Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại hà giang cao bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida và lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Hà Giang, Cao Bằng.

• Tác giả: Phạm Thị Phương Lan
• Người hướng dẫn: PGS.TS. Đặng Xuân Bình
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida
• 1.1.1. Phân loại vi khuẩn
• 1.1.2. Đặc tính sinh hóa
• 1.1.3. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P.
• 1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra
• 1.2.1. Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
• 1.2.2. Cơ chế sinh bệnh
• 1.2.3. Đặc điểm dịch tễ học
• 1.2.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
• 1.3. Phòng và trị bệnh tụ huyết trùng
• 1.3.1. Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng
• 1.3.1.1. Trên thế giới
• 1.4. Một số kết luận qua phân tích tổng quan
• 2. Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nguyên vật liệu
• 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng
• 2.2.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 2.2.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
• 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu
• 2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn P.
• 2.3.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của P.
• 2.3.5. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng bằng kỹ thuật PCR
• 2.3.6. Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng
• 2.3.7. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng đối với chuột nhắt trắng (Carter và cs, 1995) [77]
• 2.3.8. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được (Nguyễn Thanh Hà, 1991) [10]
• 2.3.9. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin
• 2.3.9.1. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò trước khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA (Indirect Haemaglunation Test)
• 2.3.9.2. Phương pháp xác định hiệu lực bảo hộ đối với trâu, bò trước và sau khi tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng (Bain và cs, 1982) [61]
• 2.3.9.3. Phương pháp đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình (Lê văn Tạo, Dương thế Long, 1996) [42]
• 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng từ năm 2011 - 2015
• 3.1.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng tại tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ trong năm tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.4. Mức độ dịch và hệ số năm dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.1.5. Thời điểm phát dịch, mùa dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 3.2.1. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng
• 3.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng
• 3.2.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P. mutocida phân lập được
• 3.2.4. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản ứng PCR
• 3.2.5. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 3.2.6. Xác định LD50 của vi khuẩn P.
• 3.2.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược
• 3.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng
• 3.3.1. Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin trong vùng thường xuyên xảy ra dịch tụ huyết trùng địa phương
• 3.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng chủng P52 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp
• 3.3.3. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò được tiêm phòng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nghiên cứu yếu tố gây bệnh Pasteurella Multocida

Pasteurella Multocida là vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò, một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Nghiên cứu tập trung vào việc xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này, bao gồm đặc tính sinh hóa, cơ chế sinh bệnh và dịch tễ học. Hà Giang và Cao Bằng là hai tỉnh được chọn làm địa bàn nghiên cứu do tình hình dịch bệnh phức tạp. Kết quả cho thấy, vi khuẩn Pasteurella Multocida có khả năng gây bệnh cao với các triệu chứng lâm sàng rõ rệt như sốt cao, xuất huyết và tử vong nhanh.

1.1. Đặc tính sinh hóa và cơ chế sinh bệnh

Vi khuẩn Pasteurella Multocida có hình que, Gram âm, kích thước nhỏ. Nghiên cứu xác định các đặc tính sinh hóa như khả năng lên men đường và phản ứng sinh Indol. Cơ chế sinh bệnh liên quan đến độc tố DNT (Dermonecrotic toxin), gây hoại tử mô và xuất huyết. Các yếu tố độc lực như protein màng ngoài (OMP) và khả năng kháng kháng sinh cũng được phân tích.

1.2. Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng

Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Hà Giang và Cao Bằng được nghiên cứu từ năm 2011 đến 2015. Kết quả cho thấy tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao, đặc biệt vào mùa Đông-Xuân. Các yếu tố như điều kiện thời tiết, tập quán chăn nuôi và hiệu quả tiêm phòng vắc xin ảnh hưởng đến sự lưu hành của bệnh.

II. Lựa chọn vắc xin phòng tụ huyết trùng

Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của hai loại vắc xin phòng tụ huyết trùng: vắc xin dạng keo phèn và nhũ dầu. Kết quả cho thấy cả hai loại vắc xin đều có khả năng tạo miễn dịch bảo hộ cao cho trâu bò. Tuy nhiên, vắc xin nhũ dầu có thời gian bảo hộ dài hơn, đạt hiệu quả tối ưu trong việc kiểm soát dịch bệnh tại Hà Giang và Cao Bằng.

2.1. Đánh giá hiệu lực vắc xin

Hiệu lực của vắc xin được đánh giá thông qua phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột nhắt trắng. Kết quả cho thấy, vắc xin nhũ dầu đạt hiệu giá kháng thể cao hơn so với vắc xin keo phèn. Thời gian bảo hộ của vắc xin nhũ dầu kéo dài đến 12 tháng, trong khi vắc xin keo phèn chỉ đạt 6 tháng.

2.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đề xuất sử dụng vắc xin nhũ dầu để phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Hà Giang và Cao Bằng. Điều này giúp nâng cao hiệu quả phòng bệnh, giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong, đồng thời hỗ trợ phát triển bền vững ngành chăn nuôi gia súc tại khu vực miền núi phía Bắc.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học quan trọng về đặc điểm dịch tễ, yếu tố gây bệnh và hiệu lực của vắc xin phòng tụ huyết trùng. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao, giúp cải thiện công tác phòng chống dịch bệnh, nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu bò tại Hà Giang và Cao Bằng.

