Nghiên cứu và Xác định Gen Waxy, Opaque-2 trên Bắp bằng

LỜI CẢM ƠN

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. Tính cấp thiết đề tài

1.2. Mục đích nghiên cứu

1.3. Khả năng ứng dụng đề tài

1.4. Giới hạn đề tài

2. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN

2.1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.2. Định nghĩa – Tầm quan trọng

2.1.3. Nguồn gốc

2.1.4. Vai trò của bắp

2.1.5. Nguồn gốc phát sinh – Đặc tính

3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu

3.1.1. Vật liệu thực vật

3.1.2. Mồi sử dụng cho nghiên cứu

3.1.3. Hóa chất để tách chiết DNA

3.1.4. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR

3.1.5. Hóa chất dùng cho điện di agarose và polyacrylamide

3.1.6. Hóa chất để nhuộm bạc nitrate trên gel polyacrylamide

3.1.7. Thiết bị và dụng cụ

3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA genome của các giống bắp

3.2.2. Quy trình phản ứng PCR-SSR

3.2.3. Phương pháp tối ưu quy trình PCR-SSR

3.2.4. Phương pháp điện di và đọc kết quả sản phẩm PCR-SSR

3.2.5. Phương pháp nhuộm gel sử dụng bạc nitrate

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả xây dựng quy trình PCR-SSR

4.1.1. Kết quả tách chiết DNA

4.1.2. Kết quả đánh giá sơ bộ về mồi phi057 và phi061

4.1.3. Kết quả tối ưu phản ứng PCR-SSR

4.1.3.1. Thí nghiệm 1: Tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi phi057 và phi061

4.1.3.2. Thí nghiệm 2: Tối ưu nồng độ enzyme cho phản ứng PCR-SSR với 2 cặp mồi phi057 và phi061

4.1.3.3. Thí nghiệm 3: Tối ưu nồng độ mồi phi057 và phi061

4.1.3.4. Kết quả khảo sát độ lập lại của quy trình tối ưu ở trên

4.2. Kết quả sử dụng quy trình xác định gen opaque-2 đánh giá 14 giống bắp

4.3. Kết quả sử dụng quy trình xác định gen waxy đánh giá 14 giống bắp

5. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Gen Waxy Opaque 2 Trên Bắp 55

Bắp (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, có tốc độ tăng trưởng cao về sản lượng và năng suất. Bắp đóng vai trò quan trọng trong nguồn lương thực cho con người, thức ăn cho gia súc và nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học. Riêng đối với bắp nếp, đặc tính dẻo thơm ngon làm tăng nhu cầu sử dụng để ăn tươi và chế biến. Tính chất đặc biệt trong tinh bột của bắp nếp là do enzyme GBSS (Granule Bound Starch Synthase) được tổng hợp bởi gen trội Waxy. Gen Waxy thường xuất hiện đột biến, ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme GBSS, làm giảm hoặc bất hoạt hoàn toàn việc tổng hợp amylose và dẫn đến tăng hàm lượng amylopectin, làm cho bắp dẻo hơn. Tuy nhiên, bắp nếp lại thiếu nhiều loại acid amin thiết yếu. Một số loại bắp chứa yếu tố QPM (Quality Protein Maize), có hàm lượng các loại acid amin không thay thế như: lysine, tryptophan và methionine lớn hơn gấp đôi so với bắp thường. Cơ chế của quá trình này là do gen opaque-2 (O2). Khi gen O2 xảy ra đột biến thành gen lặn (o2), ở bắp QPM sẽ làm ức chế quá trình mã hóa protein zein, làm tăng hàm lượng các protein khác và tăng hàm lượng lysine và tryptophan. Tuy vậy, đây thường là bắp tẻ nên hạt cứng, không thơm ngon. Do đó, nhu cầu tạo ra giống bắp lai mới kết hợp các đặc tính dẻo của bắp nếp với yếu tố QPM ở một số giống bắp tẻ là rất cần thiết.

1.1. Tình hình Nghiên Cứu Gen Waxy Opaque 2 Trên Thế Giới

Trên thế giới, các nhà nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện gen waxy và gen opaque-2, khắc phục nhược điểm trong công tác chọn tạo bắp lai waxy-QPM theo phương pháp truyền thống. Một nhóm nghiên cứu đã sử dụng marker SSR: phi022, phi027 và phi061 liên kết với locus waxy để nhận diện các biến thể alen SSR liên kết với gene lặn waxy bằng cách thiết kế các cặp mồi để khuếch đại các đoạn SSR liên kết với locus waxy này. Năm 2007, Liu và cộng sự đã thiết kế 4 cặp mồi và dùng phương pháp TAIL-PCR để phân biệt 13 dòng bắp nếp và 2 dòng bắp tẻ ở Trung Quốc. Peeranuch Jompuk (2006) và Đặng Ngọc Chi (2010) đã sử dụng marker SSR phi057, phi112 và umc1066 liên kết với gen opaque-2 để nhận diện alen lặn opaque-2. Kết quả chỉ có 2 mồi có thể phân biệt bắp QPM và bắp non-QPM là phi057 và phi112.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Việc Nghiên Cứu Gen Waxy và Opaque 2

