Tổng quan nghiên cứu

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề được quan tâm hàng đầu do ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm, trong giai đoạn 2009-2012, số vụ ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam dao động từ 147 đến 175 vụ mỗi năm, với hàng nghìn người mắc và hàng chục ca tử vong. Đặc biệt, các vụ ngộ độc do mycotoxin, trong đó có độc tố ochratoxin, gây ra nhiều lo ngại do tính chất tích lũy và độc tính cao. Ochratoxin là độc tố sinh ra bởi các chủng nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium verrucosum, có khả năng gây ung thư và tổn thương thận ở người và động vật. Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) ước tính khoảng 25% ngũ cốc thế giới bị nhiễm mycotoxin, trong đó ochratoxin là một trong những độc tố phổ biến nhất, đặc biệt tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng và tham định phương pháp xác định hàm lượng ochratoxin trong thực phẩm, bao gồm ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc và rượu lên men, bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu thu thập tại một số chợ nội thành Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An trong năm 2013. Việc phát triển phương pháp phân tích chính xác, nhạy và có độ chọn lọc cao sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong nước và quốc tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, trong đó nổi bật là:

  • Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp tách các thành phần hóa học dựa trên sự khác biệt về tương tác giữa pha tĩnh (cột C18 pha đảo) và pha động (dung dịch amoni acetate 10 mM và methanol). HPLC cho phép tách các chất có tính phân cực khác nhau với độ phân giải cao.

  • Lý thuyết khối phổ (Mass Spectrometry - MS): Phân tích dựa trên việc ion hóa mẫu, tách các ion theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) và phát hiện tín hiệu ion. Phương pháp LC-MS/MS sử dụng bộ phân tích tứ cực ba lần, cho phép chọn lọc ion mẹ, phân mảnh tạo ion con và định lượng chính xác các chất phân tích.

  • Khái niệm chính:

    • Ochratoxin A và B: Các độc tố nấm mốc có cấu trúc hóa học đặc trưng, gây độc cho gan, thận và hệ miễn dịch.
    • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Thể hiện độ nhạy của phương pháp phân tích.
    • Hiệu suất thu hồi (Recovery): Tỷ lệ phần trăm chất phân tích được thu hồi sau quá trình xử lý mẫu.
    • Độ chọn lọc và độ chính xác: Đánh giá khả năng phân biệt và tái lập kết quả của phương pháp.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu thực phẩm gồm ngũ cốc (ngô, lạc, đỗ, gạo) và các loại rượu lên men được lấy ngẫu nhiên tại các chợ nội thành Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An với khối lượng từ 100 đến 500 g mỗi mẫu.

  • Phương pháp phân tích:

    • Mẫu được xử lý bằng quy trình chiết pha rắn với dung môi chloroform và dung dịch NaHCO3 1%, làm sạch bằng cột chiết pha rắn C18.
    • Phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Shimadzu, sử dụng cột Waters C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và tiền cột C18.
    • Pha động gồm dung dịch amoni acetate 10 mM (kênh A) và methanol (kênh B) với chương trình gradient tối ưu.
    • Ion hóa bằng kỹ thuật phun điện tử (ESI) ở chế độ ion âm, chọn ion mẹ và ion con đặc trưng cho ochratoxin A (m/z 402 → 166,9) và ochratoxin B (m/z 368 → 220).
    • Tối ưu các thông số MS/MS như thế đầu vào (DP), năng lượng va chạm (CE), thế ra (CXP), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí (GS1, GS2, CUR).

  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2013, bao gồm các giai đoạn thu thập mẫu, tối ưu điều kiện phân tích, xây dựng quy trình xử lý mẫu, tham định phương pháp và áp dụng phân tích mẫu thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Tối ưu điều kiện LC-MS/MS:

    • Ion mẹ và ion con được xác định rõ ràng với m/z 402/166,9 cho ochratoxin A và 368/220 cho ochratoxin B.
    • Các thông số MS/MS tối ưu như DP = -100 V, CE = -24 đến -35 V, CXP = -15 đến -25 V, nhiệt độ nguồn 400°C, áp suất khí CUR 10 psi giúp đạt độ nhạy cao.
    • Tốc độ dòng pha động 1,0 ml/phút cho sắc ký sắc nét, thời gian phân tích khoảng 10 phút.