3.1. Đóng góp khoa học

Nghiên cứu bổ sung tư liệu về serotype kháng nguyên và yếu tố độc lực của Pasteurella Multocida. Đây là cơ sở để phát triển các loại vắc xin hiệu quả hơn, phù hợp với điều kiện địa phương.

3.2. Ứng dụng trong chăn nuôi

Kết quả nghiên cứu giúp các cơ quan thú y và người chăn nuôi lựa chọn vắc xin phù hợp, nâng cao tỷ lệ tiêm phòng và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Điều này góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi gia súc tại khu vực miền núi phía Bắc.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh tụ huyết trùng (Haemorrhagic Septicaemia - HS) do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính và quá cấp tính nguy hiểm hàng đầu trên đàn gia súc nhai lại. Tại Việt Nam, ngành chăn nuôi trâu, bò giữ vai trò then chốt trong cung cấp sức kéo, phân bón và thực phẩm dinh dưỡng cao với quy mô đạt 2,5 triệu con trâu và 5,4 triệu con bò (Cục Thống kê, 2015). Tuy nhiên, dịch bệnh tụ huyết trùng liên tục đe dọa nền sản xuất nông hộ; theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, trong hai năm 2014 và 2015, mỗi năm có tới 26 tỉnh thành ghi nhận dịch với hàng nghìn gia súc mắc bệnh và chết. Tại địa bàn vùng cao như Hà Giang và Cao Bằng, nơi có tổng đàn trâu bò lần lượt trên 265.000 con và 228.000 con, tập quán thả rông, tiểu khí hậu khắc nghiệt và địa hình núi đá chia cắt đã khiến mầm bệnh tồn lưu dai dẳng. Nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cộng sự (2010) ghi nhận: "Năm 2008 tỉnh Hà Giang có 276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng, tỉnh Cao Bằng năm 2008 có 455 trâu, bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng".

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực tiễn: mặc dù các chương trình tiêm phòng định kỳ 2 lần/năm được triển khai, các ổ dịch cục bộ vẫn bùng phát thường xuyên. Nguyên nhân chính là sự thiếu hụt các dữ liệu dịch tễ phân tử cập nhật về serotype kháng nguyên của các chủng P. multocida thực địa tại vùng núi cao, sự biến động độc lực, đặc tính kháng kháng sinh, tỷ lệ mang trùng ở gia súc khỏe và đặc biệt là sự thiếu hụt các đánh giá thực chứng so sánh thời gian bảo hộ giữa vắc xin vô hoạt bổ trợ keo phèn truyền thống và vắc xin bổ trợ nhũ dầu đối với chính các chủng cường độc phân lập tại địa phương.

Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Thị Phương Lan (2017) với đề tài "Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh" (Mã ngành: 9.04 - Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y, Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên) đã giải quyết trọn vẹn khoảng trống này thông qua hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Tỷ lệ lưu hành dịch tễ học, mùa vụ phát bệnh và tỷ lệ mang trùng P. multocida ở niêm mạc mũi trâu, bò khỏe mạnh tại Hà Giang và Cao Bằng diễn biến theo quy luật nào trong giai đoạn 2011 - 2015?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Các chủng P. multocida phân lập từ bệnh phẩm trâu bò chết do tụ huyết trùng tại thực địa mang đặc tính sinh vật, hóa học, serotype vỏ (capsular type) và độc lực (LD50) như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Mức độ tương đồng kháng nguyên giữa chủng vắc xin sản xuất thương mại P52 và các chủng thực địa ra sao, và thời gian duy trì miễn dịch bảo hộ của vắc xin nhũ dầu so với vắc xin keo phèn khác biệt như thế nào qua các mốc thời gian 1, 3, 6, 9 và 12 tháng sau tiêm phòng?

Hệ thống giả thuyết tương ứng:

• Giả thuyết 1 (H1): Trâu bò khỏe mạnh tại vùng lưu dịch duy trì tỷ lệ mang trùng tiềm ẩn đáng kể, đóng vai trò nguồn truyền nhiễm nội tại bùng phát khi gặp yếu tố stress mùa vụ (mưa ẩm, chuyển mùa).
• Giả thuyết 2 (H2): Các chủng vi khuẩn phân lập từ gia súc ốm chết tại thực địa thuộc serotype B:2, có giáp mô đầy đủ, dung quang sắc cầu vồng (Fg) và độc lực cường độc cao đối với động vật thí nghiệm.
• Giả thuyết 3 (H3): Vắc xin nhũ dầu chủng P52 kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể bền vững, duy trì hiệu giá kháng thể bảo hộ (IHA) và tỷ lệ bảo hộ thụ động (PMPT) lên đến 12 tháng, vượt trội hoàn toàn so với giới hạn 4 - 6 tháng của vắc xin keo phèn.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp lý thuyết sinh bệnh học vi khuẩn (Bacterial Pathogenesis Theory), lý thuyết vỏ giáp mô chống thực bào (Capsular Anti-phagocytic Theory), lý thuyết miễn dịch học chất bổ trợ nhũ dầu (Adjuvant Depot Theory) và độc lực học phân tử. Quy mô nghiên cứu bao quát dữ liệu dịch tễ toàn diện giai đoạn 2011 - 2015 tại 2 tỉnh miền núi phía Bắc, thu thập hàng trăm mẫu dịch ngoáy mũi trâu bò khỏe và mẫu phủ tạng gia súc nghi mắc bệnh, thực hiện thử thách cường độc in vivo trên chuột nhắt trắng và kiểm tra hiệu giá huyết thanh học trên đàn trâu bò thực địa.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh tụ huyết trùng đã trải qua hơn một thế kỷ phát triển với nhiều cột mốc quan trọng. Khởi đầu từ các quan sát kinh điển của Louis Pasteur, phân loại học vi khuẩn được hệ thống hóa bởi Bergey (1994), định danh P. multocida là cầu trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh nha bào, bắt màu lưỡng cực khi nhuộm Giemsa hoặc Leishman (OIE, 2012).

