Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Pasteurella multocida 1. Phân loại vi khuẩn Theo phân loại của Bergey’s (1994) [63], vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae, giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Pasteurella multocida (P.
multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86]. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen. Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P.
multocida có thể thấy khi nhuộm bằng xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45]. Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹ thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể.
Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs (1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P. Môi trường này gồm có 17 thành phần, trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không 5 sinh độc tố như lúc đầu.
(1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM (Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng. Môi trường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm khác, cũng như các loại nấm. Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P. multocida từ gia súc mắc bệnh.
Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của P. multocida là môi trường dextrose-starch agar và casein- sucrose-yeast (CSY). Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sử dụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P. multocida phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môi trường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton, hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129].
multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI. Trong môi trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P. multocida mọc tốt, làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô. Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael và cs, 2002) [112].
Theo Seleim (2005) [150], để vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích tăng trưởng. Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra, 2006) [155].
Hussain và cs (2012) [97] nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn P. multocida trên các nguồn cacbon khác nhau, sử dụng đường glucose, maltose, galactose, sucrose như nguồn carbon để tăng sinh khối tế bào vi khuẩn P. multocida tăng hiệu quả sản xuất vắc xin. Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng Đạt, 1994) [8].
Môi trường này được bổ sung thêm 0,8% sucrose và 2% tụy đệm đã làm tăng hiệu suất phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Phạm Quang Thái, 2004) [43]. Nguyễn Mạnh Thắng và cs (2008) [49] cũng kết luận rằng, môi trường Hottinger thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn P. multocida trong hệ thống lên men kín từng mẻ vắc xin. multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc.
Theo Namioka và Murata (1961) [121], trên môi trường thạch huyết thanh P. multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc: + Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và vi khuẩn có độc lực mạnh. + Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, vi khuẩn có độc lực trung bình. + Khuẩn lạc R (Rough): có rìa xù xì, thường không có dung quang, vi khuẩn có độc lực yếu.
Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu, khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường. Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng. Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán.
Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xung quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng. Khuẩn lạc dạng S có dung quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M không có đặc điểm nói trên. Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P. multocida có liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966) [94].
Theo De Alwis (1999) [86], tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau: + Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent). 7 + Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong.
Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của vi khuẩn P. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P. multocida có tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990) [156]. Rimler (1992) [141] cho rằng, khuẩn lạc của vi khuẩn P.
multocida tập trung ở hai dạng chính. Khuẩn lạc dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc dung quang màu xanh. Dung quang của khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày của vi khuẩn. Vi khuẩn có dung quang sắc cầu vồng đứng riêng hoặc từng đôi, có vỏ nhày và rất độc, thường gây bệnh thể cấp tính.
Vi khuẩn, có dạng khuẩn lạc dung quang màu xanh kém độc hơn, thường gặp ở những đàn gia súc bị dịch địa phương. Đặc tính sinh hóa P. multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose. Dương tính với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase.
Phản ứng urease âm tính, không mọc trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010 [3]; Lê Văn Dương, 2012 [6]). Mitra và cs (2013) [113] cho biết, vi khuẩn P. multocida dương tính với phản ứng Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose, galactose, fructose và mannitol. Azmat và cs (2013) [59] nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn P.
multocida phân lập tại Pakistan cho thấy, vi khuẩn dương tính với oxydase, catalase, sinh Indol. Phản ứng với TSI cũng dương tính, lên men đường xylose, không lên men đường mantose, phản ứng nitrate dương tính, âm tính với phản ứng urease và citrate, vi khuẩn không di động. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. Yếu tố độc lực Kháng nguyên Kháng nguyên P.
multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin. Cho đến 8 nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P.
multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP (outer membrane protein). - Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O.
Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price và Smith (1966) [134] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ. Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide. Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên protein đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố miễn dịch quan trọng.
Vai trò của polysaccharit trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ kém. Theo Bain và cs (1982) [61], những polysaccharide tinh khiết không tạo được sự bảo hộ đối với chuột, thỏ và bò khi thử thách cường độc. Thành phần polysaccharide chính trong kháng nguyên serotype A là axit hyaluronic (Rosner và cs, 1992) [143]. Ngược lại với kháng nguyên serotype A, kháng nguyên polysaccharide serotype B bao gồm arabinose, mannose, đường galactose với những mối liên kết chưa rõ ràng (Boyce và cs, 2000) [67].
- Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P. multocida có kháng nguyên thân là phức hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch.
