Luận văn thạc sĩ: Xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp LC-MS/MS

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phương pháp xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS, đảm bảo an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hà Bình
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác định Ochratoxin Trong Thực Phẩm Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Khối Phổ (LC-MS/MS)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu chung
• 1.2. Tính chất hóa lý của Ochratoxins
• 1.3. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL)
• 1.4. Các phương pháp xác định
• 1.4.1. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• 1.4.2. Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC)
• 1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cột ái lực miễn dịch
• 1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu
• 2.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
• 2.2.2.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 2.2.3. Phương tiện nghiên cứu
• 2.2.3.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.2.3.2. Dung môi, hóa chất
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS
• 3.1.1. Tối ưu các điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS
• 3.1.2. Khảo sát ion mẹ và ion con
• 3.1.3. Tối ưu các điều kiện MS/MS
• 3.1.4. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• 3.1.4.1. Khảo sát thành phần pha động
• 3.1.4.2. Khảo sát tốc độ pha động
• 3.1.4.3. Chọn chương trình chạy gradient
• 3.1.5. Tối ưu quy trình xử lý mẫu
• 3.1.5.1. Chọn quy trình xử lý mẫu
• 3.1.5.2. Khảo sát thể tích (số lần chiết) dung môi chiết
• 3.1.5.3. Chọn cột chiết pha
• 3.1.5.4. Khảo sát tốc độ qua cột chiết pha rắn
• 3.1.5.5. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải
• 3.1.5.6. Khảo sát ảnh hưởng pH trong quá trình chiết mẫu
• 3.2. Tham định phương pháp phân tích
• 3.2.1. Tính đặc hiệu / chọn lọc
• 3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính
• 3.2.4. Xây dựng đường chuẩn
• 3.3. Phân tích mẫu thực tế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ochratoxin trong thực phẩm

Nghiên cứu về ochratoxin trong thực phẩm đang trở thành một vấn đề cấp bách trong bối cảnh an toàn thực phẩm hiện nay. Ochratoxin A là một loại độc tố được sản sinh bởi nấm mốc, có khả năng gây hại cho sức khỏe con người. Việc xác định nồng độ ochratoxin trong thực phẩm là rất quan trọng để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã được chứng minh là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện và định lượng ochratoxin trong thực phẩm.

1.1. Định nghĩa ochratoxin và nguồn gốc

Ochratoxin là một loại độc tố do nấm mốc sinh ra, thường có mặt trong nhiều loại thực phẩm như ngũ cốc, cà phê và rượu. Nguồn gốc của ochratoxin chủ yếu từ các loài nấm Aspergillus và Penicillium. Việc hiểu rõ về nguồn gốc và tính chất của ochratoxin là cần thiết để có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tác hại của ochratoxin đối với sức khỏe

Ochratoxin A có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, bao gồm ung thư và tổn thương thận. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tiêu thụ thực phẩm nhiễm ochratoxin có thể dẫn đến tích lũy độc tố trong cơ thể, gây ra các bệnh lý mãn tính.

II. Vấn đề và thách thức trong xác định ochratoxin

Việc xác định ochratoxin trong thực phẩm gặp nhiều thách thức do tính chất hóa lý của nó. Ochratoxin A có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường và khó bị phân hủy. Điều này làm cho việc phát hiện và định lượng trở nên phức tạp. Hơn nữa, các phương pháp truyền thống như ELISA có thể không đủ nhạy để phát hiện nồng độ thấp của ochratoxin trong thực phẩm.

2.1. Khó khăn trong việc phát hiện ochratoxin

Một trong những khó khăn lớn nhất trong việc phát hiện ochratoxin là nồng độ của nó thường rất thấp trong thực phẩm. Điều này đòi hỏi các phương pháp phân tích phải có độ nhạy cao và khả năng phát hiện chính xác.

2.2. Tác động của môi trường đến nồng độ ochratoxin

Môi trường lưu trữ thực phẩm có thể ảnh hưởng lớn đến nồng độ ochratoxin. Nhiệt độ, độ ẩm và thời gian bảo quản đều có thể làm tăng hoặc giảm mức độ nhiễm độc tố trong thực phẩm.

III. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS trong nghiên cứu

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã được áp dụng rộng rãi trong việc xác định ochratoxin trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép phát hiện nồng độ thấp của ochratoxin với độ chính xác cao. LC-MS/MS kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ, giúp tách biệt và phân tích các hợp chất trong mẫu thực phẩm một cách hiệu quả.

3.1. Nguyên lý hoạt động của LC MS MS

LC-MS/MS hoạt động dựa trên nguyên lý tách biệt các hợp chất trong mẫu bằng sắc ký lỏng, sau đó phân tích chúng bằng khối phổ. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ ochratoxin với độ nhạy và độ chính xác cao.

3.2. Ưu điểm của LC MS MS so với các phương pháp khác

LC-MS/MS có nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác như ELISA hay HPLC. Độ nhạy cao, khả năng phát hiện nhiều loại độc tố cùng lúc và độ chính xác trong việc định lượng là những điểm mạnh nổi bật của phương pháp này.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu để xác định nồng độ ochratoxin trong thực phẩm như ngũ cốc, cà phê và rượu. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp này có thể phát hiện ochratoxin A ở nồng độ rất thấp, giúp đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

4.1. Kết quả nghiên cứu ochratoxin trong ngũ cốc

Nghiên cứu cho thấy rằng trong 123 mẫu ngũ cốc, có tới 40,7% mẫu phát hiện có ochratoxin A. Điều này cho thấy mức độ nhiễm độc tố trong ngũ cốc là khá cao và cần có biện pháp kiểm soát hiệu quả.

4.2. Ứng dụng trong kiểm tra chất lượng thực phẩm

Phương pháp LC-MS/MS không chỉ giúp phát hiện ochratoxin mà còn có thể được áp dụng trong kiểm tra chất lượng thực phẩm nói chung. Điều này giúp các cơ quan chức năng có thể kiểm soát và đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu ochratoxin

Nghiên cứu về ochratoxin trong thực phẩm là rất cần thiết để đảm bảo an toàn cho sức khỏe cộng đồng. Phương pháp LC-MS/MS đã chứng minh được hiệu quả trong việc phát hiện và định lượng ochratoxin. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện các phương pháp phân tích và tăng cường kiểm soát chất lượng thực phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu ochratoxin

Nghiên cứu về ochratoxin sẽ tiếp tục được mở rộng để tìm ra các phương pháp phân tích mới và hiệu quả hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện ochratoxin trong thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

5.2. Tăng cường hợp tác trong nghiên cứu

Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, cơ quan chức năng và ngành công nghiệp thực phẩm để nâng cao nhận thức và kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm. Sự hợp tác này sẽ góp phần đảm bảo an toàn thực phẩm cho cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề được quan tâm hàng đầu do ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm, trong giai đoạn 2009-2012, số vụ ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam dao động từ 147 đến 175 vụ mỗi năm, với hàng nghìn người mắc và hàng chục ca tử vong. Đặc biệt, các vụ ngộ độc do mycotoxin, trong đó có độc tố ochratoxin, gây ra nhiều lo ngại do tính chất tích lũy và độc tính cao. Ochratoxin là độc tố sinh ra bởi các chủng nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium verrucosum, có khả năng gây ung thư và tổn thương thận ở người và động vật. Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) ước tính khoảng 25% ngũ cốc thế giới bị nhiễm mycotoxin, trong đó ochratoxin là một trong những độc tố phổ biến nhất, đặc biệt tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng và tham định phương pháp xác định hàm lượng ochratoxin trong thực phẩm, bao gồm ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc và rượu lên men, bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu thu thập tại một số chợ nội thành Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An trong năm 2013. Việc phát triển phương pháp phân tích chính xác, nhạy và có độ chọn lọc cao sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong nước và quốc tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, trong đó nổi bật là:

• Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp tách các thành phần hóa học dựa trên sự khác biệt về tương tác giữa pha tĩnh (cột C18 pha đảo) và pha động (dung dịch amoni acetate 10 mM và methanol). HPLC cho phép tách các chất có tính phân cực khác nhau với độ phân giải cao.

