Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Progesteron (PGT; Pregn-4-en-3,20-dion; công thức phân tử $\text{C}{21}\text{H}{30}\text{O}_2$, phân tử lượng 314,47 g/mol) là một hormon steroid nội sinh do hoàng thể, nhau thai và tuyến thượng thận bài tiết, giữ vai trò sinh lý then chốt trong việc làm dày nội mạc tử cung, duy trì thai kỳ và điều hòa chu kỳ sinh sản ở nữ giới. Trong thực hành điều trị, dược chất được chỉ định cho các trường hợp dọa sảy thai, sảy thai liên tiếp, rối loạn kinh nguyệt, hỗ trợ sinh sản và liệu pháp thay thế hormon thời kỳ tiền mãn kinh. Tuy nhiên, progesteron thuộc nhóm hoạt chất khó tan trong nước (độ tan chỉ đạt từ 7,00 đến 8,81 mg/l), tính thân dầu cao ($\log P = 3,87$), đồng thời chịu sự chuyển hóa bước một rất mạnh qua gan bởi enzym $5\alpha$-reductase (chiếm 60–65% quá trình chuyển hóa), dẫn đến sinh khả dụng đường uống rất thấp, chỉ đạt khoảng 2,4%.

Để khắc phục rào cản về độ tan, nghiên cứu trước đó của ThS. Vũ Thị Thanh Thủy đã bước đầu thiết lập công thức hệ nano tự nhũ hóa (SNEDDS) chứa progesteron, giúp nâng độ tan của dược chất lên khoảng 18.000 lần. Dù vậy, các hệ phân phối thuốc dựa trên lipid (LBFs) khi đi vào lòng ruột non sẽ tương tác trực tiếp với dịch tụy và muối mật. Quá trình tiêu hóa enzym này làm thay đổi sâu sắc cấu trúc pha và khả năng hòa tan của hệ keo, dễ khiến dược chất rơi vào trạng thái siêu bão hòa không bền vững và bị tái kết tinh, làm suy giảm hiệu quả hấp thu in vivo. Mặt khác, các phương pháp thử độ hòa tan in vitro quy ước (thiết bị USP I, II) không phản ánh được sự biến đổi enzym của lipid trong đường tiêu hóa. Tại Việt Nam, việc ứng dụng mô hình ly giải lipid in vitro (in vitro lipid digestion) để dự đoán số phận dược chất trong hệ tự nhũ hóa chưa từng được triển khai. Đồng thời, việc phát triển dạng bào chế viên nang mềm đóng hệ dịch lỏng SNEDDS với vỏ gelatin có khả năng ức chế tái kết tinh dược chất cần được chứng minh bằng thực nghiệm và thẩm định sinh khả dụng in vivo.

Khóa luận xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Nghiên cứu hoàn thiện công thức bào chế hệ nano tự nhũ hóa (SNEDDS) thông qua đánh giá quá trình ly giải lipid in vitro.
  2. Nghiên cứu bào chế viên nang mềm chứa SNEDDS progesteron bằng phương pháp nhúng khuôn và đánh giá tác dụng ức chế tái kết tinh dược chất của gelatin.
  3. Nghiên cứu so sánh sinh khả dụng in vivo của hệ nano tự nhũ hóa chứa progesteron với viên đối chiếu (Utrogestan® 100 mg) và mẫu progesteron nguyên liệu trên mô hình thỏ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Dược chất progesteron (đạt tiêu chuẩn USP 41, Hubei Gedian Humanwell), chế phẩm thương mại đối chiếu viên nang Utrogestan® 100 mg (Besins - Pháp, SĐK/Số lô: 5162, HSD: 9/2023), các tá dược pha dầu, chất diện hoạt, đồng dung môi và phụ gia tạo vỏ nang (Acid oleic, Tween 80, Ethanol, Gelatin, Glycerin, Methyl paraben, Propyl paraben, Pancreatin chiết xuất tụy lợn, Natri taurodeoxycholat - NaTDC, Phospholipid - PC). Động vật thực nghiệm là thỏ trắng giống đực trưởng thành (4–6 tháng tuổi, khối lượng 2–3 kg).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (Viện KN ATVSTPQG); hoàn thành vào tháng 6 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên Hệ thống phân loại công thức lipid (Lipid Formulation Classification System - LFCS) do C. Pouton đề xuất (2000, 2006). Các hệ tự nhũ hóa thuộc nhóm II và III trong LFCS bao gồm hỗn hợp đồng nhất giữa dầu, chất diện hoạt và đồng dung môi, có khả năng tự phân tán tạo thành nhũ tương nano (SNEDDS, kích thước hạt 100–250 nm) khi tiếp xúc với dịch tiêu hóa. Dưới tác động của lipase tuyến tụy (hoạt hóa ở vị trí sn-1 và sn-3 của triglycerid) cùng muối mật và phospholipid nội sinh, các sản phẩm ly giải (acid béo tự do, monoglycerid) hình thành các cấu trúc keo micell hỗn hợp và vesicles. Các cấu trúc này giúp vượt qua lớp màng nhầy thân nước ở diềm bàn chải ruột non và thúc đẩy tái tổng hợp triglycerid, gắn kết vào chylomicron để vận chuyển ưu tiên qua hệ bạch huyết ruột ($\log P > 5$, độ tan trong lipid $> 50\text{ mg/g}$), từ đó tránh được chuyển hóa bước một qua gan.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp bào chế:

    • Bào chế hệ SNEDDS: Phối hợp đồng nhất pha dầu (Acid oleic), chất diện hoạt (Tween 80) và đồng dung môi (Ethanol) bằng máy khuấy từ; hòa tan hoàn toàn progesteron ở nhiệt độ phòng.
    • Bào chế vỏ và đóng nang mềm: Bào chế dịch vỏ nang từ Gelatin (45%), Glycerin (15%), Methyl paraben (0,15%), Propyl paraben (0,03%) và nước tinh khiết (39,82%) ở 65–75°C. Tạo vỏ nang bằng phương pháp nhúng khuôn kim loại hình trái xoan ở 50°C; sấy khô vỏ nang trong bình hút ẩm đến khi độ ẩm đạt 5–8%; đóng dịch nhân SNEDDS bằng bơm tiêm và hàn kín miệng nang bằng nhiệt.

  • Phương pháp đánh giá in vitro:

    • Thẩm định phương pháp định lượng HPLC: Thiết bị Shimadzu, cột Agilent C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$), pha động Methanol : Nước (80:20 v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nhiệt độ cột 40°C, thể tích tiêm $20\ \mu\text{l}$, phát hiện bằng detector UV ở bước sóng 254 nm.
    • Mô hình một ngăn đánh giá ly giải lipid in vitro: Mẫu thử ($1\text{ g}$) được phân tán trong 36 ml đệm ruột non mô phỏng (Tris maleat 2 mM, $\text{CaCl}_2\cdot 2\text{H}_2\text{O}$ 1,4 mM, NaCl 150 mM, NaTDC 3 mM, PC 0,75 mM) ở 37°C, tốc độ khuấy 450 vòng/phút. Quá trình tiêu hóa kích hoạt bằng 4 ml dịch chiết pancreatin (hoạt độ lipase $> 800\text{ U/ml}$). Duy trì pH cố định ở 6,5 bằng máy chuẩn độ pH-stat với dung dịch NaOH 0,2M. Sau 30 phút, ức chế phản ứng bằng dung dịch acid 4-bromophenylboronic 1,0M, ly tâm phân đoạn (5000 vòng/phút, 30 phút) để tách và định lượng progesteron trong 3 pha: pha dầu, pha keo và pha tủa.
    • Đo kích thước giọt và thế zeta: Phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Malvern Zetasizer Nano ZS90.
    • Đánh giá khả năng ức chế tái kết tinh: Phương pháp thay đổi dung môi (solvent shift) trên thiết bị hòa tan Erweka-DT (500 ml đệm phosphat pH 6,8, 37°C, cánh khuấy 100 vòng/phút). Đo kích thước hạt tủa bằng thiết bị tán xạ laser Malvern Mastersizer 3000E kết hợp buồng đo Hydro EV; xác định mức độ siêu bão hòa ($DS$) qua nồng độ PGT hòa tan lọc qua màng $0,20\ \mu\text{m}$.
    • Đánh giá tương tác liên kết hydro: Quét phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên thiết bị FT-IR 6700 ở dải số sóng $600 - 4000\text{ cm}^{-1}$ với viên nén mẫu dập trong KBr.
    • Đánh giá độ giải phóng in vitro: Thiết bị Erweka-DT cánh khuấy, 900 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8 ở $37 \pm 0,5^\circ\text{C}$, tốc độ khuấy 100 vòng/phút (có bổ sung pepsin đối với mẫu vỏ nang không rã).

