Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại hà giang cao bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida và lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Hà Giang, Cao Bằng.

• Tác giả: Phạm Thị Phương Lan
• Người hướng dẫn: PGS.TS. Đặng Xuân Bình
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida
• 1.1.1. Phân loại vi khuẩn
• 1.1.2. Đặc tính sinh hóa
• 1.1.3. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P.
• 1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra
• 1.2.1. Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
• 1.2.2. Cơ chế sinh bệnh
• 1.2.3. Đặc điểm dịch tễ học
• 1.2.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
• 1.3. Phòng và trị bệnh tụ huyết trùng
• 1.3.1. Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng
• 1.3.1.1. Trên thế giới
• 1.4. Một số kết luận qua phân tích tổng quan
• 2. Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nguyên vật liệu
• 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng
• 2.2.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 2.2.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
• 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu
• 2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn P.
• 2.3.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của P.
• 2.3.5. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng bằng kỹ thuật PCR
• 2.3.6. Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng
• 2.3.7. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng đối với chuột nhắt trắng (Carter và cs, 1995) [77]
• 2.3.8. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được (Nguyễn Thanh Hà, 1991) [10]
• 2.3.9. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin
• 2.3.9.1. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò trước khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA (Indirect Haemaglunation Test)
• 2.3.9.2. Phương pháp xác định hiệu lực bảo hộ đối với trâu, bò trước và sau khi tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng (Bain và cs, 1982) [61]
• 2.3.9.3. Phương pháp đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình (Lê văn Tạo, Dương thế Long, 1996) [42]
• 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng từ năm 2011 - 2015
• 3.1.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng tại tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ trong năm tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.4. Mức độ dịch và hệ số năm dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.5. Thời điểm phát dịch, mùa dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 3.2.1. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng
• 3.2.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P. mutocida phân lập được
• 3.2.4. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản ứng PCR
• 3.2.5. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 3.2.6. Xác định LD50 của vi khuẩn P.
• 3.2.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược
• 3.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng
• 3.3.1. Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin trong vùng thường xuyên xảy ra dịch tụ huyết trùng địa phương
• 3.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng chủng P52 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp
• 3.3.3. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò được tiêm phòng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nghiên cứu yếu tố gây bệnh Pasteurella Multocida

Pasteurella Multocida là vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò, một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Nghiên cứu tập trung vào việc xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này, bao gồm đặc tính sinh hóa, cơ chế sinh bệnh và dịch tễ học. Hà Giang và Cao Bằng là hai tỉnh được chọn làm địa bàn nghiên cứu do tình hình dịch bệnh phức tạp. Kết quả cho thấy, vi khuẩn Pasteurella Multocida có khả năng gây bệnh cao với các triệu chứng lâm sàng rõ rệt như sốt cao, xuất huyết và tử vong nhanh.

1.1. Đặc tính sinh hóa và cơ chế sinh bệnh

Vi khuẩn Pasteurella Multocida có hình que, Gram âm, kích thước nhỏ. Nghiên cứu xác định các đặc tính sinh hóa như khả năng lên men đường và phản ứng sinh Indol. Cơ chế sinh bệnh liên quan đến độc tố DNT (Dermonecrotic toxin), gây hoại tử mô và xuất huyết. Các yếu tố độc lực như protein màng ngoài (OMP) và khả năng kháng kháng sinh cũng được phân tích.

1.2. Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng

Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Hà Giang và Cao Bằng được nghiên cứu từ năm 2011 đến 2015. Kết quả cho thấy tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao, đặc biệt vào mùa Đông-Xuân. Các yếu tố như điều kiện thời tiết, tập quán chăn nuôi và hiệu quả tiêm phòng vắc xin ảnh hưởng đến sự lưu hành của bệnh.

II. Lựa chọn vắc xin phòng tụ huyết trùng

Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của hai loại vắc xin phòng tụ huyết trùng: vắc xin dạng keo phèn và nhũ dầu. Kết quả cho thấy cả hai loại vắc xin đều có khả năng tạo miễn dịch bảo hộ cao cho trâu bò. Tuy nhiên, vắc xin nhũ dầu có thời gian bảo hộ dài hơn, đạt hiệu quả tối ưu trong việc kiểm soát dịch bệnh tại Hà Giang và Cao Bằng.