  2. Quy trình xử lý mẫu tối ưu:

    • Quy trình chiết mẫu bằng chloroform kết hợp NaHCO3 1% và làm sạch bằng cột C18 cho hiệu suất thu hồi ochratoxin A đạt 84%, ochratoxin B đạt 78%, cao hơn so với các quy trình dùng ethyl acetate hoặc NaHCO3 đơn thuần.
    • Chiết lặp 2 lần mỗi lần 15 ml dung môi chloroform là tối ưu, không khác biệt đáng kể so với 3 lần chiết nhưng tiết kiệm dung môi.
    • Tốc độ rửa giải cột chiết pha rắn 1 ml/phút và thể tích dung môi rửa giải 2 ml MeOH-acid acetic (99,5:0,5, v/v) cho hiệu suất thu hồi cao nhất (khoảng 84% với OTA).

  3. Ảnh hưởng của pH chiết mẫu:

    • pH môi trường chiết ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất chiết. pH 1-2 (môi trường axit) giúp ochratoxin tan tốt trong chloroform, tăng diện tích pic sắc ký lên đến 4400 cho OTA, giảm dần khi pH tăng lên.

  4. Phân tích mẫu thực tế:

    • Trong số 123 mẫu ngô phân tích tại Hà Giang, 40,7% mẫu phát hiện có ochratoxin A, trong đó 1,6% vượt mức dư lượng tối đa cho phép theo quy định Bộ Y tế.
    • Các mẫu rượu lên men và sản phẩm từ ngũ cốc cũng có sự hiện diện của ochratoxin nhưng ở mức thấp hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LC-MS/MS với quy trình xử lý mẫu tối ưu có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp để phát hiện ochratoxin ở mức vết trong thực phẩm. Việc lựa chọn dung môi chiết chloroform kết hợp với điều kiện pH axit giúp tăng hiệu suất chiết do ochratoxin tồn tại chủ yếu ở dạng không ion hóa, dễ hòa tan trong dung môi hữu cơ. So với các phương pháp ELISA hay HPLC huỳnh quang, LC-MS/MS cho phép định lượng chính xác hơn, giảm thiểu sai số do ma trận mẫu phức tạp.

Phân tích mẫu thực tế phản ánh tình trạng nhiễm độc ochratoxin phổ biến tại Việt Nam, đặc biệt trong ngũ cốc, phù hợp với báo cáo của FAO về nguy cơ mycotoxin ở vùng nhiệt đới. Việc phát hiện một tỷ lệ mẫu vượt mức cho phép cảnh báo cần tăng cường kiểm soát và giám sát an toàn thực phẩm. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tần suất mẫu nhiễm ochratoxin và bảng so sánh mức dư lượng với tiêu chuẩn MRL.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Xây dựng hệ thống giám sát ochratoxin định kỳ tại các vùng sản xuất và tiêu thụ ngũ cốc, rượu lên men nhằm phát hiện sớm và kiểm soát mức độ nhiễm độc. Thời gian thực hiện: hàng quý; chủ thể: Cục An toàn thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm.

  2. Áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong kiểm nghiệm chính thức để nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích, thay thế dần các phương pháp truyền thống. Thời gian: 1-2 năm; chủ thể: các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm.

  3. Tuyên truyền, đào tạo kỹ thuật xử lý và bảo quản nông sản cho nông dân và doanh nghiệp nhằm giảm thiểu sự phát triển của nấm mốc và sản sinh độc tố. Thời gian: liên tục; chủ thể: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, các tổ chức đào tạo.

  4. Xây dựng quy chuẩn và hoàn thiện pháp luật về mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) ochratoxin B tại Việt Nam, đồng bộ với tiêu chuẩn quốc tế để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Thời gian: 2 năm; chủ thể: Bộ Y tế, Bộ Khoa học và Công nghệ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, An toàn thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp phương pháp phân tích hiện đại, chi tiết về kỹ thuật LC-MS/MS và quy trình xử lý mẫu, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan.

  2. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm: Tham khảo để xây dựng chính sách giám sát, kiểm soát độc tố nấm mốc trong thực phẩm, nâng cao hiệu quả quản lý chất lượng.

  3. Phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực phẩm: Áp dụng quy trình và điều kiện phân tích tối ưu để nâng cao độ chính xác, độ nhạy trong phát hiện ochratoxin, đảm bảo kết quả kiểm nghiệm có giá trị pháp lý.

  4. Doanh nghiệp sản xuất, chế biến nông sản và thực phẩm: Hiểu rõ về nguy cơ ochratoxin và các biện pháp kiểm soát, từ đó cải thiện quy trình sản xuất, bảo quản nhằm giảm thiểu ô nhiễm độc tố, nâng cao chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Ochratoxin là gì và tại sao cần quan tâm?
    Ochratoxin là độc tố do nấm mốc Aspergillus và Penicillium sinh ra, có khả năng gây ung thư và tổn thương thận. Nó tích lũy trong cơ thể qua thực phẩm nhiễm độc, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và động vật.

  2. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các phương pháp khác?
    LC-MS/MS có độ nhạy cao, khả năng chọn lọc tốt, phát hiện và định lượng đồng thời nhiều chất trong mẫu phức tạp với giới hạn phát hiện thấp, giảm thiểu sai số do ma trận mẫu.

  3. Quy trình xử lý mẫu ảnh hưởng thế nào đến kết quả phân tích?
    Quy trình xử lý mẫu tối ưu giúp loại bỏ tạp chất, tăng hiệu suất thu hồi chất phân tích, giảm nhiễu nền, từ đó nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.

  4. Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của ochratoxin A tại Việt Nam là bao nhiêu?
    MRL của ochratoxin A được quy định khác nhau tùy loại thực phẩm, ví dụ: 5 µg/g đối với ngũ cốc chưa qua chế biến, 3 µg/g đối với ngũ cốc và bột ngũ cốc, 2 µg/g đối với rượu vang.

  5. Làm thế nào để giảm thiểu nguy cơ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm?
    Bảo quản nông sản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát, kiểm soát độ ẩm, sử dụng kỹ thuật xử lý và bảo quản phù hợp, đồng thời giám sát định kỳ để phát hiện sớm và xử lý kịp thời.

Kết luận

  • Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) được xây dựng và tối ưu thành công để xác định ochratoxin A và B trong thực phẩm với độ nhạy cao và độ chính xác tốt.
  • Quy trình xử lý mẫu bằng chiết chloroform kết hợp NaHCO3 1% và làm sạch bằng cột C18 cho hiệu suất thu hồi trên 80%.
  • pH môi trường chiết mẫu ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết, môi trường axit pH 1-2 là tối ưu.
  • Phân tích mẫu thực tế cho thấy tỷ lệ mẫu ngũ cốc nhiễm ochratoxin A chiếm khoảng 40%, trong đó có mẫu vượt mức dư lượng cho phép.
  • Nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực kiểm nghiệm, giám sát an toàn thực phẩm và đề xuất các giải pháp kiểm soát ochratoxin hiệu quả tại Việt Nam.

Hành động tiếp theo: Áp dụng phương pháp trong giám sát thực phẩm rộng rãi, hoàn thiện quy chuẩn pháp lý, đồng thời triển khai các chương trình đào tạo và tuyên truyền nâng cao nhận thức cộng đồng về an toàn thực phẩm. Đề nghị các cơ quan chức năng và doanh nghiệp phối hợp thực hiện để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.