  • Phương pháp đánh giá in vivo và phân tích dược động học:

    • Thiết kế nghiên cứu trên thỏ: 11 thỏ trắng đực (nhịn ăn 12 giờ) chia thành 3 lô song song: Lô 1 uống SNEDDS F3 liều 2,5 mg/kg ($n=3$); Lô 2 uống dịch nhân Utrogestan® 100 mg liều 10 mg/kg ($n=5$); Lô 3 uống progesteron nguyên liệu liều 10 mg/kg ($n=3$). Lấy mẫu máu qua tĩnh mạch tai tại các thời điểm 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360 phút.
    • Chiết tách và định lượng LC-MS/MS: Xử lý huyết tương bằng phương pháp QuEChERS (chiết bằng acetonitril, phân tách muối $\text{MgSO}_4$ và NaCl) với chất nội chuẩn đồng vị progesteron-$\text{d}_9$ ($\text{PGT-d}_9$). Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ Agilent LC-MS/MS, cột Agilent Eclipse XDB-C18 ($3,0 \times 150\text{ mm}$, $3,5\ \mu\text{m}$), rửa giải gradient acetonitril và dung dịch acid formic 0,1%.
    • Xử lý dữ liệu: Phần mềm Agilent MassHunter Quantitative Analysis (tính nồng độ), Microsoft Excel 2016 (thống kê) và phần mềm Phoenix 8 (mô hình hóa và tính toán các thông số dược động học $C_{\max}$, $T_{\max}$, $\text{AUC}_{0-\infty}$).

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa các dữ liệu khoa học về đặc tính lý hóa, dược động học và dược lý của progesteron. Tác giả phân tích cơ sở phân loại LBFs theo Pouton, cơ chế tự nhũ hóa tạo nhũ tương nano, và lộ trình hấp thu lipid qua tế bào biểu mô ruột non vào hệ bạch huyết. Chương này cũng tổng hợp các mô hình ly giải lipid in vitro (mô hình 1 ngăn tĩnh, 1 ngăn động bổ sung $\text{Ca}^{2+}$ liên tục, và mô hình 2 ngăn dạ dày - ruột), đồng thời làm rõ các yếu tố kỹ thuật tác động đến hiệu suất ly giải gồm: nồng độ muối mật (NaTDC), hoạt độ pancreatin, nồng độ ion $\text{Ca}^{2+}$, thể tích đệm và hàm lượng dược chất tải trong hệ.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ danh mục 23 loại hóa chất, nguyên liệu và 14 hệ thống thiết bị thực nghiệm được sử dụng. Quy trình bào chế hệ SNEDDS và viên nang mềm bằng phương pháp nhúng khuôn được tiêu chuẩn hóa từng bước. Tác giả xây dựng chi tiết quy trình thẩm định HPLC, quy trình thử nghiệm ly giải lipid in vitro 1 ngăn, phương pháp thay đổi dung môi xác định mức độ siêu bão hòa ($DS$), phương pháp quét phổ FT-IR, mô hình thử giải phóng in vitro và thiết kế thử nghiệm dược động học in vivo trên thỏ kèm phương pháp chiết QuEChERS và định lượng LC-MS/MS.

Kết quả và bàn luận

1. Thẩm tra phương pháp định lượng

  • Phương pháp HPLC định lượng progesteron đạt độ lặp lại cao với RSD của thời gian lưu ($t_R = 6,99\text{ phút}$) là 0,17% và RSD diện tích pic là 0,04% ($n=6$). Phương trình hồi quy tuyến tính trong khoảng nồng độ $6,0 - 150,0\ \mu\text{g/ml}$ đạt $y = 51244x + 41829$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9998$.
  • Phương pháp LC-MS/MS định lượng trong huyết tương thỏ sử dụng chất nội chuẩn $\text{PGT-d}_9$ xây dựng đường chuẩn trong khoảng $2 - 2000\text{ ng/ml}$ cho phương trình $y = 0,012x + 0,0024$ với $R^2 = 0,9997$.

2. Hoàn thiện công thức hệ nano tự nhũ hóa qua ly giải lipid in vitro

  • Đánh giá mô hình tiêu hóa: Thí nghiệm có dịch tụy và muối mật cho tốc độ tiêu thụ NaOH 0,2M cao hơn hẳn thí nghiệm đối chứng không enzym/muối mật, đồng thời làm giảm rõ rệt tỷ lệ PGT kết tủa nhờ hình thành các cấu trúc micell hỗn hợp với acid béo tự do và lysophosphatidylcholin giải phóng từ Tween 80 và phospholipid.
  • Khảo sát hàm lượng dược chất: Đánh giá 3 công thức có cùng tỷ lệ tá dược mang (Acid oleic 360 mg, Tween 80 135 mg, Ethanol 405 mg) với các hàm lượng progesteron khác nhau: F1 (100 mg), F2 (50 mg), F3 (25 mg). Cả 3 mẫu đều tiêu thụ lượng thể tích NaOH 0,2M tương đương sau 30 phút ($0,8\text{ ml}$), chứng minh mức độ tiêu hóa tổng thể không đổi. Tuy nhiên, hàm lượng dược chất cao ở F1 làm chậm tốc độ ly giải ban đầu do tủa PGT bao bọc bề mặt giọt dầu.
  • Sau ly giải, cả 3 mẫu đều phân tách thành 2 pha (pha keo và pha tủa, không còn pha dầu tự do). Tỷ lệ dược chất duy trì trong pha keo tăng mạnh khi giảm hàm lượng PGT: F1 đạt 15,52%, F2 đạt 30,86%, và F3 đạt tới 73,40%. Độ hòa tan của PGT trong pha keo xác định được là $264,10 \pm 70,14\ \mu\text{g/ml}$, từ đó tính được tỷ lệ siêu bão hòa ($SR$) của F3 đạt cao nhất là 1,69. Kích thước giọt nhũ tương pha keo của F3 nhỏ nhất ($104,9\text{ nm}$, $\text{PDI} = 0,352$) so với F1 ($133,2\text{ nm}$, $\text{PDI} = 0,446$).
  • So sánh với viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg: Utrogestan® (chứa 36,8% PGT trong hỗn dịch dầu lạc và lecithin) tiêu thụ $0,92\text{ ml}$ NaOH 0,2M sau 30 phút nhưng tốc độ giải phóng chậm ở 5 phút đầu ($0,55\text{ ml}$ so với $0,73\text{ ml}$ của F3). Sau ly giải, Utrogestan® chỉ phân bố được 2,69% progesteron vào pha keo (so với 73,40% của F3), phần lớn dược chất bị giữ trong pha dầu chưa tiêu hóa và pha kết tủa do thiếu chất diện hoạt mạnh để phân tán.

3. Bào chế và đánh giá viên nang mềm chứa SNEDDS progesteron

  • Vỏ nang gelatin bào chế theo tỷ lệ Gelatin 45%, Glycerin 15%, Nước 39,82% đạt độ ẩm ổn định sau sấy là $6,53 \pm 1,04%$ (nằm trong tiêu chuẩn quy định 5–8%).
  • Ảnh hưởng của vỏ nang tới ly giải lipid: Khi bổ sung 1 g vỏ nang vào môi trường ly giải của F1, F2, F3, thể tích NaOH 0,2M chuẩn độ tăng lên tương ứng đạt 1,03 ml; 1,18 ml và 1,10 ml (do gelatin bị thủy phân giải phóng acid amin). Sự hiện diện của gelatin làm tăng lượng PGT và tỷ lệ $SR$ trong pha keo, giảm lượng tủa và giảm kích thước giọt nhũ tương.
  • Khả năng ức chế tái kết tinh: Phương pháp thay đổi dung môi cho thấy mức độ siêu bão hòa của PGT tăng theo tỷ lệ phối hợp gelatin, đạt $DS = 1,27$ ở tỷ lệ PGT : Gelatin = 1:18 tại thời điểm 30 phút. Kích thước hạt tủa sau 60 phút ở mẫu có gelatin (tỷ lệ 1:18) được kiểm soát ở mức $27,87 \pm 0,93\ \mu\text{m}$, trong khi mẫu không chứa gelatin tiếp tục kết tinh phát triển hạt thô đạt kích thước $60,8\ \mu\text{m}$.
  • Phân tích tương tác FT-IR: Phổ FT-IR của progesteron nguyên liệu thể hiện 2 đỉnh carbonyl đặc trưng tại $1701\text{ cm}^{-1}$ (carbonyl tự do vị trí C-20) và $1663\text{ cm}^{-1}$ (carbonyl liên hợp nối đôi vị trí C-3). Gelatin thể hiện đỉnh dao động của nhóm -OH và -NH tại $3547,09\text{ cm}^{-1}$. Ở các mẫu phối hợp PGT-Gelatin, đỉnh -OH/-NH của gelatin bị dịch chuyển mạnh xuống $3286,06 \pm 4,85\text{ cm}^{-1}$ và mở rộng, đồng thời các đỉnh carbonyl của PGT cũng bị biến đổi tương ứng, chứng minh sự hình thành liên kết hydro liên phân tử giữa nhóm hydroxyl/amino của gelatin với nhóm carbonyl của progesteron.
  • Độ giải phóng in vitro: Viên nang F3 giải phóng progesteron nhanh, đạt nồng độ tối đa 59,14% sau 45 phút và duy trì ổn định ở mức 55,14% sau 120 phút. Ngược lại, viên nang F1 đạt đỉnh 61,35% ở 30 phút nhưng nhanh chóng bị tủa lại, giảm xuống 22,14% ở 120 phút. Viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg chỉ giải phóng được 1,77% dược chất sau 120 phút trong cùng điều kiện thử nghiệm.

4. Đánh giá dược động học in vivo trên thỏ

Thử nghiệm trên thỏ cho thấy công thức SNEDDS F3 ở mức liều 2,5 mg/kg có tốc độ hấp thu vượt trội, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương chỉ sau 5 phút ($T_{\max} = 5 \pm 0\text{ phút}$), nhanh hơn Utrogestan® ($T_{\max} = 9 \pm 2,45\text{ phút}$) và PGT nguyên liệu ($T_{\max} = 25 \pm 10\text{ phút}$). Nồng độ đỉnh $C_{\max}$ của F3 đạt $711,04 \pm 267,13\text{ ng/ml}$, cao gấp 1,74 lần Utrogestan® và gấp 68,37 lần mẫu nguyên liệu.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu thực nghiệm, cung cấp các bằng chứng định lượng về hiệu quả của hệ tự nhũ hóa và vai trò của vỏ nang gelatin:

Chỉ số đánh giá in vitro Công thức F1 (100 mg PGT) Công thức F2 (50 mg PGT) Công thức F3 (25 mg PGT) Viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg
Tỷ lệ PGT phân bố trong pha keo (%) 15,52 30,86 73,40 2,69
Tỷ lệ PGT trong pha kết tủa/dầu (%) 84,48 69,14 26,60 97,31
Tỷ lệ siêu bão hòa ($SR$) trong pha keo 0,36 0,71 1,69 Chưa xác định
Kích thước giọt trung bình sau ly giải (nm) 133,2 119,7 104,9 112,9
Chỉ số đa phân tán ($\text{PDI}$) 0,446 0,369 0,352 0,571
Tỷ lệ PGT giải phóng sau 120 phút (%) 22,14 — 55,14 1,77

Kết quả đánh giá các thông số dược động học in vivo trên mô hình thỏ được tổng hợp như sau:

Thông số dược động học Hệ SNEDDS F3 Viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg Progesteron nguyên liệu
Liều dùng cho thỏ (mg/kg) 2,5 10,0 10,0
$C_{\max}$ ($\text{ng/ml}$) $711,04 \pm 267,13$ $407,74 \pm 322,15$ $10,40 \pm 1,46$
$T_{\max}$ (phút) $5 \pm 0$ $9 \pm 2,45$ $25 \pm 10$
$\text{AUC}_{0-\infty}$ ($\text{ng}\cdot\text{phút/ml}$) $9424,87 \pm 2666,32$ $17460,67 \pm 13464,36$ $2290,57 \pm 1166,77$

Công thức viên nang mềm hoàn chỉnh được xác lập gồm hai phần:

  • Dịch nhân: Progesteron (25 mg), Acid oleic (360 mg), Tween 80 (135 mg), Ethanol (405 mg).
  • Vỏ nang: Gelatin (450 mg), Glycerin (150 mg), Methyl paraben (1,5 mg), Propyl paraben (0,3 mg), Nước tinh khiết (398,2 mg).

Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài:

  • Thiết lập thành công mô hình thử nghiệm ly giải lipid in vitro 1 ngăn chuẩn hóa tại Việt Nam, ứng dụng hiệu quả trong sàng lọc và tối ưu hóa các hệ phân phối thuốc tự nhũ hóa.
  • Phát hiện và chứng minh cơ chế tương tác liên kết hydro giữa gelatin và progesteron thông qua phổ FT-IR, khẳng định vai trò của gelatin trong vỏ nang mềm như một tác nhân ức chế tái kết tinh và ổn định trạng thái siêu bão hòa của dược chất.
  • Chứng minh hệ SNEDDS F3 giúp cải thiện vượt bậc sinh khả dụng đường uống của progesteron (ở mức liều chỉ bằng 1/4 liều đối chiếu nhưng cho $C_{\max}$ gấp 1,74 lần) nhờ cơ chế hấp thu nhanh qua hệ bạch huyết, đồng thời làm giảm đáng kể mức độ dao động dược động học giữa các cá thể so với dạng hỗn dịch dầu truyền thống.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế và đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Hạn chế: Thử nghiệm in vivo đánh giá sinh khả dụng mới dừng lại ở cỡ mẫu động vật hạn chế ($n=11$ thỏ chia cho 3 nhóm thử nghiệm) trong điều kiện nhịn ăn; quy trình bào chế viên nang mềm thực hiện bằng phương pháp nhúng khuôn thủ công ở quy mô phòng thí nghiệm.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục nâng cấp và hoàn thiện quy trình công nghệ bào chế viên nang mềm chứa SNEDDS progesteron trên dây chuyền thiết bị quy mô công nghiệp; mở rộng đánh giá sinh khả dụng in vivo trên cỡ mẫu lớn hơn và khảo sát chi tiết ảnh hưởng của chế độ ăn giàu lipid đối với động học hấp thu của thuốc.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Sinh dược học, Dược lý và Kiểm nghiệm thuốc.

Các nội dung có giá trị ứng dụng thực tiễn nổi bật gồm:

  1. Quy trình chi tiết thiết lập và vận hành mô hình ly giải lipid in vitro (pH-stat lipolysis model) để đánh giá các dạng thuốc mang cấu trúc lipid (SEDDS, SMEDDS, SNEDDS, LBFs).
  2. Phương pháp luận kết hợp giữa thử nghiệm thay đổi dung môi (solvent shift), đo kích thước tiểu phân laser và phân tích quang phổ hồng ngoại (FT-IR) để làm sáng tỏ tương tác ức chế kết tinh của polyme/tá dược tạo vỏ.
  3. Kỹ thuật xử lý mẫu sinh học bằng phương pháp chiết QuEChERS và quy trình phân tích định lượng progesteron trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS).

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao công thức SNEDDS F3 (25 mg PGT) cho hiệu suất ly giải lipid in vitro tối ưu hơn công thức F1 (100 mg PGT)?

Khi hàm lượng progesteron đưa vào hệ quá cao như ở mẫu F1 (100 mg), lượng dược chất giải phóng vượt quá khả năng hòa tan tối đa của hệ micell keo hình thành trong quá trình tiêu hóa. Sự quá bão hòa quá mức kích thích dược chất kết tinh trở lại với lượng lớn (84,48% bị tủa), các tinh thể này bám lên bề mặt giọt nhũ tương cản trở enzyme lipase tiếp xúc với cơ chất lipid. Ngược lại, mẫu F3 (25 mg) đạt tỷ lệ siêu bão hòa tối ưu ($SR = 1,69$), duy trì được 73,40% dược chất tan trong pha keo, hạn chế tối đa hiện tượng tủa và tạo kích thước giọt nhỏ nhất ($104,9\text{ nm}$).

2. Vỏ nang mềm gelatin đóng vai trò gì trong việc kiểm soát số phận dược chất sau khi ly giải?

Gelatin hòa tan từ vỏ nang đóng vai trò như một chất ức chế tái kết tinh và chất ổn định nhũ tương. Trong môi trường tiêu hóa, gelatin tương tác với progesteron giúp duy trì trạng thái siêu bão hòa ($DS = 1,27$ ở tỷ lệ P:G = 1:18 sau 30 phút), kiểm soát kích thước hạt tủa ở mức nhỏ ($27,87\ \mu\text{m}$ so với $60,8\ \mu\text{m}$ ở mẫu không có gelatin) và làm tăng tỷ lệ dược chất duy trì trong pha keo hấp thu.

3. Dữ liệu phổ hồng ngoại FT-IR chứng minh tương tác giữa progesteron và gelatin như thế nào?

Trên phổ FT-IR, progesteron có 2 đỉnh carbonyl đặc trưng tại số sóng $1701\text{ cm}^{-1}$ (carbonyl tự do) và $1663\text{ cm}^{-1}$ (carbonyl liên hợp). Khi phối hợp với gelatin ở các tỷ lệ tăng dần (tối ưu tại 1:18), đỉnh dao động của nhóm hydroxyl và amino của gelatin bị dịch chuyển từ $3547,09\text{ cm}^{-1}$ xuống $3286,06 \pm 4,85\text{ cm}^{-1}$ đồng thời mở rộng dạng pic tù, các đỉnh carbonyl của PGT cũng bị dịch chuyển vị trí tương ứng. Điều này chứng minh sự hình thành liên kết hydro liên phân tử giữa nhóm -OH/-NH của gelatin và nhóm $\text{C=O}$ của progesteron.

4. Tại sao hệ SNEDDS F3 đạt nồng độ đỉnh $C_{\max}$ cao hơn và hấp thu nhanh hơn viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg trên thỏ?

Hệ SNEDDS F3 chứa sẵn chất diện hoạt Tween 80 và pha dầu Acid oleic đã được phân tán thành các hạt nano nhũ tương ($104,9\text{ nm}$), khi vào ruột sẽ nhanh chóng tạo micell mà không phụ thuộc vào tốc độ nhũ hóa của muối mật, giúp thuốc hấp thu nhanh qua đường bạch huyết chỉ sau 5 phút ($T_{\max} = 5\text{ phút}$). Ngược lại, Utrogestan® là hỗn dịch đặc thân dầu trong dầu lạc và lecithin, cần thời gian tiêu hóa chậm để cắt triglycerid thành acid béo tự do, đồng thời thiếu chất diện hoạt mạnh nên tỷ lệ dược chất hòa tan vào pha keo rất thấp (chỉ đạt 2,69% in vitro), dẫn đến hấp thu chậm hơn và sinh khả dụng phụ thuộc nhiều vào lượng enzym bài tiết của từng cá thể thỏ.

5. Phương pháp phân tích nào được sử dụng để định lượng progesteron trong huyết tương thỏ?

Phương pháp định lượng trong huyết tương thỏ sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) trên cột Agilent Eclipse XDB-C18 ($3,0 \times 150\text{ mm}$, $3,5\ \mu\text{m}$), rửa giải gradient dung môi acetonitril và dung dịch acid formic 0,1%. Mẫu huyết tương được xử lý bằng kỹ thuật chiết QuEChERS (dùng acetonitril, $\text{MgSO}_4$, NaCl) kết hợp chất chuẩn nội đồng vị $\text{PGT-d}_9$, cho độ tuyến tính cao trong khoảng nồng độ $2 - 2000\text{ ng/ml}$ ($R^2 = 0,9997$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thanh Tùng đã xây dựng và hoàn thiện thành công công thức viên nang mềm chứa hệ nano tự nhũ hóa progesteron (hàm lượng 25 mg PGT/nang) với vỏ nang gelatin có tác dụng ức chế tái kết tinh dược chất thông qua liên kết hydro. Nghiên cứu đã tiên phong ứng dụng mô hình ly giải lipid in vitro 1 ngăn để sàng lọc công thức và dự đoán chính xác số phận dược chất trong lòng ruột non. Kết quả thử nghiệm in vivo trên thỏ khẳng định hệ SNEDDS F3 giúp rút ngắn thời gian đạt nồng độ đỉnh ($T_{\max} = 5\text{ phút}$), gia tăng vượt bậc nồng độ đỉnh huyết tương ($C_{\max} = 711,04\text{ ng/ml}$ ở liều 2,5 mg/kg) và giảm thiểu dao động sinh khả dụng cá thể so với chế phẩm đối chiếu thương mại Utrogestan® 100 mg.