Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Đối Kháng Phytophthora infestans Gây Bệnh Sương Mai Trên Khoai Tây

Khóa luận nghiên cứu vi sinh vật trong đất đối kháng nấm Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên khoai tây Solanum tuberosum.

• Tác giả: Trần Tiến Đạt
• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Ngọc Hà
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật
• Đề tài: Phân Lập Và Nghiên Cứu Một Số Vi Sinh Vật Đối Kháng Phytophthora Infestans Gây Bệnh Sương Mai Trên Khoai Tây
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây
• 1.2. Bệnh sương mai trên khoai tây
• 1.2.1. Phân bố và tác hại
• 1.2.2. Triệu chứng
• 1.2.3. Bệnh sương mai gây hại trên một số bộ phận của cây khoai tây
• 1.3. Tổng quan về nấm Phytophthora infestans
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu
• 2.4. Phương pháp thí nghiệm
• 2.4.1. Kiểm tra đặc điểm hình thái của nấm Phytophthora infestans
• 2.4.2. Kiểm tra khả năng gây bệnh của mẫu nấm được cung cấp trên củ khoai tây
• 2.4.3. Thu thập, phân lập và định danh mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất
• 2.4.3.1. Thu thập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất
• 2.4.3.2. Phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất
• 2.4.3.3. Định danh vi khuẩn đối kháng trong đất
• 2.4.3.4. Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với nấm Phytophthora infestans
• 2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kiểm tra đặc điểm hình thái của mẫu nấm được cung cấp
• 3.2. Kiểm chứng tác nhân gây bệnh sương mai
• 3.3. Thu thập, phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên khoai tây
• 3.3.1. Phân lập vi sinh vật trong đất
• 3.3.2. Định danh khuẩn bằng đặc điểm hình thái và sinh hóa
• 3.3.3. Kết quả định danh vi khuẩn bằng một số phản ứng sinh hóa
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng Phytophthora infestans

Nghiên cứu về Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên cây khoai tây là một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn gây thiệt hại lớn cho người trồng khoai tây. Việc tìm kiếm các vi sinh vật đối kháng có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra. Nghiên cứu này nhằm mục đích phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật trong đất đối với Phytophthora infestans.

1.1. Giới thiệu về cây khoai tây và bệnh sương mai

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những cây trồng quan trọng nhất trên thế giới. Bệnh sương mai do Phytophthora infestans gây ra là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất, có thể làm giảm năng suất đến 100%. Việc hiểu rõ về bệnh này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các vi sinh vật như Bacillus và Pseudomonas có khả năng đối kháng với Phytophthora infestans. Việc phân lập và nghiên cứu các dòng vi sinh vật này sẽ giúp tìm ra giải pháp sinh học hiệu quả cho việc phòng trừ bệnh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc ứng dụng chúng vào thực tiễn. Các yếu tố như điều kiện môi trường, sự phát triển của nấm bệnh, và khả năng kháng thuốc của Phytophthora infestans đều ảnh hưởng đến hiệu quả của các biện pháp sinh học.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm bệnh

Điều kiện thời tiết, độ ẩm và nhiệt độ là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của Phytophthora infestans. Nghiên cứu cho thấy rằng nấm bệnh phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ thấp.

2.2. Khó khăn trong việc ứng dụng vi sinh vật đối kháng

Việc ứng dụng các vi sinh vật đối kháng vào thực tiễn gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi của môi trường và sự phát triển của nấm bệnh. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra các dòng vi sinh vật có khả năng kháng tốt nhất.

III. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật đối kháng hiệu quả

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp cấy kép để đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật trong đất đối với Phytophthora infestans. Phương pháp này cho phép xác định chính xác mức độ đối kháng của từng dòng vi sinh vật.

3.1. Phương pháp cấy kép trong nghiên cứu

Phương pháp cấy kép được sử dụng để đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật. Mỗi dòng vi sinh vật được cấy trên đĩa petri cùng với Phytophthora infestans để quan sát sự phát triển và mức độ đối kháng.

3.2. Đánh giá kết quả thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm cho thấy một số dòng vi sinh vật như KTLD-0104 và KTLD-0305 có khả năng đối kháng cao với Phytophthora infestans. Việc đánh giá này giúp xác định các dòng vi sinh vật tiềm năng cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa bệnh.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng có thể là một giải pháp hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh sương mai trên cây khoai tây. Các dòng vi sinh vật đã được phân lập có thể được ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp để giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Các dòng vi sinh vật đối kháng có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm sinh học, giúp bảo vệ cây trồng mà không gây hại cho môi trường. Việc áp dụng các biện pháp sinh học này sẽ giúp tăng cường sức đề kháng cho cây khoai tây.