• Lý thuyết khối phổ (Mass Spectrometry - MS): Phân tích dựa trên việc ion hóa mẫu, tách các ion theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) và phát hiện tín hiệu ion. Phương pháp LC-MS/MS sử dụng bộ phân tích tứ cực ba lần, cho phép chọn lọc ion mẹ, phân mảnh tạo ion con và định lượng chính xác các chất phân tích.

• Khái niệm chính:

  • Ochratoxin A và B: Các độc tố nấm mốc có cấu trúc hóa học đặc trưng, gây độc cho gan, thận và hệ miễn dịch.
  • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Thể hiện độ nhạy của phương pháp phân tích.
  • Hiệu suất thu hồi (Recovery): Tỷ lệ phần trăm chất phân tích được thu hồi sau quá trình xử lý mẫu.
  • Độ chọn lọc và độ chính xác: Đánh giá khả năng phân biệt và tái lập kết quả của phương pháp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu thực phẩm gồm ngũ cốc (ngô, lạc, đỗ, gạo) và các loại rượu lên men được lấy ngẫu nhiên tại các chợ nội thành Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An với khối lượng từ 100 đến 500 g mỗi mẫu.

• Phương pháp phân tích:

  • Mẫu được xử lý bằng quy trình chiết pha rắn với dung môi chloroform và dung dịch NaHCO3 1%, làm sạch bằng cột chiết pha rắn C18.
  • Phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Shimadzu, sử dụng cột Waters C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và tiền cột C18.
  • Pha động gồm dung dịch amoni acetate 10 mM (kênh A) và methanol (kênh B) với chương trình gradient tối ưu.
  • Ion hóa bằng kỹ thuật phun điện tử (ESI) ở chế độ ion âm, chọn ion mẹ và ion con đặc trưng cho ochratoxin A (m/z 402 → 166,9) và ochratoxin B (m/z 368 → 220).
  • Tối ưu các thông số MS/MS như thế đầu vào (DP), năng lượng va chạm (CE), thế ra (CXP), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí (GS1, GS2, CUR).

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2013, bao gồm các giai đoạn thu thập mẫu, tối ưu điều kiện phân tích, xây dựng quy trình xử lý mẫu, tham định phương pháp và áp dụng phân tích mẫu thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu điều kiện LC-MS/MS:

   • Ion mẹ và ion con được xác định rõ ràng với m/z 402/166,9 cho ochratoxin A và 368/220 cho ochratoxin B.
   • Các thông số MS/MS tối ưu như DP = -100 V, CE = -24 đến -35 V, CXP = -15 đến -25 V, nhiệt độ nguồn 400°C, áp suất khí CUR 10 psi giúp đạt độ nhạy cao.
   • Tốc độ dòng pha động 1,0 ml/phút cho sắc ký sắc nét, thời gian phân tích khoảng 10 phút.

2. Quy trình xử lý mẫu tối ưu:

   • Quy trình chiết mẫu bằng chloroform kết hợp NaHCO3 1% và làm sạch bằng cột C18 cho hiệu suất thu hồi ochratoxin A đạt 84%, ochratoxin B đạt 78%, cao hơn so với các quy trình dùng ethyl acetate hoặc NaHCO3 đơn thuần.
   • Chiết lặp 2 lần mỗi lần 15 ml dung môi chloroform là tối ưu, không khác biệt đáng kể so với 3 lần chiết nhưng tiết kiệm dung môi.
   • Tốc độ rửa giải cột chiết pha rắn 1 ml/phút và thể tích dung môi rửa giải 2 ml MeOH-acid acetic (99,5:0,5, v/v) cho hiệu suất thu hồi cao nhất (khoảng 84% với OTA).