Trong lĩnh vực phân loại serotype, y văn thế giới ghi nhận sự tiến hóa từ phương pháp bảo hộ chéo trên chuột của Roberts (1947) chia vi khuẩn thành 4 type (I, II, III, IV), đến hệ thống ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) xác định kháng nguyên vỏ A, B, D, E, F của Carter (1955, 1961) và phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch (AGPT) xác định 16 type kháng nguyên thân của Heddleston và cộng sự (1972). Theo De Alwis (1999), hệ thống kết hợp Carter - Heddleston đã chuẩn hóa các chủng gây bệnh bại huyết xuất huyết (HS) ở châu Á là serotype B:2 và ở châu Phi là E:2.

Tổng quan y văn ghi nhận hai luồng quan điểm và tranh luận học thuật sâu sắc:

1. Bản chất của kháng nguyên bảo hộ: Một trường phái (Bain và cs, 1982) khẳng định polysaccharide vỏ tinh khiết không đủ tạo miễn dịch bảo hộ trên chuột và bò khi thử thách cường độc, mà bắt buộc phải có sự hiện diện của phức hợp protein màng ngoài (OMP) như OmpH, PlpE hoặc thụ thể gắn hemoglobin (hgbA) (Wu và cs, 2007; Okay và cs, 2012). Ngược lại, trường phái phân loại kháng nguyên vỏ (Carter, 1967; Rimler, 1992) nhấn mạnh vai trò tiên quyết của giáp mô polysaccharide trong việc ức chế đại thực bào và quyết định độc lực cấp tính.
2. Hiệu lực của các dạng chất bổ trợ vắc xin trong điều kiện thực địa: Các nghiên cứu tại châu Á và Trung Đông (OIE, 1996; Sarwar và cs, 2015) chỉ ra rằng vắc xin keo phèn Alhydrogel chỉ tạo miễn dịch ngắn hạn từ 4 đến 6 tháng, đòi hỏi tiêm nhắc lại 2 lần/năm - một rào cản lớn đối với vùng cao. Trong khi đó, các công trình của Muneer và cộng sự (1994), Reddy và cộng sự (1996) khẳng định vắc xin nhũ dầu khoáng W/O kéo dài miễn dịch trên 9 đến 12 tháng nhưng vấp phải nhược điểm độ nhớt cao, khó tiêm.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế:

• Tại Pakistan, Farooq và cộng sự (2007, 2011) cùng Sarwar và cộng sự (2015) ghi nhận tỷ lệ nhiễm P. multocida ở trâu lên tới 49%, trâu mẫn cảm gấp nhiều lần bò và vắc xin nhũ dầu Montanide ISA 70 tạo hiệu giá kháng thể vượt trội (GMT = log2 6) so với vắc xin keo phèn (GMT = log2 3,2).
• Tại Ấn Độ, Joyjit và cộng sự (2013) cùng Gajendragad và cộng sự (2012) phân tích các ổ dịch tụ huyết trùng mùa mưa (tháng 6 - 9), ghi nhận trong 154 gia súc mắc bệnh có 85,71% là trâu và tỷ lệ tử vong chiếm 86,53% ở trâu so với 13,46% ở bò.

Vị trí học thuật của luận án Phạm Thị Phương Lan được xác lập rõ nét: Đây là công trình thực nghiệm quy mô lớn tại vùng miền núi Đông Bắc Việt Nam, kết nối đồng bộ từ dịch tễ học thực địa, đặc tính sinh học phân tử bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu gen vỏ giáp mô type B (Townsend và cs, 2001), thử thách độc lực LD50 in vivo, đến đánh giá đáp ứng miễn dịch động học kéo dài 12 tháng của vắc xin nhũ dầu chủng P52 so với keo phèn, cung cấp luận cứ thực chứng để giải quyết triệt để vấn đề dịch bệnh tại địa phương.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm các lý thuyết vi sinh vật học và miễn dịch học thú y thực nghiệm:

1. Mở rộng lý thuyết Động học Miễn dịch Chất bổ trợ (Adjuvant Immunokinetics Theory): Công trình chứng minh cơ chế phóng thích chậm (slow-release depot effect) của cấu trúc nhũ dầu nước-trong-dầu (Water-in-Oil). Lớp dầu khoáng bao bọc các hạt kháng nguyên P. multocida vô hoạt giúp bảo vệ kháng nguyên không bị enzyme mô phân hủy sớm, kéo dài thời gian trình diện kháng nguyên cho tế bào tua (dendritic cells) và đại thực bào, duy trì nồng độ kháng thể dịch thể đặc hiệu cao hơn hẳn cơ chế hấp phụ bề mặt của nhôm Hydroxit (Alhydrogel).
2. Củng cố lý thuyết Vỏ giáp mô và Độc lực (Capsular Virulence Paradigm): Thực nghiệm xác nhận mối liên hệ trực tiếp giữa sự toàn vẹn của vỏ giáp mô giàu polysaccharide, hiện tượng dung quang sắc cầu vồng (Fg - Greenish Fluorescent) dưới kính hiển vi quang học góc nghiêng 45° (De Alwis, 1999; Heddleston, 1966) với liều gây chết tối thiểu LD50 siêu nhỏ trên mô hình chuột nhắt trắng.
3. Mô hình hóa giả thuyết cân bằng sinh học vật chủ - mầm bệnh: Luận án chứng minh trạng thái "mang trùng thể ẩn" (latent carrier state) tại hạch amidan và niêm mạc mũi hô hấp trên của trâu bò khỏe mạnh (tỷ lệ 9 - 14%). Thế cân bằng sinh học này bị phá vỡ khi gặp các yếu tố stress ngoại cảnh (nhiệt độ hạ thấp vụ Đông - Xuân, độ ẩm cao vụ Hè - Thu), kích hoạt vi khuẩn nhân lên nhanh chóng, tăng độc lực và chuyển thành thể nhiễm trùng huyết cấp tính.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng:

• Tầng 1: Dịch tễ học mô tả và phân tích: Đánh giá tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong, hệ số năm dịch (HSND) và hệ số tháng dịch (HSTD) trên 2 đối tượng trâu và bò.
• Tầng 2: Giám định kiểu hình vi sinh và độc lực học (Phenotypic & Virulence Profiling): Nuôi cấy thuần khiết trên môi trường BHI bổ sung 5% máu cừu và thạch Casein-Sucrose-Yeast (CSY), kiểm tra 12 phản ứng sinh hóa, xác định dung quang khuẩn lạc và chuẩn độ LD50 theo phương pháp giải tích sinh học.
• Tầng 3: Sinh học phân tử (Molecular Genotyping): Ứng dụng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi chuyên biệt CAP-B khuếch đại đoạn gen đích quy định vỏ giáp mô type B (Townsend và cs, 2001).
• Tầng 4: Miễn dịch học thực nghiệm in vitro và in vivo: Đo lường hiệu giá kháng thể ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) kết hợp thử nghiệm bảo hộ thụ động trên chuột trắng (Passive Mouse Protection Test - PMPT) khi công cường độc với các chủng thực địa CBPT7 và HGXB5.
• Điều kiện biên (Boundary conditions): Áp dụng chuyên biệt cho quần thể trâu, bò chăn thả tại vùng sinh thái núi cao phía Bắc Việt Nam, đặc trưng bởi khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng núi và phương thức chăn nuôi bán thâm canh.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

• Triết lý nghiên cứu (Epistemological Stance): Thực chứng luận (Positivism) kết hợp thực nghiệm sinh học đối chứng nghiêm ngặt.
• Thiết kế hỗn hợp: Kết hợp điều tra dịch tễ học hồi cứu/cắt ngang (2011 - 2015) với các thử nghiệm vi sinh vật học phòng thí nghiệm chuẩn hóa (OIE standards) và thử nghiệm lâm sàng can thiệp vắc xin trên thực địa.
• Quy mô mẫu:
  • Khảo sát dịch tễ trên toàn bộ dữ liệu đàn gia súc 2 tỉnh Hà Giang (>265.000 con) và Cao Bằng (>228.000 con).
  • Thu thập 387 mẫu dịch ngoáy mũi trâu bò khỏe mạnh để đánh giá tỷ lệ mang trùng.
  • Phân lập từ hàng chục mẫu bệnh phẩm tươi (tim, gan, lách, tủy xương) của trâu bò chết nghi mắc tụ huyết trùng.
  • Hàng trăm chuột nhắt trắng (Swiss albino) thuần chủng phục vụ xác định LD50 và thử nghiệm bảo hộ PMPT.
  • Theo dõi miễn dịch trên đàn trâu, bò tiêm vắc xin thực địa qua các chu kỳ 1, 3, 6, 9 và 12 tháng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Thu thập và bảo quản mẫu: Mẫu bệnh phẩm phủ tạng và dịch ngoáy mũi được thu thập vô trùng, bảo quản trong môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng có kháng sinh ức chế tạp khuẩn (Transport Enrichment Medium - TEM) theo quy trình của Carter và cs (1996).
2. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Cấy chuyển trên thạch máu BHI 5% máu cừu và CSY agar ở 37°C trong 24 giờ. Đối với mẫu nghi nhiễm tạp khuẩn, tiến hành tiêm truyền sinh học qua chuột nhắt trắng (0,1 - 0,2 ml), thu hồi vi khuẩn thuần khiết từ máu tim chuột sau khi chết trong vòng 24 giờ (De Alwis, 1999).
3. Giám định sinh vật hóa học: Nhuộm soi Gram và Giemsa xác định hình thái trực khuẩn hai đầu tròn, bắt màu lưỡng cực. Thử phản ứng lên men đường (Glucose, Saccarose, Mannitol, Galactose, Fructose, Lactose, Maltose, Arabinose), phản ứng sinh Indol, Oxidase, Catalase, Urease và nuôi cấy trên môi trường MacConkey.
4. Định type kháng nguyên bằng kỹ thuật PCR: Tách chiết DNA tổng số, sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen kháng nguyên vỏ nhóm B (CAP-B) theo quy chuẩn quốc tế. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt được tối ưu hóa nghiêm ngặt, điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide để phát hiện vạch khuếch đại đặc hiệu.
5. Xác định độc lực và LD50: Pha loãng canh khuẩn P. multocida từ 10⁻¹ đến 10⁻¹⁰ trong nước muối sinh lý vô trùng, tiêm phúc mạc cho các lô chuột nhắt trắng (mỗi lô 5 con, liều 0,2 ml/con), theo dõi tỷ lệ chết trong 72 giờ và tính toán liều gây chết 50% (LD50).
6. Kháng sinh đồ (Antibiogram): Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa giấy kháng sinh trên môi trường Mueller-Hinton theo hướng dẫn chuẩn mực của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (NCCLS / CLSI).
7. Đánh giá đáp ứng miễn dịch và hiệu lực bảo hộ:
   • Xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) dùng hồng cầu cừu chuẩn độ kháng nguyên vỏ.
   • Thử nghiệm bảo hộ thụ động trên chuột (PMPT) theo quy trình Bain và cs (1982): Tiêm huyết thanh trâu bò sau tiêm vắc xin cho chuột (0,2 ml/con), sau 24 giờ thử thách bằng liều 100 LD50 chủng vi khuẩn cường độc thực địa.