4.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng tương lai

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng vi sinh vật đối kháng có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do Phytophthora infestans gây ra. Triển vọng trong tương lai là phát triển các sản phẩm sinh học hiệu quả hơn để bảo vệ cây trồng.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

Nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng với Phytophthora infestans là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Việc phát triển các biện pháp sinh học sẽ giúp bảo vệ cây trồng và giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp hiệu quả cho nông nghiệp.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng một số dòng vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với Phytophthora infestans. Việc phân lập và nghiên cứu các dòng này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Hướng nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc phát triển các sản phẩm sinh học từ các dòng vi sinh vật đối kháng, nhằm nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh và bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây trồng lấy củ được canh tác rộng rãi trên toàn cầu, xếp thứ tư về sản lượng lương thực tươi sau lúa mì, lúa gạo và ngô. Tại Việt Nam, cây khoai tây được đưa vào trồng từ năm 1890 và hiện tập trung chủ yếu ở các vùng có khí hậu mát mẻ như Đồng bằng sông Hồng, Sa Pa và Đà Lạt (Lâm Đồng). Trong quá trình canh tác, bệnh sương mai do tác nhân Phytophthora infestans gây ra là một trong những dịch hại nguy hiểm nhất, có khả năng lây lan nhanh chóng qua thân, lá, củ và có thể làm giảm năng suất tới 100%, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng.

Hiện nay, việc phòng trừ bệnh sương mai ngoài đồng ruộng vẫn chủ yếu phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học (như Daconil 75WP, Metaxyl 500WG, Mancozeb 80WP). Biện pháp này bộc lộ nhiều hạn chế về mặt an toàn sinh thái, tăng nguy cơ bộc phát tính kháng thuốc của nấm bệnh, để lại dư lượng độc hại và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu các chủng vi sinh vật đối kháng có sẵn trong đất (như Bacillus spp., Pseudomonas spp.) để hướng tới phát triển các chế phẩm sinh học an toàn là giải pháp quản lý dịch hại bền vững.

Mục tiêu nghiên cứu:

• Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn trong đất đối với nấm Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên khoai tây trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Kiểm tra đặc điểm hình thái và khả năng gây bệnh của mẫu nấm Phytophthora infestans do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.
2. Thu thập mẫu đất và phân lập các dòng vi khuẩn từ vùng đất canh tác khoai tây tại tỉnh Lâm Đồng.
3. Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với Phytophthora infestans trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng phương pháp cấy kép.
4. Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng từ mức trung bình trở lên dựa trên đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Nấm Phytophthora infestans và các dòng vi khuẩn đối kháng phân lập từ đất.
• Phạm vi không gian: Thu thập mẫu đất tại 6 vùng thuộc huyện Đức Trọng (Liên Nghĩa 1, Liên Nghĩa 2, Ninh Gia), TP. Đà Lạt (Trung tâm Rau hoa và Khoai tây) và huyện Đơn Dương (Thạnh Mỹ, Đạ Ròn), tỉnh Lâm Đồng. Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 05/2022 đến tháng 10/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tài liệu tham khảo