2.1. Đánh giá hiệu lực vắc xin

Hiệu lực của vắc xin được đánh giá thông qua phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột nhắt trắng. Kết quả cho thấy, vắc xin nhũ dầu đạt hiệu giá kháng thể cao hơn so với vắc xin keo phèn. Thời gian bảo hộ của vắc xin nhũ dầu kéo dài đến 12 tháng, trong khi vắc xin keo phèn chỉ đạt 6 tháng.

2.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đề xuất sử dụng vắc xin nhũ dầu để phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Hà Giang và Cao Bằng. Điều này giúp nâng cao hiệu quả phòng bệnh, giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong, đồng thời hỗ trợ phát triển bền vững ngành chăn nuôi gia súc tại khu vực miền núi phía Bắc.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học quan trọng về đặc điểm dịch tễ, yếu tố gây bệnh và hiệu lực của vắc xin phòng tụ huyết trùng. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao, giúp cải thiện công tác phòng chống dịch bệnh, nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu bò tại Hà Giang và Cao Bằng.

3.1. Đóng góp khoa học

Nghiên cứu bổ sung tư liệu về serotype kháng nguyên và yếu tố độc lực của Pasteurella Multocida. Đây là cơ sở để phát triển các loại vắc xin hiệu quả hơn, phù hợp với điều kiện địa phương.

3.2. Ứng dụng trong chăn nuôi

Kết quả nghiên cứu giúp các cơ quan thú y và người chăn nuôi lựa chọn vắc xin phù hợp, nâng cao tỷ lệ tiêm phòng và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Điều này góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi gia súc tại khu vực miền núi phía Bắc.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh tụ huyết trùng (Haemorrhagic Septicaemia - HS) do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trên đàn gia súc, đặc biệt là trâu, bò tại Việt Nam và trên thế giới. Theo thống kê của Cục Thống kê (2015), đàn trâu cả nước đạt 2,5 triệu con và đàn bò đạt 5,4 triệu con (trong đó bò sữa đạt 275,3 nghìn con). Báo cáo dịch tễ học của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ghi nhận trong các năm 2014 và 2015, bệnh tụ huyết trùng xuất hiện tại 26 tỉnh, thành phố với hàng nghìn cá thể trâu, bò mắc bệnh mỗi năm (năm 2014 có 7.682 ca mắc).

Tại khu vực miền núi phía Bắc, hai tỉnh Hà Giang (tổng đàn trâu, bò trên 265.000 con) và Cao Bằng (tổng đàn trên 228.000 con) có địa hình rừng núi hiểm trở và tập quán chăn thả tự do, tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh lưu hành và bùng phát. Số liệu từ các Chi cục Thú y địa phương và nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010) cho thấy năm 2008, Hà Giang có 276 trâu và 157 bò chết; Cao Bằng có 455 trâu, bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu, bò chết do tụ huyết trùng. Mặc dù công tác tiêm phòng được triển khai định kỳ 2 lần/năm, nhưng do điều kiện địa lý phức tạp và tỷ lệ tiêm đủ 2 mũi đạt thấp, dịch bệnh vẫn thường xuyên tái phát. Khoảng trống nghiên cứu thực tiễn đặt ra là cần xác định rõ đặc điểm dịch tễ, tình trạng mang trùng, các đặc tính sinh vật học, serotype và yếu tố độc lực của các chủng P. multocida thực địa, đồng thời đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng thực địa với chủng sản xuất vắc xin nhằm lựa chọn loại vắc xin có hiệu lực bảo hộ cao và kéo dài.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

1. Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng và tình trạng mang trùng vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng.
2. Xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học và yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò trên thực địa.
3. Đánh giá mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được, từ đó đề xuất giải pháp, lựa chọn vắc xin phòng bệnh hiệu quả.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Trâu, bò khỏe mạnh; trâu, bò nghi mắc hoặc chết do bệnh tụ huyết trùng; các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ thực địa; động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng); vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng vô hoạt chủng P52 dạng keo phèn và dạng nhũ dầu.
• Phạm vi không gian: Địa bàn chăn nuôi trâu, bò thuộc hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng.
• Phạm vi thời gian: Thu thập và phân tích dữ liệu dịch tễ học giai đoạn 2011 - 2015; các thực nghiệm phân lập vi sinh, xác định độc lực, giám định phân tử và kiểm tra đáp ứng miễn dịch bảo hộ được hoàn thành đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về vi khuẩn Pasteurella multocida, bệnh tụ huyết trùng và các giải pháp vắc xin phòng trị:

• Đặc tính sinh học và phân loại vi khuẩn: Bergey (1994) xếp P. multocida thuộc chi Pasteurella, họ Parvobacteriaceae. De Alwis (1999) và Nguyễn Như Thanh và cs (2001) mô tả hình thái cầu trực khuẩn gram âm, bắt màu lưỡng cực khi nhuộm Giemsa hoặc xanh methylen. Namioka và Murata (1961), Heddleston (1966), Rimler (1992) phân loại hình thái và dung quang khuẩn lạc trên môi trường thạch huyết thanh thành dạng S (Smooth - độc lực cao, huỳnh quang xanh lơ hoặc sắc cầu vồng Fg), dạng M (Mucoid - độc lực trung bình Fo) và dạng R (Rough - độc lực yếu Nt).
• Cấu trúc kháng nguyên và độc lực: Carter (1955, 1961, 1963) định type kháng nguyên vỏ thành các nhóm A, B, D, E, F bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA). Namioka và Murata (1961, 1964), Heddleston và cs (1972) định type kháng nguyên thân thành 16 type (1 - 16) bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch (AGPT). Hệ thống kết hợp Carter - Heddleston xác định các chủng gây thể bại huyết, xuất huyết ở trâu, bò tại châu Á là serotype B:2 và châu Phi là E:2 (De Alwis, 1999). Các yếu tố độc lực gồm giáp mô (Carter, 1967; Wilson và cs, 1992; Boyce và cs, 2000), nội độc tố Lipopolysaccharide (Lax và Thomas, 2002; Horadagoda và cs, 2001), ngoại độc tố DNT mã hóa bởi gen toxA dài 4.381 bp (Hunt và cs, 2000; Seleim, 2005) và các protein màng ngoài OMP như OmpA, OmpH, Cp39, PlpE (Davies và cs, 2003; Sthitmatee và cs, 2008; Wu và cs, 2007; Okay và cs, 2012).
• Đặc điểm dịch tễ và tình trạng mang trùng: Benkirane và De Alwis (2002) chỉ ra serotype B:2 và E:2 phổ biến nhất ở trâu, bò. Annas và cs (2014) chứng minh vi khuẩn khu trú tại amidan của trâu sau dịch và bài xuất qua đường hô hấp. Tỷ lệ mang trùng ở gia súc khỏe mạnh được ghi nhận tại nhiều quốc gia: Malaysia (Saharee và cs, 1993), Sri Lanka (Wijewardana và cs, 1993; De Alwis, 1986), Iran (Jalal và cs, 2010; Muhammad và cs, 2006), Pakistan (Muhammad Imran và cs, 2007). Tại Việt Nam, tỷ lệ mang trùng ở trâu, bò khỏe được công bố bởi Nguyễn Thiên Thu (1996) ở miền Trung - Tây Nguyên (4,47%), Cao Văn Hồng (2001) ở Đắk Lắk (14,79%), Nguyễn Đình Trọng (2002) ở Bắc Kạn (57,52%), Hoàng Đăng Huyến (2004) ở Bắc Giang (22,5%) và Đặng Xuân Bình và cs (2010) tại Hà Giang, Cao Bằng (9,6% - 14,2%). Về tính mẫn cảm loài, De Alwis (1984), Robertson (1999), Farooq và cs (2007, 2011) và Joyjit và cs (2013) khẳng định trâu mẫn cảm hơn bò, lứa tuổi mắc bệnh nặng nhất từ 6 đến 18 tháng tuổi (Ahrar và cs, 2011).
• Chẩn đoán phân tử và phòng trị: Townsend và cs (1998, 2001) thiết lập các cặp mồi PCR đặc hiệu như KTSP61 - KTT72 và CAP-B để định type giáp mô B. Tại Việt Nam, Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2003, 2007), Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007), Cù Hữu Phú và cs (2013), Lê Văn Dương (2013) đã ứng dụng kỹ thuật PCR và REP-PCR để giám định nhanh serotype B và A. Về vắc xin, các nghiên cứu của De Alwis (1984), Muneer và cs (1994), Sheikh và cs (1995), Reddy và cs (1996), Sarwar và cs (2015) và Trần Xuân Hạnh và cs (2009) đã so sánh miễn dịch giữa vắc xin keo phèn (bảo hộ 4 - 6 tháng) và vắc xin nhũ dầu (bảo hộ 9 - 12 tháng).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Đánh giá một cách toàn diện đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trên cả hai đối tượng trâu và bò tại địa bàn vùng cao Hà Giang và Cao Bằng; phân lập, giám định serotype bằng kỹ thuật PCR, xác định độc lực và tính kháng thuốc của các chủng P. multocida thực địa; đồng thời kiểm chứng thực nghiệm sự đáp ứng miễn dịch và thời gian bảo hộ thực tế của vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu chủng P52 so với vắc xin keo phèn chủng P52 trên đàn gia súc địa phương.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên lý thuyết dịch tễ học thú y truyền nhiễm, vi sinh vật học chẩn đoán và miễn dịch học thực nghiệm:

Nhóm nội dung	Phương pháp / Kỹ thuật áp dụng	Nguồn tư liệu / Công cụ thực hiện
Dịch tễ học	Phương pháp hồi cứu số liệu dịch tễ, điều tra dịch tễ học mô tả; tính tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong, hệ số năm dịch (HSND), hệ số tháng dịch (HSTD), nguy cơ tương đối (RR).	Số liệu báo cáo định kỳ 2011 - 2015 từ Chi cục Thú y tỉnh Hà Giang và Chi cục Thú y tỉnh Cao Bằng; phiếu điều tra nông hộ.
Lấy mẫu & Phân lập vi khuẩn	Thu thập dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và mẫu bệnh phẩm (máu tim, gan, lách, tủy xương, dịch phù) từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh; cấy gạt, cấy ria trên môi trường chọn lọc và vận chuyển TEM.	Môi trường BHI (Brain Heart Infusion), thạch máu cừu 5%, thạch CSY (Casein-sucrose-yeast), môi trường Hottinger.
Giám định sinh vật, hóa học	Nhuộm gram, nhuộm Giemsa, soi kính hiển vi quang học xác định hình thái bắt màu lưỡng cực; kiểm tra dung quang khuẩn lạc góc 45°; thử tính chất sinh hóa (Indol, Oxidase, Catalase, TSI, phản ứng lên men các loại đường).	Kính hiển vi quang học hai thị kính, các loại đường (Glucose, Mannitol, Saccarose, Arabinose, Maltose, Lactose...), hóa chất thử Indol, Oxidase, Catalase.
Giám định sinh học phân tử (PCR)	Chiết tách DNA vi khuẩn, thực hiện phản ứng nhân gen PCR với các cặp mồi đặc hiệu để định type giáp mô (serotype B). Điện di trên gel agarose, đọc kết quả dưới đèn soi gel.	Cặp mồi đặc hiệu serotype B (CAP-B, KTSP61 - KTT72, HSB), máy luân nhiệt PCR, hệ thống điện di và chụp ảnh gel.
Thử nghiệm độc lực & Kháng sinh đồ	Thử độc lực qua đường tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng (Carter và cs, 1995); xác định liều gây chết 50% ($LD_{50}$); thử kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên thạch theo tiêu chuẩn NCCLS (2014).	Chuột nhắt trắng khỏe mạnh (trọng lượng 18 - 20g); các đĩa kháng sinh chuẩn (Ampicillin, Streptomycin, Gentamycin, Enrofloxacin, Ceftiofur, Tetracycline, Neomycin...).
Đánh giá đáp ứng miễn dịch & Hiệu lực bảo hộ	Đo hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA - Indirect Haemagglutination Test); xác định hiệu lực bảo hộ bằng phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột nhắt trắng (PMPT - Passive Mouse Protection Test) theo Bain và cs (1982) và Lê Văn Tạo, Dương Thế Long (1996).	Mẫu huyết thanh trâu, bò trước và sau tiêm vắc xin (1, 3, 6, 9, 12 tháng); chủng vi khuẩn cường độc phân lập thực địa; chuột nhắt trắng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương này tổng quan toàn diện các cơ sở lý luận và tài liệu khoa học liên quan đến đề tài:

• Phân loại học, đặc điểm hình thái, kích thước ($0,25 - 0,4 \times 0,4 - 1,5\ \mu\text{m}$), tính chất nuôi cấy và các dạng khuẩn lạc (S, M, R) của Pasteurella multocida.
• Cơ chế sinh bệnh học thể nhiễm trùng huyết xuất huyết (HS), đặc điểm lâm sàng (sốt cao $41 - 42\ ^\circ\text{C}$, phù nề vùng hầu họng "trâu hai lưỡi", khó thở, xuất huyết phủ tạng) và bệnh tích đại thể, vi thể.
• Phân tích chi tiết các hệ thống phân loại serotype lịch sử và hiện đại:

Tác giả	Phản ứng sử dụng	Phân loại
Phân loại theo giáp mô (kháng nguyên vỏ):
Carter (1955)	Ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA)	Type A, B, C, D
Carter (1961)	IHA	Type E
Carter (1963)	IHA và PMPT	Bỏ type C
Namioka và Murata (1961)	Ngưng kết trên phiến kính	Type A, B, C, D
Rimler và Rhoades (1987)	IHA	Type F
Phân loại theo kháng nguyên thân:
Namioka và Murata (1961)	Ngưng kết tế bào đã xử lý HCl	Type 1 - 11
Namioka và Bruner (1963)	AGPT (kết tủa khuếch tán trên thạch)	Type 1 - 16
Namioka và Murata (1964)	AGPT	Type 1 - 16
Heddleston và cs (1972)	AGPT	Type 1 - 16

(Nguồn: Tổng hợp từ De Alwis, 1999 [86])

• Tổng quan các phương pháp chẩn đoán: chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán vi khuẩn học truyền thống, chẩn đoán huyết thanh học (IHA, AGPT, ELISA), phương pháp miễn dịch bệnh lý và các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, REP-PCR).
• Các loại vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng: vắc xin vô hoạt keo phèn, vắc xin vô hoạt nhũ dầu (Marcol 52, Montanide ISA 50, Montanide ISA 70), vắc xin nhược độc và các hướng nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp (OmpH, PlpE, rCp39, FhaB2).

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày chi tiết thiết kế thí nghiệm, nguyên vật liệu, địa điểm và các quy trình kỹ thuật được áp dụng trong nghiên cứu:

• Thiết kế nghiên cứu dịch tễ học hồi cứu từ năm 2011 đến năm 2015 tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng.
• Quy trình lấy mẫu dịch ngoáy mũi ở trâu, bò khỏe mạnh và lấy mẫu phủ tạng (tim, gan, lách, tủy xương) từ trâu, bò ốm, chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng.
• Quy trình nuôi cấy, phân lập và làm thuần vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc; quy trình nhuộm gram, Giemsa và kiểm tra dung quang khuẩn lạc dưới ánh sáng phản xạ 45°.
• Bố trí phản ứng sinh hóa xác định khả năng lên men các loại đường và các enzyme đặc trưng.
• Thiết kế phản ứng PCR xác định serotype B với hệ thống cặp mồi đặc hiệu, chu trình nhiệt và phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR.
• Phương pháp xác định độc lực trên chuột nhắt trắng và tính toán $LD_{50}$. Phương pháp kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán theo chuẩn NCCLS (2014).
• Phương pháp bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu giá kháng thể (IHA) và tỷ lệ bảo hộ trung bình bằng phản ứng bảo hộ thụ động trên chuột nhắt trắng (PMPT) đối với huyết thanh trâu, bò tiêm vắc xin keo phèn P52 (theo dõi 1, 3, 6 tháng) và vắc xin nhũ dầu P52 (theo dõi 1, 3, 6, 9, 12 tháng).