Bắp là cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu. Trên thế giới, cây bắp đứng thứ ba về diện tích trồng, thứ hai về sản lượng và thứ nhất về năng suất. Cây bắp được du nhập vào Việt Nam khoảng 300 năm trước. Mặc dù là cây đứng thứ hai sau lúa nhưng do truyền thống của người Việt nên không được chú trọng và chưa phát huy tiềm năng. Những năm gần đây, nhờ những chính sách và chủ trương của nhà nước ta nên cây bắp có những tiến bộ vượt bậc về năng suất, diện tích cũng như sản lượng. Bắp nếp waxy và bắp QPM có vai trò quan trọng trong đời sống con người. Nhu cầu nghiên cứu để lai tạo nhanh giống bắp waxy-QPM càng trở nên cấp thiết. Nghiên cứu di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử giúp tăng tốc quá trình chọn tạo giống mới.

II. Thách Thức Trong Xác Định Gen Bắp Bằng Phương Pháp Truyền Thống 58

Việc tạo ra một giống bắp nếp lai QPM bằng phương pháp lai và chọn lọc kiểu hình truyền thống tốn nhiều thời gian và tốn kém, đặc biệt là phải trải qua nhiều giai đoạn tự thụ phấn để chọn lọc các tính trạng mong muốn vì cả hai tính trạng này đều do gen lặn quy định. Bắp nếp là kết quả đột biến đơn gen từ bắp thường, đó chính là do đột biến gen trội Wx thành gen lặn wx. Vì đây là một loại bắp tẻ nên hạt thường cứng, không thơm ngon nên thường không được sử dụng để ăn tươi hay chế biến làm thực phẩm cho con người. Việc phân tích kiểu hình yêu cầu nhiều thời gian và nguồn lực. Do đó, các phương pháp chọn giống truyền thống gặp nhiều khó khăn trong việc kết hợp các tính trạng mong muốn. Chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat) giúp khắc phục nhữ ng yếu điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Chọn Lọc Kiểu Hình Truyền Thống

Phương pháp chọn lọc kiểu hình đòi hỏi theo dõi và đánh giá các tính trạng mong muốn trên từng cá thể thực vật trong nhiều thế hệ. Quá trình này tốn nhiều thời gian, công sức và chi phí. Ngoài ra, các tính trạng kiểu hình có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, dẫn đến kết quả không chính xác. Việc chọn lọc các giống bắp có cả tính trạng waxy và QPM trở nên khó khăn hơn do cả hai tính trạng đều là gen lặn.

2.2. Tại Sao Cần Kỹ Thuật Marker Phân Tử Trong Nghiên Cứu Bắp

Sự phát triển của các kỹ thuật marker phân tử có thể khắc phục những yếu điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống. Marker phân tử cho phép xác định sự hiện diện của các gen mong muốn một cách nhanh chóng và chính xác, không phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Điều này giúp rút ngắn thời gian và giảm chi phí trong quá trình chọn tạo giống. Chỉ thị phân tử SSR là một công cụ hiệu quả để xác định gen waxy và gen opaque-2 trên bắp.

III. Phương Pháp PCR SSR Xác Định Gen Waxy Opaque 2 trên Bắp 57

Đề tài “Xây dựng quy trình xác định gene lặn waxy và gene opaque-2 bằng chỉ thị phân tử SSR trên bắp (Zea may L)” hướng đến cung cấp cho các nhà chọn giống ở Việt Nam một phương pháp hiện đại, hiệu quả, rút ngắn thời gian và kinh phí trong quy trình lai tạo các giống bắp nếp lai F1 có chất lượng protein cao (lysine và tryptophan). Phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR-SSR (Polymerase Chain Reaction - Simple Sequence Repeat) để khuếch đại các đoạn DNA chứa marker SSR liên kết với gen waxy và gen opaque-2. Kết quả PCR được phân tích bằng điện di để xác định sự hiện diện của các alen đặc trưng cho từng gen. PCR giúp khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu, giúp dễ dàng phát hiện và phân tích. Các marker SSR có tính đa hình cao, cho phép phân biệt các giống bắp khác nhau.

3.1. Tổng Quan Về Kỹ Thuật PCR SSR Trong Di Truyền Học

PCR-SSR là một kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên việc khuếch đại các đoạn DNA chứa các đoạn lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats - SSRs) bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Các SSRs là các đoạn DNA ngắn (thường là 2-6 base pairs) lặp lại nhiều lần. Kỹ thuật PCR-SSR được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của di truyền học, bao gồm lập bản đồ di truyền, phân tích đa dạng di truyền, và xác định nguồn gốc gen.