Data và phân tích

• Phân tích số liệu: Dữ liệu dịch tễ được xử lý qua các chỉ số thống kê sinh học chuyên ngành: Tỷ lệ mắc bệnh (%), Tỷ lệ tử vong (%), Nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR), Hệ số năm dịch ($HSND = \frac{\text{Số năm có dịch}}{\text{Tổng số năm theo dõi}}$), Hệ số tháng dịch ($HSTD = \frac{\text{Số tháng có dịch}}{\text{Tổng số tháng theo dõi}}$).
• Chỉ số miễn dịch: Hiệu giá kháng thể trung bình nhân (Geometric Mean Titer - GMT, tính theo $log_2$), Tỷ lệ bảo hộ trung bình (%).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Quy luật dịch tễ học mùa vụ và độ mẫn cảm loài rõ rệt: Giai đoạn 2011 - 2015, bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng xảy ra quanh năm nhưng tập trung cao độ vào hai đỉnh dịch: Vụ Đông - Xuân (tháng 12 đến tháng 2) do ảnh hưởng của rét đậm rét hại và Vụ Hè - Thu (tháng 6 đến tháng 8) do mưa lũ, ẩm ướt kéo dài. Trâu có tỷ lệ mắc bệnh (chiếm trên 70% tổng số ca mắc) và tỷ lệ chết cao hơn đáng kể so với bò (RR > 2,5; p < 0,01), tương đồng với quy luật sinh thái học dịch bệnh được ghi nhận bởi Robertson (1999) và Joyjit và cs (2013).
2. Tỷ lệ mang trùng cao ở gia súc khỏe mạnh: Phân lập vi khuẩn từ dịch ngoáy mũi trâu bò bình thường phát hiện tỷ lệ mang khuẩn P. multocida dao động từ 9,6% đến 14,2%. Đây là bằng chứng thực nghiệm giải thích vì sao các ổ dịch phát sinh mang tính nội địa, tự phát ngay tại các thôn bản mà không cần sự xâm nhập của gia súc từ vùng khác.
3. 100% chủng thực địa gây bệnh thuộc Serotype B có độc lực cực mạnh: Toàn bộ các chủng vi khuẩn phân lập từ trâu bò chết vì bệnh tụ huyết trùng (điển hình như chủng CBPT7 tại Cao Bằng và HGXB5 tại Hà Giang) đều cho kết quả PCR dương tính tuyệt đối với cặp mồi CAP-B, tạo khuẩn lạc dạng S với dung quang sắc cầu vồng Fg (Greenish Fluorescent) đặc trưng. Độc lực của các chủng này rất cao, giá trị LD50 đạt mức vài chục tế bào vi khuẩn, giết chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12 - 24 giờ với bệnh tích xuất huyết toàn thân và nhiễm trùng huyết điển hình.
4. Báo động về sự gia tăng đề kháng kháng sinh: Các chủng P. multocida thực địa bắt đầu biểu hiện kháng cao với các kháng sinh truyền thống như Penicillin (kháng > 60%), Streptomycin, Tetracycline, Neomycin và Colistin. Tuy nhiên, vi khuẩn vẫn mẫn cảm cao (85 - 100%) với các kháng sinh thế hệ mới như Ceftiofur, Florfenicol, Enrofloxacin và Ciprofloxacin.
5. Hiệu lực bảo hộ vượt trội và kéo dài của vắc xin nhũ dầu chủng P52: Đánh giá động học miễn dịch trên đàn trâu bò thực địa cho thấy sự tương đồng kháng nguyên hoàn toàn giữa chủng vắc xin P52 và các chủng thực địa. Vắc xin nhũ dầu P52 duy trì hiệu giá kháng thể cao (GMT = log2 4,5 - 5,8) và tỷ lệ bảo hộ chuột thụ động (PMPT) đạt 80 - 100% ở các thời điểm 1, 3, 6 tháng và vẫn duy trì trên 70 - 80% tại thời điểm 9 và 12 tháng sau tiêm. Ngược lại, vắc xin keo phèn P52 suy giảm hiệu lực nhanh chóng sau 3 tháng và mất hoàn toàn khả năng bảo hộ ở tháng thứ 6 (tỷ lệ bảo hộ < 40%).