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và phân tích số liệu đạt được:

• Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng (2011 - 2015): Phân tích tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong do tụ huyết trùng trên tổng đàn; so sánh mức độ mẫn cảm giữa loài trâu và bò; xác định tính mùa vụ rõ rệt của dịch bệnh (tập trung vào các tháng mưa nhiều, chuyển mùa Đông - Xuân và Hè - Thu); tính toán hệ số năm dịch (HSND) và hệ số tháng dịch (HSTD) tại các huyện thuộc 2 tỉnh.
• Kết quả phân lập và giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn P. multocida: Xác định tỷ lệ mang trùng trong dịch ngoáy mũi của trâu, bò khỏe mạnh; tỷ lệ phân lập thành công vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh. Các chủng phân lập có hình thái cầu trực khuẩn ngắn, bắt màu gram âm, bắt màu lưỡng cực đặc trưng; khuẩn lạc có dung quang huỳnh quang xanh lơ hoặc sắc cầu vồng trên thạch huyết thanh.
• Đặc tính sinh hóa: 100% các chủng P. multocida phân lập được dương tính với phản ứng Indol, Oxidase, Catalase; lên men sinh axit không sinh hơi các đường Glucose, Saccarose, Mannitol, Fructose, Galactose; không lên men Lactose, Maltose, Arabinose; âm tính với Urease và Citrate, không mọc trên môi trường MacConkey.
• Xác định serotype bằng kỹ thuật PCR: Sản phẩm khuếch đại gen với các cặp mồi đặc hiệu khẳng định các chủng P. multocida phân lập từ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng đều thuộc serotype B.
• Độc lực và tính mẫn cảm kháng sinh: Các chủng phân lập thể hiện độc lực cao khi thử nghiệm trên chuột nhắt trắng, gây chết chuột trong vòng 24 - 48 giờ; xác định giá trị $LD_{50}$ của các chủng đại diện (như chủng HGXB5 tại Hà Giang, CBPT7 tại Cao Bằng). Kết quả kháng sinh đồ chỉ ra mức độ nhạy cảm cao của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (như Ceftiofur, Enrofloxacin, Florfenicol, Gentamycin) và ghi nhận sự đề kháng đối với một số kháng sinh thông thường (như Penicillin, Streptomycin, Tetracycline).
• Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu:
  • Khảo sát miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa tiêm phòng tại vùng ổ dịch cũ.
  • Đánh giá hiệu giá kháng thể (GMT) qua phản ứng IHA tại các thời điểm 1, 3, 6, 9, 12 tháng sau tiêm vắc xin.
  • Đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình qua thử nghiệm PMPT trên chuột nhắt trắng khi công cường độc bằng chủng P. multocida thực địa phân lập được. Kết quả chứng minh vắc xin nhũ dầu chủng P52 tạo miễn dịch bảo hộ kéo dài 9 đến 12 tháng, vượt trội so với vắc xin keo phèn chủng P52 (chỉ duy trì bảo hộ tốt trong 4 đến 6 tháng).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