• Đặc điểm phân loại thực vật học của cây khoai tây (Solanum tuberosum L., họ Cà Solanaceae).
• Hệ thống phân loại và sinh học của nấm Phytophthora infestans (thuộc giới Chromista, ngành Oomycota, lớp Oomycetes, bộ Peronosporales, họ Peronosporaceae).
• Tiêu chuẩn hình thái nấm theo Erwin và Ribeiro (1996) và Anton de Bary.
• Phương pháp kiểm tra khả năng gây bệnh nhân tạo theo Burgess và cộng sự (2008).
• Phương pháp phân lập vi sinh vật đất theo Nguyễn Thị Kim Cúc và cộng sự (2014).
• Thang phân loại định danh vi khuẩn theo Bergey (John và cộng sự, 1994).
• Tiêu chuẩn đánh giá hiệu suất đối kháng theo thang của Soytong (1988).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Kiểm tra hình thái và bệnh nguyên: Soi kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40X để kiểm tra cấu trúc sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử. Thực hiện lây bệnh nhân tạo lên mô củ khoai tây sạch bệnh trong hộp nhựa duy trì ẩm ở nhiệt độ 20°C, theo dõi triệu chứng sau 5–6 ngày.
• Thu thập và phân lập vi khuẩn: Lấy mẫu đất tại vùng rễ cây khoai tây (độ sâu 0–10 cm, cách gốc 50 cm, bán kính 20 cm quanh cây bệnh). Huyền phù 10 g đất trong 90 ml nước cất vô trùng, lắc 200 vòng/phút trong 20 phút, pha loãng bậc 10 ($10^{-3}$, $10^{-4}$, $10^{-5}$) và cấy trải 100 µl lên đĩa môi trường King's B Agar (KBA).
• Khảo sát khả năng đối kháng in vitro: Áp dụng phương pháp cấy kép (dual culture) của Ferreira và cộng sự (1991). Cấy ria vi khuẩn thành 2 đường thẳng song song cách tâm 2,5 cm trên đĩa PDA; đặt miếng thạch nấm đường kính 5 mm (7 ngày tuổi) vào tâm đĩa. Bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 5 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức và 1 nghiệm thức đối chứng (không cấy vi khuẩn).
• Công thức tính toán:
  • Bán kính tản nấm trung bình: $r = \frac{r_1 + r_2}{2}$ (mm)
  • Hiệu suất đối kháng: $AE (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$ (Moayedi và cộng sự, 2009), với $C$ là bán kính tản nấm nghiệm thức đối chứng và $T$ là bán kính tản nấm nghiệm thức vi khuẩn tại các thời điểm 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC).
• Thang đánh giá Soytong (1988):
  • $AE > 75%$: Mức đối kháng rất cao.
  • $AE = 61 - 75%$: Mức đối kháng cao.
  • $AE = 51 - 60%$: Mức đối kháng trung bình.
  • $AE < 50%$: Mức đối kháng thấp.
• Phương pháp định danh sơ bộ:
  • Xác định Gram: Thử nghiệm kéo sợi bằng dung dịch KOH 3% và nhuộm Gram chuẩn (Crystal Violet, Lugol, cồn tẩy màu, Safranin).
  • Nhuộm nội bào tử: Phương pháp Schaeffer và Fulton cải tiến (thuốc nhuộm lục Malachite 5% đun nóng 85–90°C, nhuộm bổ sung Safranin).
  • Khảo sát tính hiếu/kỵ khí: Cấy đâm sâu trong ống nghiệm chứa môi trường PGA, ủ 28°C từ 3–4 ngày.
  • Thử nghiệm phản ứng sinh hóa: Phản ứng Catalase (nhỏ $H_2O_2$ quan sát hiện tượng sủi bọt), phản ứng Oxidase (sử dụng giấy tẩm tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%), phản ứng thủy phân tinh bột (nuôi trên môi trường pepton agar chứa tinh bột, nhỏ dung dịch Lugol sau 3 ngày).
• Xử lý số liệu: Phân tích phương sai ANOVA và kiểm định phân hạng Duncan ở mức ý nghĩa $\alpha = 0,01$ bằng phần mềm SAS 9.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến cây khoai tây và nấm bệnh Phytophthora infestans:

• Giới thiệu lịch sử, nguồn gốc cây khoai tây từ dãy Andes (Nam Mỹ), phân loại thực vật học, chu kỳ sinh trưởng và các đặc điểm hình thái thân, lá, rễ, củ.
• Phân tích chi tiết về bệnh sương mai: Lịch sử dịch tễ học, triệu chứng gây hại trên lá (đốm xanh thẫm lan rộng thành nâu đen, xuất hiện lớp mốc trắng ở mặt dưới lá), thân cành (thối mềm, thâm đen) và củ (vết màu xám nâu lõm, thối ăn sâu vào ruột).
• Sinh học nấm P. infestans: Đặc tính túi bào tử hình quả chanh có núm kích thước 29–36 $\times$ 19–22 µm; hai hình thức nảy mầm (trực tiếp tạo ống mầm ở 20–24°C; gián tiếp giải phóng 3–8 du động bào tử có 2 roi ở 12–18°C); cơ chế sinh sản hữu tính tạo bào tử trứng (oospore) kích thước 31 $\times$ 50 µm khi có sự kết hợp chủng A1 và A2.
• Tổng kết các biện pháp phòng trừ theo IPM: Canh tác, hóa học và sinh học.
• Đánh giá các công trình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Pseudomonas, Xenorhabdus nematophila, Streptomyces và Trichoderma trong việc ức chế nấm gây bệnh sương mai trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết hệ thống hóa chất, môi trường nuôi cấy (PSM, WA, PGA/PDA, LB, KBA, TZCA), trang thiết bị và quy trình thực hiện các nội dung thực nghiệm:

• Phương pháp kiểm tra lại hình thái nấm mẫu và thử tính độc lực gây bệnh trên củ.
• Kỹ thuật lấy mẫu đất đại diện ngoài thực địa tại Lâm Đồng và kỹ thuật pha loãng cấy trải phân lập vi khuẩn.
• Quy ước đặt tên mẫu phân lập: KTLĐ (Khoai tây Lâm Đồng) kèm mã số khu vực và số thứ tự mẫu.
• Bố trí thí nghiệm cấy kép đánh giá hiệu lực ức chế tản nấm, công thức tính toán và xử lý thống kê.
• Quy trình chuẩn các bước định danh hình thái, nhuộm màu và phản ứng sinh hóa theo khóa Bergey.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố và phân tích toàn bộ số liệu thu được từ thực nghiệm:

• Kiểm tra hình thái nấm và lây bệnh: Xác nhận nấm được cung cấp là Phytophthora infestans với sợi nấm đơn bào hình vòi hút, cành bào tử phân nhánh so le mang các nốt lồi lõm đặc trưng, bào tử phân sinh kích thước 22–32 $\times$ 16–24 µm. Trên củ lây bệnh nhân tạo sau 6 ngày xuất hiện lớp sợi nấm trắng và vết thối nâu xám ăn sâu vào mô củ.
• Kết quả phân lập vi khuẩn đất: Từ 6 điểm thu mẫu tại 3 khu vực (Đức Trọng, Đà Lạt, Đơn Dương), tác giả đã phân lập được tổng cộng 37 dòng vi khuẩn đất.

Địa điểm thu mẫu	Vườn / Điểm thu	Số dòng vi khuẩn phân lập	Mã ký hiệu
Huyện Đức Trọng	Liên Nghĩa 1	7	KTLĐ-0101 đến KTLĐ-0107
Huyện Đức Trọng	Liên Nghĩa 2	7	KTLĐ-0201 đến KTLĐ-0207
Huyện Đức Trọng	Ninh Gia	10	KTLĐ-0501 đến KTLĐ-0510
TP. Đà Lạt	Trung tâm Rau hoa và Khoai tây	4	KTLĐ-0601 đến KTLĐ-0604
Huyện Đơn Dương	Thạnh Mỹ	6	KTLĐ-0301 đến KTLĐ-0306
Huyện Đơn Dương	Đạ Ròn	3	KTLĐ-0401 đến KTLĐ-0403
Tổng cộng	6 điểm	37 dòng

• Khảo sát khả năng đối kháng của 37 dòng vi khuẩn:
  • Tại thời điểm 1 NSC, hiệu suất đối kháng chưa có sự phân hóa rõ rệt, cao nhất là KTLĐ-0207 (25,70%).
  • Tại thời điểm 2 NSC và 3 NSC, xuất hiện sự phân hóa rõ ràng giữa các nghiệm thức.
  • Tại thời điểm 4 NSC, nghiệm thức đối chứng đạt bán kính tản nấm tối đa 40,00 mm ($HSDK = 0%$). Có 6 dòng vi khuẩn hoàn toàn không có khả năng ức chế (tản nấm đạt 40,00 mm, $HSDK = 0%$) gồm: KTLĐ-0101, KTLĐ-0205, KTLĐ-0302, KTLĐ-0303, KTLĐ-0601, KTLĐ-0604.
  • Tuyển chọn được 12 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng từ mức trung bình trở lên ($HSDK \ge 52,00%$).

STT	Tên dòng vi khuẩn	Bán kính tản nấm tại 4 NSC (mm)	Hiệu suất đối kháng tại 4 NSC (%)	Mức độ đối kháng
1	KTLĐ-0104	12,14	69,65	Cao
2	KTLĐ-0305	12,46	68,85	Cao
3	KTLĐ-0102	14,58	63,55	Cao
4	KTLĐ-0206	16,37	59,08	Trung bình
5	KTLĐ-0304	16,64	58,40	Trung bình
6	KTLĐ-0306	17,90	55,25	Trung bình
7	KTLĐ-0103	18,18	54,55	Trung bình
8	KTLĐ-0501	18,65	53,38	Trung bình
9	KTLĐ-0505	18,79	53,03	Trung bình
10	KTLĐ-0502	19,13	52,18	Trung bình
11	KTLĐ-0603	19,13	52,18	Trung bình
12	KTLĐ-0509	19,20	52,00	Trung bình
--	Đối chứng (ĐC)	40,00	0,00	Không đối kháng

• Kết quả định danh sơ bộ 12 dòng vi khuẩn triển vọng:
  • Hình thái khuẩn lạc: Các dòng có dạng khuẩn lạc tròn hoặc không cố định; màu trắng đục, trắng ngả vàng hoặc vàng trắng; bề mặt nhầy hoặc khô nhăn.
  • Xác định Gram: 4 dòng Gram âm (tạo sợi nhớt với KOH 3%, bắt màu hồng đỏ với Safranin) gồm: KTLĐ-0102, KTLĐ-0103, KTLĐ-0104, KTLĐ-0206. 8 dòng còn lại là Gram dương (không tạo sợi với KOH 3%, giữ màu tím Crystal Violet).
  • Nhuộm nội bào tử: 6/12 dòng có nội bào tử (giữ màu xanh của thuốc nhuộm Malachite green) gồm: KTLĐ-0304, KTLĐ-0501, KTLĐ-0502, KTLĐ-0505, KTLĐ-0509, KTLĐ-0603.
  • Đặc tính hô hấp: 12/12 dòng đều là vi khuẩn hiếu khí (không phát triển lan ra khỏi đường cấy đâm sâu trên môi trường PGA).
  • Phản ứng sinh hóa: 11/12 dòng dương tính với Catalase (sủi bọt khi gặp $H_2O_2$); 11/12 dòng dương tính với Oxidase (chuyển màu xanh tím trên giấy tẩm thuốc thử); 7/12 dòng có khả năng thủy phân tinh bột (KTLĐ-0104, KTLĐ-0206, KTLĐ-0501, KTLĐ-0502, KTLĐ-0505, KTLĐ-0509, KTLĐ-0603).
  • Kết luận định danh:
    • Dòng KTLĐ-0102 được định danh sơ bộ là Pseudomonas spp.
    • 6 dòng (KTLĐ-0304, KTLĐ-0305, KTLĐ-0501, KTLĐ-0502, KTLĐ-0505, KTLĐ-0603) được định danh sơ bộ là Bacillus spp.
    • 4 dòng (KTLĐ-0103, KTLĐ-0104, KTLĐ-0206, KTLĐ-0509) chưa xác định được chi.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Xác minh tính chính xác về mặt hình thái và bệnh nguyên của mẫu nấm Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên khoai tây.
• Thu thập và phân lập thành công 37 dòng vi khuẩn từ đất trồng khoai tây tại 3 vùng chuyên canh thuộc tỉnh Lâm Đồng.
• Tuyển chọn được 12 dòng vi khuẩn có hoạt tính ức chế nấm P. infestans đạt mức trung bình đến cao sau 4 ngày cấy kép. Trong đó nổi bật 3 dòng có hiệu suất đối kháng cao nhất:
  • Dòng KTLĐ-0104 đạt hiệu suất 69,65% (bán kính tản nấm 12,14 mm).
  • Dòng KTLĐ-0305 đạt hiệu suất 68,85% (bán kính tản nấm 12,46 mm).
  • Dòng KTLĐ-0102 đạt hiệu suất 63,55% (bán kính tản nấm 14,58 mm).
• Định danh sơ bộ được 1 dòng thuộc chi Pseudomonas spp. (KTLĐ-0102) và 6 dòng thuộc chi Bacillus spp. (KTLĐ-0304, KTLĐ-0305, KTLĐ-0501, KTLĐ-0502, KTLĐ-0505, KTLĐ-0603).

Đóng góp thực tiễn và khoa học

• Đóng góp nguồn chủng giống vi sinh vật bản địa có hoạt tính đối kháng tốt từ các vùng đất chuyên canh khoai tây trọng điểm tại Lâm Đồng.
• Cung cấp dẫn liệu khoa học về đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn đất có tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát sinh học đối với bệnh sương mai.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Các thử nghiệm đánh giá hiệu lực đối kháng chỉ mới được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro trên đĩa petri), chưa đánh giá hiệu lực thực tế trên cây trồng trong chậu (in vivo) hoặc ngoài đồng ruộng.
• Phương pháp định danh vi khuẩn mới dừng lại ở mức định danh sơ bộ dựa trên đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa cổ điển; một số dòng có hiệu suất đối kháng cao (như KTLĐ-0104) vẫn chưa thể xác định chính xác tên chi và loài.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA) để định danh chính xác loài cho 12 dòng vi khuẩn đối kháng, đặc biệt là dòng KTLĐ-0104.
• Khảo sát cơ chế đối kháng chuyên sâu (định lượng enzyme ngoại bào, khả năng sinh siderophore, chất kháng sinh, hợp chất hữu cơ dễ bay hơi VOCs).
• Tiến hành thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh sương mai của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây khoai tây trồng trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng.
• Nghiên cứu công nghệ lên men, tạo sinh khối và xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh sương mai.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Nông học, Công nghệ Sinh học Nông nghiệp và Vi sinh vật học ứng dụng.

Các phần có giá trị tham khảo:

• Quy trình thí nghiệm cấy kép (dual culture): Cung cấp chi tiết cách bố trí, khoảng cách đặt nguồn vi khuẩn và nguồn nấm, cách đo đạc bán kính tản nấm và công thức toán học tính hiệu suất đối kháng.
• Phương pháp định danh vi sinh vật đất theo Bergey: Trình bày chi tiết từng bước thử nghiệm phản ứng kéo sợi KOH 3%, kỹ thuật nhuộm Gram, nhuộm nội bào tử Schaeffer-Fulton, thử hoạt tính enzyme Catalase, Oxidase và khả năng thủy phân tinh bột.
• Bộ số liệu thực nghiệm: Dữ liệu chi tiết về đường kính tản nấm và tỷ lệ ức chế của 37 dòng vi khuẩn qua 4 mốc thời gian (24h, 48h, 72h, 96h) được xử lý thống kê ANOVA và Duncan bằng SAS.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm Phytophthora infestans có những đặc điểm hình thái đặc trưng nào dưới kính hiển vi?

Sợi nấm có cấu tạo đơn bào, hình vòi hút, hình trụ hoặc hình cầu khi ký sinh trong tế bào cây chủ. Cành bào tử không màu, phân nhiều nhánh so le với nhau, trên mỗi đỉnh nhánh có nhiều chỗ phình lồi lõm đặc trưng. Bào tử phân sinh có hình trứng hoặc hình quả chanh với một núm nhỏ ở đỉnh, kích thước dao động trong khoảng 22–32 $\times$ 16–24 µm.

2. Thí nghiệm đối kháng sử dụng phương pháp nào và bố trí ra sao?

Thí nghiệm sử dụng phương pháp cấy kép của Ferreira và cộng sự (1991) trên đĩa petri chứa môi trường PDA. Vi khuẩn được cấy ria thành 2 đường thẳng song song cách vị trí đặt miếng thạch nấm ở tâm 2,5 cm. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 5 lần lặp lại cho mỗi dòng vi khuẩn và một nghiệm thức đối chứng không cấy vi khuẩn.

3. Ba dòng vi khuẩn nào thể hiện hiệu suất đối kháng cao nhất sau 4 ngày cấy kép?

Ba dòng đạt mức đối kháng cao nhất (hiệu suất từ 61% đến 75%) gồm:

• KTLĐ-0104: Hiệu suất đối kháng đạt 69,65% (bán kính tản nấm 12,14 mm).
• KTLĐ-0305: Hiệu suất đối kháng đạt 68,85% (bán kính tản nấm 12,46 mm).
• KTLĐ-0102: Hiệu suất đối kháng đạt 63,55% (bán kính tản nấm 14,58 mm).

4. Kết quả định danh sơ bộ 12 dòng vi khuẩn đối kháng đạt được những gì?

Trong 12 dòng vi khuẩn:

• Có 4 dòng Gram âm (KTLĐ-0102, KTLĐ-0103, KTLĐ-0104, KTLĐ-0206) và 8 dòng Gram dương.
• Có 6 dòng tạo nội bào tử (KTLĐ-0304, KTLĐ-0501, KTLĐ-0502, KTLĐ-0505, KTLĐ-0509, KTLĐ-0603).
• Cả 12 dòng đều là vi khuẩn hiếu khí; 11/12 dòng dương tính với Catalase; 11/12 dòng dương tính với Oxidase; 7/12 dòng có khả năng thủy phân tinh bột.
• Phân loại sơ bộ: Dòng KTLĐ-0102 thuộc chi Pseudomonas spp.; 6 dòng (KTLĐ-0304, KTLĐ-0305, KTLĐ-0501, KTLĐ-0502, KTLĐ-0505, KTLĐ-0603) thuộc chi Bacillus spp.; 4 dòng còn lại (KTLĐ-0103, KTLĐ-0104, KTLĐ-0206, KTLĐ-0509) chưa xác định được chi.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Tiến Đạt đã phân lập được 37 dòng vi khuẩn đất từ các vùng chuyên canh khoai tây tại tỉnh Lâm Đồng và sàng lọc được 12 dòng có hoạt tính đối kháng từ mức trung bình đến cao đối với nấm Phytophthora infestans trong điều kiện in vitro. Nổi bật trong đó là 3 dòng KTLĐ-0104, KTLĐ-0305 và KTLĐ-0102 với hiệu suất ức chế tản nấm đạt từ 63,55% đến 69,65%. Các kết quả định danh sơ bộ hình thái và sinh hóa đã bước đầu xác định được các đại diện thuộc chi Pseudomonas spp. và Bacillus spp., tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu giải trình tự phân tử và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm sinh học kiểm soát bệnh sương mai ngoài đồng ruộng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 1.1 Nguồn gốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ cà có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam mỹ) ở độ cao 2000 - 5000m. Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoai tây có nguồn gốc từ khoảng 500 năm trước công nguyên. Người Tây Ban Nha lần đầu phát hiện ra cây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũng Magdalena. Lúc đó, người ta gọi khoai tây là truffles vì hoa có mau sắc sặc sở (Salaman, 1949).

Đến thời ki người Tây Ban Nha chinh phục Châu Mỹ trong thế ky XVI, hang trăm giống khoai tây đã được biết đến và được trồng chủ yếu dọc miền núi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia, Ecuador và Peru (Horton, 1987). Ngày nay người da đỏ ở vùng Titicaca vẫn còn trồng những giống khoai tây khởi thủy (Ducreux, 1989). Năm 1890 khoai tây được du nhập vào nước ta là do một người Pháp là giám đốc vườn Bách Thảo Hà Nội đem vào trồng thử và nó nhanh chóng được trồng ở nhiều địa phương. Do người Pháp là người đem cây về nước ta và phô biến cách trồng nên nhân dân ta gọi cây này là "khoai tây" (Vũ Hướng Văn, 2007).

Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ yếu ở đồng bằng sông Hồng, Sapa, Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa (Đỗ Kim Chung, 2003). Từ đó đến bây giờ cây khoai tây đã dần phổ biến và có một vai trò quan trọng hơn trong đời sông con người. Tổ chức Nông Lương Thế Giới ( FAO) khuyến cáo : trong tương lai sản xuất lương thực sẽ cần phải tăng 75% mới có thể cung cấp lương thực cho 9 tỷ người vào năm 2050. Theo số liệu do Liên Hợp Quốc công bố trên bai báo (Tình trạng An ninh Lương thực và Dinh dưỡng trên thế giới) xuất bản ngày 13/07/2020 năm 2019 trên thế giới có 690 triệu người thiếu ăn.

Vấn đề an ninh lương thực là vấn đề thế giới đang đối mặt. Hơn nữa biến đổi khí hậu đang diễn biến ngày càng phức tạp, nắng nóng kéo đài, hạn hán, xâm nhập mặn, dịch bệnh đặc biệt ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển năng xuất, chất lượng của cây trồng.2 Vị trí phan loại Vi trí phân loại của khoai tây trong hệ thong hoc thuc vat (USDA, NRCS, 2010): Giới: Plantae (plants) Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons) Bộ: Solanales Ho: Solanaceae Chi: Solanum Loai: Solanum tuberosum L.3 Đặc điểm của cây khoai tây Nhuy Nhị Than chính Thân nga (Tia củ) Mat củ M—=”Củ (Atlas des plantes de France, 1891) Hình 1.1 Các bộ phận trên cây khoai tây Thân: Khoai tây có thân chính mọc từ hạt hoặc từ củ. Chiều cao thân khoai tây từ 45 cm đến 90 cm tùy thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác và độ phì của đất. Thân va lá khoai tây có nhiều lông.

Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ. Tia củ phát triển từ thân ngầm. Trong điều kiện thuận lợi sẽ phát triển củ. Trong điều kiện không thuận lợi sẽ trồi lên mặt đất, phát triển thành thân.

Lá: Lá khoai tây là lá kép lông chim, không đối xứng. Các lá chét có đặc điểm là luân phiên xen kẽ một lá to đến một lá nhỏ. Hoa: Khoai tây có hoa cân đối. Màu sắc hoa là đặc điểm phân biệt các giống: Cánh hoa có màu: trắng, tím — đỏ, tím — xanh, xanh thẫm.

Hoa khoai tây mọc thành chùm, là hoa lưỡng tính. Khoai tây là cây tự thu phan nhưng cũng có trường hợp giao phấn. Sự thụ phấn chéo của khoai tây được thực hiện nhờ côn trùng. Sau thời kỳ ra hoa, một vài loài kết quả.

Quả chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ anh đào giống như màu cà chua. Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, có 2 ô, hạt rất nhỏ. Rễ: Rễ khoai tây trồng từ củ giống chỉ phát triển rễ chùm, có rễ cọc khi trồng bằng hạt, từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác. Ở các thân ngầm dưới mặt đất (còn gọi là tia củ) cũng có khả năng ra rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh.

Bộ rễ phân bố chủ yếu trên đất canh tác 20 - 40 cm, nhưng cũng có rễ ăn sâu tới 1,5 - 2,0 m (Ta Thu Cúc, 2007). Củ: Mầm ngủ trên thân khoai tây được tạo thành ở các nách lá và củ. Mầm ngủ ở mỗi củ thường là một , phần lớn là 3 mầm. Các mắt ngủ trên củ khoai tây phân bố theo hình xoắn ốc.

Chúng được phân bố không đều trên bề mặt củ. Thường tập trung chủ yếu ở phần trên của củ, nơi có các tế bào tương đối trẻ. Cây khoai tây được chia làm 4 thời kỳ: Thời kỳ ngủ Thời kỳ nảy mầm Thời kỳ hình thành thân củ Thời kỳ phát triển củ 1.2 Bệnh sương mai trên khoai tây 1.1 Phân bố và tác hại @ Casi Summary Data (CABI, 2022) Hình 1.2 Phân bố bệnh sương mai trên thé giới Bệnh phân bố ở hau hết các nước trên thế giới nơi có điều kiện lạnh đủ dé trồng khoai tây. Theo thống kê của CABI (1982) nam Phytophthora infestans đã xuất hiện trên hầu hết các châu lục.

Tại châu Á bệnh xuất hiện tại 26 nước, trong đó có những nước lân cận va láng giéng nước ta như Trung Quốc, Lao, Thái Lan, Philippin, Han Quốc, Nhật Ban, Ấn độ va bao gồm cả Việt Nam. Ở nước ta phân bó của bệnh cũng khá rộng, theo các nghiên cứu cho thấy bệnh phổ biến ở các vùng Hà Nội, Lào Cai, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hải Phòng, Lâm Đồng (Vũ Hoan, 1973; Nguyễn Văn Viên, 1998). Bệnh sương mai khoai tây do Phytophthora infestans gay ra, là một trong những bệnh được nghiên cứu nhiều nhất, có lịch sử nghiên cứu lâu dài nhất, tuy vậy đây vẫn là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trong lịch sử nhân loại. Bệnh sương mai khoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mexico, đây cũng được coi là trung tâm đa dạng sinh học của nắm sương mai.

Triệu chứng bệnh được mô tả chi tiết năm 1845 trên cây khoai tây. Sự phát tán của bệnh được chia làm hai giai đoạn giữa thế kỉ 19 và giai đoạn thế ki 20 cho đến nay. Giai đoạn giữa thế kỉ 19, lúc này khoai tây bắt đầu xuất hiện và được phô biến rộng rãi trên các nước Bắc Mỹ và châu Âu. Cùng với sự phổ biến của khoai tây, nắm sương mai cũng phat tán ra các vùng trồng, đầu tiên là Mỹ theo nguồn bệnh trên khoai tây đại, sau đó lan sang châu Âu theo đường củ giống.

Giai đoạn thứ 2 vào thế kỉ 20, lúc này do toàn cầu hóa về thương mại cũng như vận chuyên hàng hóa, bệnh sương mai theo củ khoai tây phát tán ra hầu như tất cả các vùng trồng cây khoai tây và cà chua. Bệnh hại nặng có thể mất mùa và dẫn tới nạn đói như ở Ireland năm 1845 - 1846 và ở Đức năm 1919. Bệnh sương mai có thé coi là một trong những căn bệnh có sức tàn phá lớn nhất trong lich sử con người(Trần Yến Chi, 2009).2 Triệu chứng Trên khoai tây bệnh gây hại trên thân, lá, củ. Triệu chứng của bệnh rất đa dạng tùy thuộc vào điều kiện thời tiết.3 Bệnh sương mai gây hại trên một số bộ phận của cây khoai tây Triệu chứng bệnh: Trên lá: vết bệnh ban đầu là những điểm nhỏ màu xanh thẫm sau đó lan rộng ra có màu nâu tham, ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe không rõ ràng.

Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá, sau đó lan rộng vào phiến lá (Stevenson, 1993). Phần giữa vết bệnh hóa nâu đen do các đám mô bị chết, xung quanh vết bệnh thường có 7 đám cành bào tử va bào tử phân sinh màu trăng. Khi thời tiệt âm ướt hoặc buôi sáng sớm có sương, các đám bào tử phân sinh này dày và xôp tạo ra một lớp trăng như Sương muối ở mặt dưới lá bệnh (Drenth và ctv, 1996). Trên cuống lá, cành và thân: triệu chứng bệnh cũng tương tự như những triệu chứng trên lá.

Những tốn thương trên thân và cuống lá điển hình là những vết đốm lớn màu tối hoặc những vết đốm màu nâu, dẫn đến dé gãy và cây bị chết (Stevenson, 1993). Khi điều kiện âm độ xuống thấp, vết bệnh chết tóp lại, khi độ âm cao, trên vết bệnh có lớp cành bao tử và bao từ phân sinh trắng như sương muối bao phủ. Bệnh làm cho thân cành bi thôi, mém, có mùi moc. Trên củ khoai tây: bắt đầu từ những vết đốm bóng nhờn, màu tối trên bề mặt củ.

Những vết đốm này có thé tăng kích thước bao phủ toàn bộ củ. Dưới điều kiện môi trường thuận lợi cho sự hình thành bao tử, hệ sợi trắng có thé nhìn thấy được trên củ (Stevenson, 1993). Tiếp theo sự xâm nhiễm trên củ khoai tây sương mai là bệnh thối nhũn dẫn đến hỏng toàn bộ củ (Watterson, 1986). Triệu chứng bệnh sương mai có thể nhằm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn vì có chung các đặc điểm như có vết màu nâu lõm xuống.

Tuy vậy khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh có màu nâu xám lan rộng vào phía trong, đôi khi còn ăn sâu vao trong lõi củ. Các củ bị bệnh và các lát củ này khi đặt ở nhiệt độ dưới 20°C và âm độ bão hòa có thể quan sát thấy một lớp nam trang và cành bào tử phân sinh cũng như bao tử phân sinh trên bề mặt của củ (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 2001). Bệnh lan truyền trong cây có thé từ lá tới thân rồi quả, củ. Nhưng cũng có thé lan truyền từ củ, hạt nhiễm bệnh lên thân, lá.

Khi bệnh xuất hiện nếu gap điều kiện thời tiết phù hợp như nhiệt độ dưới 20°C, âm độ cao trên 80% cây sẽ nhanh chóng tàn lui có thể gây thành dich làm giảm năng suất nghiêm trọng.3 Tổng quan về nam Phytophthora infestans Phytophthora infestans là một loài Oomycete. Sinh san vô tính thông qua túi bao tử có hình elip đến hình quả chanh với một cuống nhỏ. Túi bao tử có kích thước 29 - 36 x 19 - 22 um. Bào tử nảy mam hoặc trực tiếp tạo thành ống mam (ở nhiệt độ 15 - 24°C), hoặc gián tiếp qua động bào tử (ở nhiệt độ dưới 18°C).

Cây phân loại theo (cabi, 2022) Domain: Eukaryota Kingdom: Chromista Phylum: Oomycota Class: Oomycetes Order: Peronosporales Family: Peronosporaceae Genus: Phytophthora Species: Phytophthora infestans Nam có cấu tao dạng sợi đơn bào. Sinh san theo hai phương thức vô tinh và hữu tính. (Nguồn: Fry, William E.