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Xác lập cơ sở khoa học về sự ổn định kháng nguyên serotype B:2 của các chủng P. multocida gây bệnh HS trên đại gia súc tại miền núi phía Bắc, khẳng định tính khả thi của việc sử dụng chủng chuẩn P52 trong sản xuất vắc xin đại trà.
• Ý nghĩa phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình tích hợp giữa chẩn đoán phân tử PCR nhanh (cặp mồi CAP-B) và phương pháp đánh giá hiệu lực bảo hộ in vivo (PMPT), cho phép thay thế các thử nghiệm công cường độc tốn kém và nguy hiểm trực tiếp trên trâu bò.
• Ý nghĩa thực tiễn và chính sách: Đề xuất một bước chuyển đổi mang tính chiến lược cho ngành thú y: Thay thế toàn diện vắc xin tụ huyết trùng keo phèn bằng vắc xin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu chủng P52. Việc này giúp giảm tần suất tiêm phòng từ 2 lần/năm xuống còn 1 lần duy nhất trong năm (tiêm đón trước mùa mưa hoặc trước mùa đông giá rét), tiết kiệm ngân sách nhà nước, giảm tải nhân lực thú y cơ sở và nâng cao tỷ lệ miễn dịch quần thể bền vững.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án thẳng thắn ghi nhận 4 hạn chế mang tính khách quan:

1. Giới hạn phạm vi địa lý: Nghiên cứu chỉ tập trung tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng; dữ liệu chưa bao quát toàn bộ các vùng sinh thái lân cận như Tây Bắc (Sơn La, Điện Biên, Lai Châu) hay các tỉnh đồng bằng.
2. Hạn chế về giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS): Luận án định danh serotype qua PCR mồi đặc hiệu CAP-B nhưng chưa tiến hành giải trình tự gen quy định các protein màng ngoài (như ompA, ompH, plpE) để đánh giá chi tiết mức độ đa hình di truyền (polymorphism) giữa các chủng thực địa.
3. Thử nghiệm bảo hộ gián tiếp: Do điều kiện kinh tế và an toàn sinh học thực địa, đánh giá hiệu lực bảo hộ phải thực hiện qua mô hình bảo hộ thụ động trên chuột trắng (PMPT) thay vì công cường độc trực tiếp trên đàn trâu bò sống.
4. Chưa khảo sát cơ chế truyền lây qua trung gian: Chưa đánh giá toàn diện vai trò của nguồn nước, rơm rác và các loài động vật hoang dã/loài gặm nhấm mang trùng trong việc duy trì ổ dịch tự nhiên.

Chương trình nghiên cứu 5 - 10 năm tiếp theo (Future Research Agenda):

1. Ứng dụng giải trình tự gen thế hệ mới (NGS/WGS) để xây dựng bản đồ dịch tễ học phân tử toàn diện của P. multocida trên toàn quốc.
2. Nghiên cứu phát triển vắc xin tái tổ hợp đa giá thế hệ mới (kết hợp các protein tái tổ hợp rPlpE, rCp39 và OmpH) tạo khả năng bảo hộ chéo chống lại cả serotype B và serotype A.
3. Cải tiến công nghệ tá dược nhũ dầu (sử dụng tá dược Montanide ISA 70 hoặc ISA 206) nhằm hạ thấp tối đa độ nhớt, giúp vắc xin dễ tiêm ở nhiệt độ thấp vào mùa đông vùng cao.
4. Phát triển kit chẩn đoán nhanh đẳng nhiệt LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) hoặc que thử sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh P. multocida serotype B ngay tại chuồng trại.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật (Academic Impact): Công trình là tài liệu tham khảo chuẩn mực trong đào tạo sau đại học chuyên ngành Vi sinh vật học và Ký sinh trùng thú y; dự kiến đóng góp hàng chục trích dẫn cho các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử Pasteurella tại Đông Nam Á.
• Chuyển đổi ngành công nghiệp sản xuất vắc xin: Thúc đẩy các công ty sản xuất thuốc thú y và vắc xin sinh phẩm trong nước (như NAVETCO, VETVACO, HANVET) mở rộng dây chuyền sản xuất vắc xin nhũ dầu chất lượng cao, chuẩn hóa công nghệ lên men kín và đồng hóa nhũ tương vô hoạt.
• Tác động chính sách Thú y Quốc gia: Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để Cục Thú y và Chi cục Thú y các tỉnh miền núi điều chỉnh Thông tư, quy trình phòng chống dịch bệnh tụ huyết trùng, chuyển dịch lịch tiêm phòng thường niên sang vắc xin nhũ dầu định kỳ 12 tháng/lần.
• Lợi ích kinh tế - xã hội định lượng: Giảm thiểu tỷ lệ chết trên đàn đại gia súc tại Hà Giang và Cao Bằng, bảo vệ hàng chục tỷ đồng giá trị tài sản cho đồng bào các dân tộc thiểu số, góp phần xóa đói giảm nghèo và ổn định an sinh xã hội vùng biên cương.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên Thú y: Tiếp cận khung phương pháp luận kết hợp chuẩn xác giữa vi sinh vật học cổ điển, sinh học phân tử và thử nghiệm miễn dịch in vivo.
• Các nhà khoa học R&D Vắc xin: Sở hữu dữ liệu thực nghiệm về thời gian duy trì kháng thể của tá dược nhũ dầu để ứng dụng vào phát triển các dòng vắc xin đa giá khác (như vắc xin kép Lở mồm long móng - Tụ huyết trùng).
• Cơ quan Quản lý Thú y (Cục Thú y, Chi cục Thú y địa phương): Nhận được khuyến nghị chính sách rõ ràng về lựa chọn chủng giống P52 và chủng loại vắc xin nhũ dầu để tối ưu hóa ngân sách phòng chống dịch hàng năm.
• Người chăn nuôi trâu, bò tại các tỉnh miền núi: Đàn gia súc được bảo vệ miễn dịch bền vững trong suốt 1 năm chỉ sau 1 mũi tiêm vắc xin nhũ dầu, giảm thiểu rủi ro bùng phát dịch đột ngột, an tâm phát triển kinh tế gia hộ.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?
Luận án đã mở rộng Lý thuyết Động học Miễn dịch Chất bổ trợ (Adjuvant Immunokinetics Theory) trong điều kiện dịch tễ vùng nhiệt đới núi cao. Nghiên cứu chứng minh cấu trúc vi nhũ tương nhũ dầu (W/O) với chủng P. multocida P52 vượt qua giới hạn miễn dịch ngắn hạn (4 - 6 tháng) của nhôm hydroxit, thiết lập trạng thái miễn dịch dịch thể ổn định kéo dài trọn vẹn 12 tháng (hiệu giá GMT duy trì > log2 3,2 và tỷ lệ bảo hộ PMPT đạt 70 - 80%).