• Cung cấp hệ thống dữ liệu khoa học cập nhật và chuẩn xác về đặc điểm dịch tễ học, sự lưu hành, tỷ lệ mang trùng ở gia súc khỏe mạnh và quy luật phát sinh bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại hai tỉnh miền núi biên giới phía Bắc (Hà Giang và Cao Bằng).
• Xác định được đầy đủ các đặc tính sinh vật học, sinh hóa học, độc lực ($LD_{50}$) và khẳng định serotype giáp mô của các chủng Pasteurella multocida gây bệnh thực địa tại địa bàn nghiên cứu đều thuộc serotype B bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR.
• Chứng minh thực nghiệm sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng P. multocida cường độc phân lập tại thực địa với chủng vi khuẩn giống P52 đang được sử dụng để sản xuất vắc xin tụ huyết trùng thương phẩm tại Việt Nam.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Việc xác định tỷ lệ mang trùng ở trâu, bò khỏe mạnh giúp cơ quan quản lý thú y giải thích nguồn gốc các ổ dịch phát sinh tại chỗ khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi hoặc thời tiết chuyển mùa.
• Đánh giá so sánh trực tiếp hiệu lực bảo hộ giữa hai dạng vắc xin: vắc xin vô hoạt nhũ dầu chủng P52 có khả năng duy trì kháng thể và tỷ lệ bảo hộ cao kéo dài từ 9 đến 12 tháng sau khi tiêm, trong khi vắc xin keo phèn suy giảm miễn dịch rõ rệt sau 6 tháng.
• Cung cấp cơ sở thực tiễn để cơ quan thú y và người chăn nuôi tại Hà Giang, Cao Bằng và các tỉnh miền núi phía Bắc chuyển đổi cơ cấu sử dụng vắc xin, thay thế vắc xin keo phèn (phải tiêm 2 lần/năm) bằng vắc xin nhũ dầu (chỉ cần tiêm 1 lần/năm), nâng cao tỷ lệ đàn được bảo hộ miễn dịch và giảm chi phí tổ chức tiêm phòng.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đưa vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò nhũ dầu chủng P52 vào chương trình tiêm phòng định kỳ hàng năm tại các địa phương miền núi phía Bắc, thực hiện tiêm phòng trước các thời điểm chuyển mùa có nguy cơ dịch cao.
• Áp dụng kết quả kháng sinh đồ của đề tài để lựa chọn kháng sinh nhạy cảm đặc hiệu (như Ceftiofur, Enrofloxacin) trong phác đồ điều trị sớm các ca bệnh tụ huyết trùng.
• Tăng cường kiểm dịch vận chuyển động vật, kết hợp vệ sinh tiêu độc chuồng trại định kỳ bằng vôi bột hoặc hóa chất sát trùng tại các vùng ổ dịch cũ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Phạm vi nghiên cứu thực địa giới hạn tại hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng, tập trung chủ yếu vào đối tượng trâu và bò; các chủng phân lập nghiên cứu sâu về serotype vỏ tập trung ở nhóm gây thể bại huyết, xuất huyết (serotype B).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng nghiên cứu dịch tễ học phân tử và định type các chủng P. multocida trên các loài gia súc khác (như lợn, gia cầm) tại toàn bộ khu vực miền núi phía Bắc; giải trình tự toàn bộ hệ gen hoặc phân tích chi tiết các gen quy định protein màng ngoài (OMP) và các yếu tố độc lực của các chủng thực địa nhằm phục vụ công tác giám sát biến chủng và nghiên cứu phát triển các thế hệ vắc xin tái tổ hợp trong tương lai.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên ngành Thú y, Vi sinh vật học, Bệnh truyền nhiễm thú y: Tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa dịch tễ học mô tả, vi sinh vật học truyền thống, sinh học phân tử (PCR định type) và kỹ thuật đánh giá đáp ứng miễn dịch bảo hộ trên động vật thí nghiệm (PMPT, IHA).
• Giảng viên và các nhà khoa học tại các viện, trường đại học khối nông lâm nghiệp: Sử dụng dữ liệu về đặc tính sinh vật hóa học, độc lực vi khuẩn P. multocida và hiệu lực vắc xin nhũ dầu làm tài liệu giảng dạy chuyên môn và định hướng đề tài nghiên cứu tiếp theo.
• Cán bộ quản lý dịch tễ tại Cục Thú y, Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh miền núi phía Bắc: Ứng dụng số liệu dịch tễ mùa vụ, hệ số năm dịch, tháng dịch và kết quả so sánh vắc xin để xây dựng kế hoạch tiêm phòng vắc xin nhũ dầu định kỳ hàng năm, nâng cao hiệu quả phòng chống dịch tụ huyết trùng trâu, bò tại địa phương.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ các ổ dịch tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng thuộc serotype nào?

Các kết quả phân lập từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc hoặc chết do bệnh tụ huyết trùng tại thực địa Hà Giang và Cao Bằng, sau khi giám định bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (như CAP-B), đều được xác định thuộc serotype giáp mô B (phù hợp với nhóm gây thể bại huyết, xuất huyết ở trâu, bò tại châu Á).

2. Tỷ lệ trâu, bò khỏe mang trùng vi khuẩn P. multocida tại vùng nghiên cứu có ý nghĩa dịch tễ học như thế nào?

Vi khuẩn P. multocida được phân lập từ dịch ngoáy mũi của một tỷ lệ trâu, bò hoàn toàn khỏe mạnh tại các địa phương nghiên cứu. Tình trạng mang trùng thể ẩn này đóng vai trò là nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng tại chỗ; khi gặp điều kiện thời tiết thay đổi đột ngột hoặc sức đề kháng gia súc suy giảm, vi khuẩn sẽ tăng sinh độc lực và phát tán mầm bệnh làm bùng phát dịch tụ huyết trùng.

3. Phản ứng sinh vật, hóa học đặc trưng của các chủng P. multocida phân lập được trong luận án là gì?

Tất cả các chủng phân lập được đều là cầu trực khuẩn gram âm, bắt màu lưỡng cực khi nhuộm Giemsa; phản ứng Indol (+), Oxidase (+), Catalase (+); lên men không sinh hơi các đường Glucose, Saccarose, Mannitol, Fructose, Galactose; không lên men Lactose, Maltose, Arabinose; âm tính với phản ứng Urease, Citrate và không mọc trên môi trường MacConkey.

4. Luận án đã đánh giá hiệu lực và độ dài miễn dịch của vắc xin tụ huyết trùng keo phèn và nhũ dầu chủng P52 bằng những phương pháp nào?

Luận án sử dụng hai phương pháp thực nghiệm chính: xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia súc qua phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và xác định tỷ lệ bảo hộ trung bình qua phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột nhắt trắng (PMPT) khi công cường độc bằng chủng P. multocida phân lập từ thực địa tại các mốc thời gian sau khi tiêm vắc xin (1, 3, 6, 9, 12 tháng).

5. Kết quả so sánh thời gian bảo hộ giữa vắc xin keo phèn và vắc xin nhũ dầu chủng P52 dẫn đến khuyến cáo thực tiễn gì?

Vắc xin keo phèn chủng P52 chỉ duy trì hiệu lực bảo hộ tốt trong khoảng 4 - 6 tháng, đòi hỏi phải tiêm nhắc lại 2 lần/năm (điều này khó thực hiện triệt để ở vùng núi cao). Trong khi đó, vắc xin nhũ dầu chủng P52 duy trì hiệu giá kháng thể và tỷ lệ bảo hộ cao từ 9 đến 12 tháng, do đó luận án khuyến cáo chuyển đổi sang sử dụng vắc xin nhũ dầu để chỉ cần tiêm phòng 1 lần/năm mà vẫn đảm bảo an toàn dịch bệnh cho đàn trâu, bò.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Thị Phương Lan đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xác định đặc điểm dịch tễ, tình trạng mang trùng, các đặc tính sinh vật hóa học và serotype B của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trên đàn trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng. Bằng các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, sinh học phân tử và huyết thanh học thực nghiệm chuẩn xác, công trình đã chứng minh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng vi khuẩn cường độc thực địa với chủng sản xuất vắc xin P52 thương phẩm. Kết quả thực nghiệm khẳng định ưu thế vượt trội về độ dài bảo hộ miễn dịch (9 đến 12 tháng) của vắc xin tụ huyết trùng dạng nhũ dầu chủng P52 so với dạng keo phèn, cung cấp luận cứ khoa học và giải pháp kỹ thuật trực tiếp cho công tác phòng chống dịch bệnh gia súc tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Pasteurella multocida 1. Phân loại vi khuẩn Theo phân loại của Bergey’s (1994) [63], vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae, giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Pasteurella multocida (P.

multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86]. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen. Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P.

multocida có thể thấy khi nhuộm bằng xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45]. Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹ thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể.

Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs (1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P. Môi trường này gồm có 17 thành phần, trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không 5 sinh độc tố như lúc đầu.

(1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM (Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng. Môi trường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm khác, cũng như các loại nấm. Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P. multocida từ gia súc mắc bệnh.

Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của P. multocida là môi trường dextrose-starch agar và casein- sucrose-yeast (CSY). Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sử dụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P. multocida phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môi trường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton, hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129].

multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI. Trong môi trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P. multocida mọc tốt, làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô. Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael và cs, 2002) [112].

Theo Seleim (2005) [150], để vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích tăng trưởng.