3. Ảnh hưởng của pH chiết mẫu:

   • pH môi trường chiết ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất chiết. pH 1-2 (môi trường axit) giúp ochratoxin tan tốt trong chloroform, tăng diện tích pic sắc ký lên đến 4400 cho OTA, giảm dần khi pH tăng lên.

4. Phân tích mẫu thực tế:

   • Trong số 123 mẫu ngô phân tích tại Hà Giang, 40,7% mẫu phát hiện có ochratoxin A, trong đó 1,6% vượt mức dư lượng tối đa cho phép theo quy định Bộ Y tế.
   • Các mẫu rượu lên men và sản phẩm từ ngũ cốc cũng có sự hiện diện của ochratoxin nhưng ở mức thấp hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LC-MS/MS với quy trình xử lý mẫu tối ưu có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp để phát hiện ochratoxin ở mức vết trong thực phẩm. Việc lựa chọn dung môi chiết chloroform kết hợp với điều kiện pH axit giúp tăng hiệu suất chiết do ochratoxin tồn tại chủ yếu ở dạng không ion hóa, dễ hòa tan trong dung môi hữu cơ. So với các phương pháp ELISA hay HPLC huỳnh quang, LC-MS/MS cho phép định lượng chính xác hơn, giảm thiểu sai số do ma trận mẫu phức tạp.

Phân tích mẫu thực tế phản ánh tình trạng nhiễm độc ochratoxin phổ biến tại Việt Nam, đặc biệt trong ngũ cốc, phù hợp với báo cáo của FAO về nguy cơ mycotoxin ở vùng nhiệt đới. Việc phát hiện một tỷ lệ mẫu vượt mức cho phép cảnh báo cần tăng cường kiểm soát và giám sát an toàn thực phẩm. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tần suất mẫu nhiễm ochratoxin và bảng so sánh mức dư lượng với tiêu chuẩn MRL.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng hệ thống giám sát ochratoxin định kỳ tại các vùng sản xuất và tiêu thụ ngũ cốc, rượu lên men nhằm phát hiện sớm và kiểm soát mức độ nhiễm độc. Thời gian thực hiện: hàng quý; chủ thể: Cục An toàn thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm.

2. Áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong kiểm nghiệm chính thức để nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích, thay thế dần các phương pháp truyền thống. Thời gian: 1-2 năm; chủ thể: các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm.

3. Tuyên truyền, đào tạo kỹ thuật xử lý và bảo quản nông sản cho nông dân và doanh nghiệp nhằm giảm thiểu sự phát triển của nấm mốc và sản sinh độc tố. Thời gian: liên tục; chủ thể: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, các tổ chức đào tạo.

4. Xây dựng quy chuẩn và hoàn thiện pháp luật về mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) ochratoxin B tại Việt Nam, đồng bộ với tiêu chuẩn quốc tế để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Thời gian: 2 năm; chủ thể: Bộ Y tế, Bộ Khoa học và Công nghệ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, An toàn thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp phương pháp phân tích hiện đại, chi tiết về kỹ thuật LC-MS/MS và quy trình xử lý mẫu, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan.

2. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm: Tham khảo để xây dựng chính sách giám sát, kiểm soát độc tố nấm mốc trong thực phẩm, nâng cao hiệu quả quản lý chất lượng.

3. Phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực phẩm: Áp dụng quy trình và điều kiện phân tích tối ưu để nâng cao độ chính xác, độ nhạy trong phát hiện ochratoxin, đảm bảo kết quả kiểm nghiệm có giá trị pháp lý.

4. Doanh nghiệp sản xuất, chế biến nông sản và thực phẩm: Hiểu rõ về nguy cơ ochratoxin và các biện pháp kiểm soát, từ đó cải thiện quy trình sản xuất, bảo quản nhằm giảm thiểu ô nhiễm độc tố, nâng cao chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Ochratoxin là gì và tại sao cần quan tâm?
   Ochratoxin là độc tố do nấm mốc Aspergillus và Penicillium sinh ra, có khả năng gây ung thư và tổn thương thận. Nó tích lũy trong cơ thể qua thực phẩm nhiễm độc, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và động vật.

2. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các phương pháp khác?
   LC-MS/MS có độ nhạy cao, khả năng chọn lọc tốt, phát hiện và định lượng đồng thời nhiều chất trong mẫu phức tạp với giới hạn phát hiện thấp, giảm thiểu sai số do ma trận mẫu.

3. Quy trình xử lý mẫu ảnh hưởng thế nào đến kết quả phân tích?
   Quy trình xử lý mẫu tối ưu giúp loại bỏ tạp chất, tăng hiệu suất thu hồi chất phân tích, giảm nhiễu nền, từ đó nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.

4. Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của ochratoxin A tại Việt Nam là bao nhiêu?
   MRL của ochratoxin A được quy định khác nhau tùy loại thực phẩm, ví dụ: 5 µg/g đối với ngũ cốc chưa qua chế biến, 3 µg/g đối với ngũ cốc và bột ngũ cốc, 2 µg/g đối với rượu vang.

5. Làm thế nào để giảm thiểu nguy cơ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm?
   Bảo quản nông sản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát, kiểm soát độ ẩm, sử dụng kỹ thuật xử lý và bảo quản phù hợp, đồng thời giám sát định kỳ để phát hiện sớm và xử lý kịp thời.

Kết luận

• Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) được xây dựng và tối ưu thành công để xác định ochratoxin A và B trong thực phẩm với độ nhạy cao và độ chính xác tốt.
• Quy trình xử lý mẫu bằng chiết chloroform kết hợp NaHCO3 1% và làm sạch bằng cột C18 cho hiệu suất thu hồi trên 80%.
• pH môi trường chiết mẫu ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết, môi trường axit pH 1-2 là tối ưu.
• Phân tích mẫu thực tế cho thấy tỷ lệ mẫu ngũ cốc nhiễm ochratoxin A chiếm khoảng 40%, trong đó có mẫu vượt mức dư lượng cho phép.
• Nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực kiểm nghiệm, giám sát an toàn thực phẩm và đề xuất các giải pháp kiểm soát ochratoxin hiệu quả tại Việt Nam.

Hành động tiếp theo: Áp dụng phương pháp trong giám sát thực phẩm rộng rãi, hoàn thiện quy chuẩn pháp lý, đồng thời triển khai các chương trình đào tạo và tuyên truyền nâng cao nhận thức cộng đồng về an toàn thực phẩm. Đề nghị các cơ quan chức năng và doanh nghiệp phối hợp thực hiện để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TONG QUAN.1 Giới thiệu chung [14- l Š].2 Tính chất hóa lý của Ochratoxins.-cccc 222cc sss2 5 1.3 Giới han tồn dư tối đa cho phép (MRL).2 Các phương pháp xác định.1 Phuong phap ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).2 Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC) .3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cột ái lực miễn Cich 8P.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phỗ.------ << << <<<< 10 Chương 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu.1 Đối tượng nghiên cứu.2 Nội dung nghiên cứỨu.2 Phương pháp nghiên cứu.1 Phương pháp tách chiết mẫu.2 Phương pháp sắc ký lồng khối phổ.1 Hệ thong sắc ký lỏng hiệu nding CA0.3 Phương tiện nghiên cứu.cccằ ene eens 20 2.1 Thiết bị, dụng cụ.--- << << 5c se seeeessse 20 "5h: na. 20 PIN DUNG CU.2 Dung môi, hóa chất. L0 122011221111 TH TT ng TT nàn 22 Chương 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN.--c c2 222cc sà2 23 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình 3.1 Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS.1 Tối ưu các điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS.1 Khảo sát ion mẹ Và ION COH.2 Toi ưu các điều kiện MMS.2 Tối ưu các điều kiện chạy sắc ky long hiệu năng cao (HPLC).2 Khảo sát thành phân pha động.3 Khảo sát tốc độ pha đỘng.4 Chọn chương trình chạy grddÏ€Hf.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu.1 Chọn quy trình xử lý mẫu.2 Khảo sát thể tích (số lần chiết) dung môi chiết.3 Chọn cột chiết pha ——— 36 3.4 Khao sát tốc độ qua cột chiết pha răn.5 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải.6 Khảo sat ảnh hưởng pH trong quá trình chiết mẫu.3 Tham định phương pháp phân tích.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc.2 Giới han phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).3 Xác định khoảng tuyến tính.4 Xây dựng đường chuẩn.4 Phân tích mẫu thực tẾ. - -LLc 2211111222211 111 nhớ 52 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ.-LL 2272211112222 se 57 TÀI LIEU THAM KHẢO.

2-5252 SS SE 2EE2EE2EE9EEEEEE2E1211211211211271 E1. ec ccce 63 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình _ ĐANHMỤC TỪ VIET TAT _ Kýhiệu | Tiêng Anh Tiêng Việt CE Collision energy Năng lượng va chạm EI Electron Ionization lon hóa bằng dòng electron ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu HPLC High performance liquid Sac ky long hiéu nang cao chromatography IUPAC International Union of Pure and Liên minh quốc tê về hóa học Applied Chemistry cơ ban va ứng dụng LOD Limit of detection Gidi han phat hién LOQ Limit of quantity Giới han định lượng MeOH Methanol metanol MRL Maximum Residue Limit Giới han du lượng toi da PSA Primary and secondary amine Cac amin bac 1, bac 2 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SPE solid phase extraction Chiết pha rắn IARC International Agency for Research on | Tô chức nghiên cứu ung thư Cancer quốc tế UPLC- Ultral performance liquid Sac ky lỏng siêu hiệu năng kết MS/MS_. | chromatography tandem mass nối khối phổ spectrometry RF Fluorescence detector Huynh quang Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình DANH MỤC CAC BANG Trang Bang 1.1: Mức dư lượng tôi đa cho phép của ochratoxin A ở Việt Nam 7 Bảng 2.1: Bảng pha dung dich chuẩn chạy máy 22 Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chat 23 Bảng 3.2: Các thông số tối ưu cho ESI-MS/MS 23 Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS 26 Bảng 3.4: Chương trình chạy gradient 28 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát thành phần pha động 28 Bảng 3.6: Khảo sat các chương trình gradient 31 Bảng 3.7: Chương trình gradient tối ưu 32 Bảng 3.8: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 34 Bảng 3.9 : Khảo sát thê tích dung môi chiết 36 Bảng 3.10: Khảo sát cột chiết pha rắn 37 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của tốc độ rửa giải tới hiệu suất của quá trình chiết 37 mau Bảng 3.12: Kết quả khảo sát thé tích dung dịch rửa giải 38 Bảng 3.13: lon mẹ và hai ion con của các chất trong nhóm ochratoxins 42 Bảng 3.14: Kết quả xác định LOD, LOQ của ochratoxin A, B + Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ 46 Bảng 3.16: Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp 50 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình DANH MỤC HÌNH VE Trang Hình 1.1: Cấu trúc các ochratoxins 4 Hình 2.1: Mô hình hệ thống LC-MS 11 Hình 2.2: So đồ đơn giản của hệ thống sắc ky long 11 Hình 2.3: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS 13 Hình 2.4: Bộ nguồn ion hoá 14 Hình 2.5: Bộ phân tích tứ cực 16 Hình 2.6: Mô hình bộ phận phân tích rứ cực chặp ba 17 Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của các ochratoxins 24 Hình 3.2: Sac đồ cua ochratoxin A, B nông độ 10 ppb khi dung dung môi pha động là 29 CH3COONH, 10mM Hình 3.3: Sắc đồ rửa giải các chất tai tốc độ dòng 0,8 ml/phút 29 Hình 3.4: Sắc đồ rửa giải các chất tại tốc độ dòng 1,0 ml/phút 30 Hình 3.5: Sắc đồ rửa giải các chat tai tốc độ dòng 1.2 ml/phút 30 Hình 3.6: Sắc đồ khi chạy sắc ký bằng chương trình gradient 1 32 Hình 3.7: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 35 Hình 3.8: Đồ thị sự phụ thuộc của diện tích pic vào giá trị pH chiết mẫu 40 Hình 3.9: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 4I Hình 3.10: Sắc đồ mẫu trắng 43 Hình 3.11: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn 2.12: Sắc đồ ochratoxins tại LOD 44 Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ OTA 46 Hình 3.14: Đồ thị sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ OTB 47 Hình 3.15: Đường chuan của OTA 41 Hình 3.16: Đường chuẩn của OTB 48 Hình 3.17: Sắc đồ OTs tại mức thêm chuẩn 2,5 ppb 52 Hình 3.18: Sắc đồ mẫu rượu không có ochratoxin A,B 54 Hình 3.19: Sắc đồ mẫu ngô không có ochratoxin A,B 54 Hình 3.20: Sắc đồ mẫu lạc không có ochratoxin A,B 54 Hình 3.21: Sắc đồ mẫu lac có ochratoxin A 55 Hình 3.22: Sắc đồ mẫu ngô có ochratoxin A,B 55 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình MỞ DAU Vẫn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm bởi nó liên quan trực tiếp tới sức khỏe của tất cả người tiêu dùng. Thời gian vừa qua trong nước liên tiếp phát hiện các vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có các vụ ngộ độc mycotoxin đặc biệt nghiêm trọng .đã gây ra tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng khi lựa chọn thực phẩm cũng như sử dụng thực phẩm thế nào là đúng cách.

Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm về các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây trên cả nước: - Năm 2009: Toàn quốc xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, có 5026 người mac; 3958 người nhập viện; 33 người tử vong. - Năm 2010: Tình hình NĐTP trong năm 2010 phức tạp. Toàn quốc đã xảy ra 175 vụ ngộ độc trong đó có 34 vụ ngộ độc trên 30 người làm 5664 người mặc 42 trường hợp tử vong, so sánh với số liệu trung bình trên năm của giai đoạn 2006- 2009, số vụ ngộ độc giảm 9,1%; số mắc giảm 17,6% và số tử vong giảm 19,2%. - Năm 2011: 148 vụ, 4700 người mắc, 27 người tử vong.

- Năm 2012: 168 vụ, 5541 người mắc, 34 người tử vong. Theo TS Trần Quang Trung, Cục trưởng Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, trong 9 tháng của năm 2013, cả nước đã có 108 vụ ngộ độc thực phẩm làm hơn 2.800 người mắc, trong đó có 18 ca tử vong. Trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm được thống kê trong quý III này thì nguyên nhân do vi sinh vật là 23 vụ, do độc tố tự nhiên 4 vụ, do hóa chất 2 vụ và 11 vụ chưa xác định được nguyên nhân. Các vụ ngộ độc xảy ra khắp nơi, từ gia đình riêng đến tập thé.

Ochratoxin là một loại độc tố được sinh ra bởi các chủng nắm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus va Penicillium verrucusum và là loại độc tố có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc va các sản phẩm của chúng. Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm ochratoxin nó không gây ngộ Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ân đe dọa sức khỏe cho con người.000 loại nắm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có hại đối với gia súc gia cầm và con người. Các loại nắm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là Mycotoxin.

Mycotoxin là chất độc sinh ra từ nắm mốc , được hình thành khi nắm chuyên hóa các chất dinh đưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu. Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thé giới có chứa một hàm lượng mycotoxin ở một mức độ nào dé. Tùy vào địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau. Ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới, nguy cơ nhiễm mycotoxin càng cao.

Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tình trạng nhiễm độc tố nắm mốc là khá phổ biến. Sự hình thành nam mốc và độc tố của chúng có thé bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trong khi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi. Như vậy, không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nắm mốc và độc tố từ chúng, và tác hại của chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe COn người. Dé kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thé giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng.

Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý dé phát hiện và định lượng nồng độ ochratoxin ở lượng vết hay siêu vết. Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích, chúng tôi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lóng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)”. Mục tiêu của thực hiện đề tài nghiên cứu là: 1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: - Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình - Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu.

- Tham định phương pháp đã xây dựng.