2. Đổi mới phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây như thế nào?
So với các nghiên cứu truyền thống của Đặng Xuân Bình (2010) hay Cao Văn Hồng (2001) chủ yếu dựa vào phản ứng ngưng kết chậm và giám định sinh hóa đơn thuần, luận án của Phạm Thị Phương Lan đã:

• Chuẩn hóa quy trình PCR mồi đặc hiệu CAP-B để định type giáp mô B chuẩn xác tuyệt đối trong thời gian ngắn.
• Xây dựng mô hình kiểm chứng chéo ba bước (Triangulation): Từ giám định gen vỏ (CAP-B) $\rightarrow$ Đo lường chuẩn độ kháng thể dịch thể (IHA) $\rightarrow$ Thử thách cường độc bảo hộ in vivo (PMPT) với chính các chủng phân lập tại thực địa (CBPT7, HGXB5).

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì?
Phát hiện bất ngờ và có tính cảnh báo cao nhất là sự phân lập được các chủng P. multocida mang giáp mô đầy đủ, độc lực cao (gây chết chuột trong 12 - 24 giờ) từ dịch ngoáy mũi của những cá thể trâu, bò hoàn toàn khỏe mạnh với tỷ lệ lên tới 14,2%. Điều này bác bỏ giả định cho rằng mầm bệnh chỉ tồn tại ở động vật có biểu hiện ốm sốt, khẳng định nguồn lây tiềm ẩn nội tại luôn thường trực trong quần thể đàn.

4. Giao thức sao chép thực nghiệm (Replication Protocol) có được cung cấp rõ ràng không?
Luận án mô tả chi tiết, minh bạch toàn bộ quy trình:

• Thành phần môi trường nuôi cấy (CSY, BHI + 5% máu cừu).
• Nồng độ các hóa chất, chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi CAP-B.
• Quy chuẩn pha loãng kháng nguyên, cách thức xử lý hồng cầu cừu trong phản ứng IHA.
• Quy trình tiêm thụ động huyết thanh và liều thử thách công cường độc chuột (100 LD50) trong PMPT. Bất kỳ phòng thí nghiệm vi sinh thú y đạt chuẩn ISO 17025 nào cũng có thể tái lập chính xác các kết quả này.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao?
Luận án mở ra định hướng 10 năm tập trung vào:

• Giải mã hệ gen hoàn chỉnh (Pan-genome sequencing) các chủng vi khuẩn Pasteurella tại Việt Nam.
• Thiết kế vắc xin thế hệ mới mang kháng nguyên protein tái tổ hợp bảo hộ chéo (rPlpE, rCp39).
• Phát triển các hệ chất bổ trợ thế hệ mới (nano-adjuvants / Montanide kép) giảm độ nhớt và nâng cao tính ổn định nhiệt ở vùng cao.

Kết luận

Công trình luận án tiến sĩ của Phạm Thị Phương Lan (2017) đại diện cho một nghiên cứu học thuật thực chứng xuất sắc, giải quyết toàn diện vấn đề dịch tễ học và phòng chống bệnh tụ huyết trùng trên đại gia súc tại vùng miền núi phía Bắc với 6 đóng góp cốt lõi:

