợp chất loại coumarin cũng được ly trích từ phần khí sinh của cây (Li-Wen Tian và cộng sự, 2009).4 Hoạt tính các chất chứa trong Lan một lá Về động dược học của các chất chứa trong Lan một lá: Flavonoids như những chất chuyển hóa loại kaempferol, trong N. fordii có khả năng ức chế sự tái tạo nitric oxide do đại thực bào RAW264.7, kích ứng từ các liopopolysaccharides vi khuẩn ở liều IC50 = 16. Dịch chiết từ N.
fordii bằng petroleum ether và ethyl acetate giúp kéo dài thời gian sống nơi chuột S-180 và H-22 bị gây ung thư bằng cách tăng cường hệ miễn nhiễm. Các cycloartane glycosides từ N. fordii có khả năng diệt các tế bào ung thư (in vitro) thuộc các giòng CNE, Hep-2 và HepG2 (Guang-Xiong Zhou và cộng sự, 2012). Chuột bị gây thương tổn phổi cấp tính bằng nội độc tố (endotoxin induced acute lung injury=ALI) được cho dung dịch chiết N.
fordii ghi nhận dịch chiết có khả năng bảo vệ phổi, chống phù và giúp tạo cân bằng nước, loại nước nơi phổi bằng cách tác động trên các proteins Aquaporin 1 và 5 nơi phổi (Zhang L, và cộng sự, 2011). Các Quercetin-glycosides chiết từ N. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro Lan một lá trên thế giới còn rất ít, tập chung chủ yếu là các công bố của các tác giả Trung Quốc. Do cây Lan một lá mới được phát hiện gần đây nên các nghiên cứu đa phần thiên về tìm hiểu các hợp chất có trong cây và tác dụng của các hợp chất này.5 Công dụng sử dụng trong y học cổ truyển Lan một lá N.
fordii được dùng phổ biến trong Y dược cổ truyền Trung Quốc và Việt Nam. Bộ phận dùng làm thuốc là thân cây, củ và lá. Vị thuốc được xem là có vị ngọt; tính bình có những tác dụng “thanh nhiệt”, nhuận phế, giảm ho, trị đau. Ở Việt Nam lan một lá dùng làm thuốc giải độc, nhất là ngộ độc nấm.
Liều dùng 2 – 3 lá phơi khô thái nhỏ, hãm với nước sôi trong ít phút rồi chiết nước uống. Ngày uống 2 lần. Người ta cũng dùng nó làm thuốc bồi dưỡng cơ thể, thuốc bổ và mát phổi, chữa lao phổi, ho… liều dùng 10-20 lá dưới dạng thuốc sắc, thuốc hãm, hấp đường hoặc chế biến thành cao lỏng để uống. Ngoài ra sử dụng lá tươi giã nát, đắp đến các chỗ đau nhức hoặc đắp mụn nhọt các vết lở.
Ở Trung Quốc, lan một lá được dùng trị: Ho lao phổi, viêm phế quản; Viêm miệng, viêm họng cấp tính, tạng lao; Trẻ em hấp thụ kém và nuôi dưỡng kém; Rối loạn kinh nguyệt; tổn thương ngoài da, viêm mủ da. Liều dùng 10 – 15 g dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu. Dùng ngoài giã củ tươi vừa đủ đắp chỗ đau.2 Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan 1.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống in vitro Lan một lá Trong nước hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về nhân giống in vitro Lan một lá. Trên thế giới, tập trung ở Trung Quốc, các tác giả đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro Lan một lá, đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh chồi, mô sẹo, tạo cây của Lan một lá.
Năm 1990, Chen và cộng sự đã nhân giống in vitro thành công Lan một lá từ củ sử dụng môi trường MS bổ sung thêm BA 2,0 mg/L và NAA 0,2 mg/L. 6 Với nguồn mẫu là cuống lá và lá cây Lan một lá, Pan Xue-feng và cộng sự 2001 đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro cây Lan một lá từ việc tái tạo mô sẹo, tạo dạng precorm, sau đó từ dạng pre-corm tái tạo dạng corm và từ dạng corm tái tạo cây hoàn chỉnh. Lá cây tạo sẹo trên môi trường MS + BA 3,0 mg/L + 2,4D 1,0 mg/L. Sẹo tạo dạng precorm trên môi trường KC + BA 2,5 mg/L + NAA 0,2 mg/L.
Dạng precorm sẽ tạo chồi trên môi trường H + NAA 3,0 mg/L, tăng sinh chồi trực tiếp trên môi trường KC + nước dừa 10% + than hoạt tính 0,1%. Du Qin và cộng sự, 2005 công bố rằng môi trường tái sinh chồi tốt nhất là ½ MS bổ sung BA 2,0 mg/L, môi trường tăng sinh tốt nhất là ½ MS + BA 2,0 mg/L + nước dừa 10% + than hoạt tính 0,1%. Và môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh là ½ MS + BA 2,0 mg/L + NAA 2,0 mg/L. Một nhóm tác giả khác đưa ra quy trình nhân giống In vitro Lan một lá với nguồn mẫu ban đầu là thân củ của Lan một lá.
Qua nghiên cứu các thành phần khoáng, ảnh hưởng của nồng độ đường cũng như các loại đường khác nhau, ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát triển của Lan một lá nhóm tác giả khẳng định môi trường cơ bản MS là môi trường thích hợp nhất cho quá trình tái tạo chồi của Lan một lá. Đường trắng tinh khiết với nồng độ 20 g/L là phù hợp, và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng là BA 1,0 mg/L và NAA 0,01 mg/L. Theo Li ShouLing và cộng sự (2009), đánh giá ảnh hưởng của môi trường của MS có bổ sung thêm BA và NAA đến khả năng tạo chồi của thân rễ và thân củ lan một lá cho thấy đối với thân rễ môi trường MS + BA 2,0 mg/L + NAA 0,1 mg/L + nước dừa 10% có tỉ lệ nảy chồi cao nhất 50%, thân củ có tỉ lệ nảy chồi 40% với môi trường ½ MS + BA 2,0 mg/L + NAA 0,1 mg/L + nước dừa 10%. Mới đây, Lyric và cộng sự công bố quy trình nhân giống In vitro Lan một lá N.
Theo nhóm tác giả, các nguồn mẫu khác nhau đòi hỏi môi trường có chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ bổ sung khác nhau. Với mẫu thân củ, môi trường tái tạo thích hợp nhất là MS + BA 3,0 mg/L + 2,4D 0,1 7 mg/L và môi trường MS + BA 1,0mg/L + NAA 0,5 mg/L + TDZ 0,1 mg/L. Quá trình kéo dài chồi, tăng sinh chồi tối ưu trên môi trường MS + BA 1,0 mg/L + NAA 0,5 mg/L + TDZ 0,1 mg/L. Theo nghiên cứu của Nhóm tác giả về xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây lan một lá (Nervilia fordii) (2016) nhận thấy mẫu củ Lan một lá đã được khử trùng qua môi trường cảm ứng tạo chồi (MS + BA 1,0 mg/L + NAA 0,5 mg/L) hoặc qua môi trường cảm ứng tạo thân rễ (MS + BA 1,0 mg/L).
Nuôi cấy mẫu trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng: 2000 lux. Nhân nhanh cụm thân rễ trong môi trường (MS + BA 1,0 mg/L). Nuôi cấy mẫu trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng: 2000 lux. Nước dừa được sử dụng rộng rãi như một thành phần thúc đẩy tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy mô hơn một nửa thế kỉ trước, khi Overbeek và cộng sự (1941) đầu tiên giới thiệu nước dừa như một thành phần mới của môi trường dinh dưỡng cho các nuôi cấy mô sẹo.
Theo George và cộng sự (2008) thì nước dừa bao gồm nhiều axit amin, hợp chất đạm, hợp chất vô cơ, các axit hữu cơ, nguồn carbon, vitamin và có khả năng điều chỉnh sự phát triển như cytokinin và auxin. Yong và cộng sự (2009) cho thấy nước dừa chứa 94% là nước và là chất thúc đẩy tăng trưởng của chồi. Trong một số loài thực vật, quá trình tái sinh được gia tăng bằng cách bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, nước dừa đã được báo cáo là có khả năng làm tăng quá trình sinh trưởng và phát triển của hoa lan trong ống nghiệm do có sự liên quan đến sự hiện diện của một loại cytokinin.