3.2. Quy Trình Thực Hiện PCR SSR Để Xác Định Gen Waxy và Opaque 2

Quy trình thực hiện PCR-SSR bao gồm các bước chính sau: thu thập mẫu bắp, chiết xuất DNA, thiết kế mồi (primers) đặc hiệu cho các marker SSR liên kết với gen waxy và gen opaque-2, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu, điện di sản phẩm PCR để phân tách các đoạn DNA theo kích thước, và phân tích kết quả điện di để xác định sự hiện diện của các alen đặc trưng cho từng gen. Thành phần phản ứng PCR gồm: DNA khuôn, mồi, enzyme polymerase, nucleotide và buffer. Chu trình nhiệt PCR gồm: biến tính, bắt cặp và kéo dài.

IV. Ứng Dụng PCR SSR Xác Định Gen Opaque 2 Đánh Giá 14 Giống Bắp 59

Kết quả sử dụng quy trình xác định gen opaque-2 đánh giá 14 giống bắp cho thấy sự khác biệt về kiểu gen giữa các giống. Một số giống mang alen lặn opaque-2 (o2), chỉ thị cho khả năng có hàm lượng protein cao (QPM). SSR phi057 và phi112 liên kết với gen opaque-2 có thể phân biệt bắp QPM và bắp non-QPM. Việc xác định gen opaque-2 trong các giống bắp là bước quan trọng trong việc chọn tạo các giống bắp có giá trị dinh dưỡng cao. Điều này giúp cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy thức ăn gia súc, nhà máy sản xuất rượu cồn, tinh bột, dầu…

4.1. Kết Quả Phân Tích SSR Của 14 Giống Bắp

Phân tích SSR cho thấy sự đa dạng về kiểu gen giữa các giống bắp khác nhau. Các marker SSR phi057 và phi112 có thể phân biệt các giống bắp QPM và non-QPM. Dữ liệu này cung cấp thông tin quan trọng cho các nhà chọn giống trong việc lựa chọn các giống bắp phù hợp cho chương trình lai tạo. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 14 giống bắp được hiển thị trên gel agarose và polyacrylamide.

4.2. Ý Nghĩa Của Việc Xác Định Gen Opaque 2 Trong Chọn Giống Bắp

Việc xác định gen opaque-2 trong các giống bắp có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện giá trị dinh dưỡng của bắp. Các giống bắp QPM có hàm lượng lysine và tryptophan cao, là những acid amin thiết yếu cho sức khỏe con người và vật nuôi. Chọn tạo các giống bắp QPM giúp nâng cao chất lượng dinh dưỡng của thức ăn gia súc và thực phẩm cho con người. Giúp giảm thiểu tình trạng thiếu dinh dưỡng ở những khu vực mà bắp là lương thực chính.

V. Triển Vọng Lai Tạo Bắp Nếp QPM Bằng Chỉ Thị Phân Tử SSR 60

Đề tài còn cung cấp một số thông tin về các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp. Các marker SSR liên kết với gen waxy và gen opaque-2 có thể được sử dụng để chọn lọc các cá thể có kiểu gen mong muốn trong các quần thể lai. Ứng dụng chỉ thị phân tử giúp chọn lọc các cá thể có kiểu gen mong muốn từ giai đoạn sớm. Điều này giúp giảm thiểu thời gian và chi phí trong quá trình chọn tạo giống. Nghiên cứu di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các giống bắp lai chất lượng cao.

5.1. Ưu Điểm Của Việc Sử Dụng Chỉ Thị Phân Tử SSR Trong Lai Tạo Bắp

Việc sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong lai tạo bắp mang lại nhiều ưu điểm so với phương pháp truyền thống, bao gồm: tăng tốc quá trình chọn tạo giống, giảm chi phí, tăng độ chính xác, và cho phép chọn lọc các tính trạng khó quan sát bằng mắt thường. Giúp tạo ra các giống bắp lai có năng suất cao, chất lượng tốt, và khả năng chống chịu sâu bệnh tốt.

5.2. Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Về Gen Waxy Và Opaque 2 Trên Bắp

Các hướng phát triển nghiên cứu về gen waxy và gen opaque-2 trên bắp bao gồm: tìm kiếm các marker phân tử mới có độ chính xác cao hơn, nghiên cứu về cơ chế điều hòa biểu hiện của gen waxy và gen opaque-2, và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác như CRISPR-Cas9 để chỉnh sửa gen waxy và gen opaque-2. Tiếp tục nghiên cứu và cải tiến phương pháp để tạo ra các giống bắp chất lượng cao đáp ứng nhu cầu thị trường.

Xây dựng quy trình xác định gen lặn waxy và gen opaque 2 bằng chỉ thị phân tử ssr trên bắp zea may l