1. Xác định chính xác quy luật dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng giai đoạn 2011 - 2015, chỉ ra hai đỉnh dịch chính vào vụ Đông - Xuân và vụ Hè - Thu, với mức độ cảm nhiễm ở trâu vượt trội so với bò.
2. Định lượng tỷ lệ mang trùng P. multocida thể ẩn ở niêm mạc hô hấp trâu bò khỏe mạnh (9,6% - 14,2%), làm sáng tỏ nguồn gốc bùng phát dịch tại chỗ.
3. Giám định 100% chủng vi khuẩn phân lập từ gia súc mắc bệnh thực địa thuộc serotype B:2 (khẳng định qua phản ứng PCR cặp mồi CAP-B), có dung quang sắc cầu vồng Fg và độc lực cường độc cao.
4. Thiết lập bản đồ kháng sinh đồ cập nhật, xác định tình trạng kháng cao với Penicillin, Streptomycin, Tetracycline và chỉ rõ các kháng sinh còn mẫn cảm mạnh (Ceftiofur, Florfenicol, Enrofloxacin) phục vụ điều trị khẩn cấp.
5. Chứng minh thực nghiệm sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng sản xuất vắc xin P52 và các chủng thực địa, khẳng định hiệu lực bảo hộ của vắc xin chủng P52.
6. Xác lập bằng chứng khoa học vững chắc về sự vượt trội của vắc xin vô hoạt nhũ dầu chủng P52 (bảo hộ miễn dịch 9 - 12 tháng) so với vắc xin keo phèn (chỉ bảo hộ 4 - 6 tháng), mở ra bước ngoặt chiến lược chuyển đổi lịch tiêm phòng tụ huyết trùng sang chu kỳ 1 lần/năm trên phạm vi toàn quốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Pasteurella multocida 1. Phân loại vi khuẩn Theo phân loại của Bergey’s (1994) [63], vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae, giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Pasteurella multocida (P.

multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86]. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen. Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P.

multocida có thể thấy khi nhuộm bằng xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45]. Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹ thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể.

Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs (1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P. Môi trường này gồm có 17 thành phần, trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không 5 sinh độc tố như lúc đầu.

(1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM (Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng. Môi trường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm khác, cũng như các loại nấm. Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P. multocida từ gia súc mắc bệnh.

Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của P. multocida là môi trường dextrose-starch agar và casein- sucrose-yeast (CSY). Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sử dụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P. multocida phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môi trường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton, hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129].

multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI. Trong môi trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P. multocida mọc tốt, làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô. Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael và cs, 2002) [112].

Theo Seleim (2005) [150], để vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích tăng trưởng. Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra, 2006) [155].

Hussain và cs (2012) [97] nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn P. multocida trên các nguồn cacbon khác nhau, sử dụng đường glucose, maltose, galactose, sucrose như nguồn carbon để tăng sinh khối tế bào vi khuẩn P. multocida tăng hiệu quả sản xuất vắc xin. Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng Đạt, 1994) [8].

Môi trường này được bổ sung thêm 0,8% sucrose và 2% tụy đệm đã làm tăng hiệu suất phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Phạm Quang Thái, 2004) [43]. Nguyễn Mạnh Thắng và cs (2008) [49] cũng kết luận rằng, môi trường Hottinger thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn P. multocida trong hệ thống lên men kín từng mẻ vắc xin. multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc.

Theo Namioka và Murata (1961) [121], trên môi trường thạch huyết thanh P. multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc: + Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và vi khuẩn có độc lực mạnh. + Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, vi khuẩn có độc lực trung bình. + Khuẩn lạc R (Rough): có rìa xù xì, thường không có dung quang, vi khuẩn có độc lực yếu.

Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu, khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường. Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng. Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán.

Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xung quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng. Khuẩn lạc dạng S có dung quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M không có đặc điểm nói trên. Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P. multocida có liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966) [94].

Theo De Alwis (1999) [86], tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau: + Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent). 7 + Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong.

Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của vi khuẩn P. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P. multocida có tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990) [156]. Rimler (1992) [141] cho rằng, khuẩn lạc của vi khuẩn P.

multocida tập trung ở hai dạng chính. Khuẩn lạc dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc dung quang màu xanh. Dung quang của khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày của vi khuẩn. Vi khuẩn có dung quang sắc cầu vồng đứng riêng hoặc từng đôi, có vỏ nhày và rất độc, thường gây bệnh thể cấp tính.

Vi khuẩn, có dạng khuẩn lạc dung quang màu xanh kém độc hơn, thường gặp ở những đàn gia súc bị dịch địa phương. Đặc tính sinh hóa P. multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose. Dương tính với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase.

Phản ứng urease âm tính, không mọc trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010 [3]; Lê Văn Dương, 2012 [6]). Mitra và cs (2013) [113] cho biết, vi khuẩn P. multocida dương tính với phản ứng Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose, galactose, fructose và mannitol. Azmat và cs (2013) [59] nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn P.

multocida phân lập tại Pakistan cho thấy, vi khuẩn dương tính với oxydase, catalase, sinh Indol. Phản ứng với TSI cũng dương tính, lên men đường xylose, không lên men đường mantose, phản ứng nitrate dương tính, âm tính với phản ứng urease và citrate, vi khuẩn không di động. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. Yếu tố độc lực Kháng nguyên Kháng nguyên P.

multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin. Cho đến 8 nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P.

multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP (outer membrane protein). - Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O.

Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price và Smith (1966) [134] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ. Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide. Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên protein đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố miễn dịch quan trọng.

Vai trò của polysaccharit trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ kém. Theo Bain và cs (1982) [61], những polysaccharide tinh khiết không tạo được sự bảo hộ đối với chuột, thỏ và bò khi thử thách cường độc. Thành phần polysaccharide chính trong kháng nguyên serotype A là axit hyaluronic (Rosner và cs, 1992) [143]. Ngược lại với kháng nguyên serotype A, kháng nguyên polysaccharide serotype B bao gồm arabinose, mannose, đường galactose với những mối liên kết chưa rõ ràng (Boyce và cs, 2000) [67].

- Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P. multocida có kháng nguyên thân là phức hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch.