Đặt vấn đề Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối (biomass) trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35 – 50% khối lƣợng khô sinh khối thực vật. Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ đƣợc khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme đƣợc cung cấp bởi vi sinh vật. Hệ thống enzyme phân giải cellulose thƣờng chậm và không hoàn toàn. Tuy nhiên, trong khoảng thời gian ngắn (48 giờ) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò có thể phân giải 60 – 65% cellulose.
Hơn thế nữa, nhờ hệ thống vi sinh vật trong đƣờng ruột mà loài mối có thể tiêu hóa đến 90% cellulose của gỗ. Còn trong hệ thống sinh học phức tạp nhƣ rễ cây hoặc những mảnh vỡ thực vật trong đất, cellulose có thể đƣợc phân hủy trong khoảng thời gian lâu hơn (Schwarz, 2001). Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men hiếu khí hoặc kỵ khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt, bao gồm: nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn đƣợc tìm thấy nhiều trong: đất, nƣớc, đƣờng tiêu hóa một số động vật… nơi cung cấp lƣợng cellulose dồi dào để vi sinh vật phân giải và phát triển. Sau khi thu hoạch các sản phẩm nông nghiệp thì phế phụ phẩm còn tồn đọng rất nhiều trên đồng ruộng.
Với phế phẩm giàu cellulose này, một lƣợng rất ít đƣợc sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn đƣợc xử lý theo phƣơng pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả nhƣ góp phần ô nhiễm không khí, phá hủy hệ sinh thái đất và đất ngày càng bạc màu. Một biện pháp nhằm tận dụng rơm rạ có hiệu quả hơn đó là sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose giúp phân giải rơm rạ thành phân hữu cơ bón cho đất, góp phần cải thiện độ phì nhiêu đất. Vì lẽ đó mà các nhà nhà nghiên cứu tiến hành phân lập các vi khuẩn phân giải cellulose để tạo ra các chế phẩm sinh học có thể xử lý vấn đề trên. Tuy nhiên ở các nghiên cứu trƣớc đó chƣa chỉ ra đƣợc môi trƣờng chọn lọc cho việc phân lập vi khuẩn phân giải cellulose nên đề tài: “Nghiên cứu 1 môi trƣờng chọn lọc vi khuẩn phân giải cellulose” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu tối ƣu hóa phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose.
Mục đích Nghiên cứu xác định môi trƣờng chọn lọc phù hợp để phân lập vi khuẩn phân giải cellulose. Yêu cầu Xác định phƣơng pháp chuẩn bị và pha loãng mẫu để phân lập. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất chống nấm fluconazole đến môi trƣờng phân lập vi khuẩn phân giải cellulose. Nghiên cứu ảnh hƣởng của cơ chất CMC đến môi trƣờng phân lập vi khuẩn phân giải cellulose.
Tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ chế phẩm BIOFIT– Composting sử dụng môi trƣờng chọn lọc. 2 Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quát về cellulose và quá trình phân giải cellulose Cellulose là một polysaccharide đƣợc trùng hợp từ các gốc β-D-glucose (khoảng 3000 đơn vị glucose trở lên) bằng các liên kết β -1, 4- glycoside. Cellulose là hợp chất hữu cơ có nhiều nhất trong tự nhiên chiếm khoảng 33% trong thành phần cấu trúc cơ bản của thực vật (90% trong bông, 50% trong gỗ,…).
Tuy nhiên, con ngƣời không tiêu hóa đƣợc, cellulose là nguồn thức ăn cho động vật ăn cỏ nhƣ: trâu, bò, ngựa,. và các loài mối, mọt côn trùng,…Sở dĩ chúng tiêu hóa đƣợc cellulose là nhờ hệ thống vi sinh vật phân giải cellulose bên trong dạ dày và ruột của chúng. Nhờ khả năng tự dƣỡng dƣới ánh sáng của thực vật mà cellulose trở thành một nguyên liệu thô vô cùng dồi dào hấp dẫn để sản xuất nhiều sản phẩm hàng hóa quan trọng trong công nghiệp. Cellulose có cấu trúc mạch thẳng, dạng sợi rất bền nên khó bị phân hủy (Heidi Lynn & cs.
Chính vì vậy, phần lớn chất thải cellulose thƣờng đƣợc xử lý bằng cách đốt sinh khối, không chỉ giới hạn ở các nƣớc đang phát triển mà còn đƣợc coi là một hiện tƣợng toàn cầu. Với sự trợ giúp của hệ thống enzyme phân giải cellulose, cellulose có thể đƣợc chuyển đổi thành glucose, một sản phẩm đa năng, trong một quy trình thuận lợi về mặt sinh học và rẻ hơn nhiều. Cấu trúc cellulose Nguồn: (Heidi Lynn & cs., 2012) 3 Quá trình phân giải cellulose về cơ bản là quá trình sinh học đƣợc kiểm soát và xử lý bởi các enzyme của hệ thống cellulase. Hệ thống enzym cellulase bao gồm ba loại enzym hòa tan ngoại bào: 1, 4- β -endoglucanase, 1, 4- β- exoglucanase, và β-glucosidase ( β- D- glucoside glucohydrolase hay cellobiase).
Endoglucanase chịu trách nhiệm phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β- 1, 4- glycosid dọc theo chuỗi cellulose. Exoglucanase cần thiết cho sự phân cắt đầu không khử của chuỗi cellulose và tách các sợi sơ cấp từ cellulose tinh thể, và β- 1, 4- glucosidase thủy phân cellobiose và cellodextrin tan trong nƣớc thành glucose. Chỉ có sức mạnh tổng hợp của ba loại enzyme trên mới có thể thủy phân hoàn toàn cellulose thành glucose hoặc khoáng hóa triệt để thành H2O và CO2. Nguồn chiết xuất enzyme phân giải cellulose phù hợp nhất là từ hệ vi sinh vật đƣợc tìm thấy trong ruột của các sinh vật phát triển mạnh nhờ sinh khối cellulose làm thức ăn chính của chúng nhƣ: các loài côn trùng nhƣ mối ( Isopteran ), mọt sách ( Lepidoptera ) hay trâu, bò, dê,ngựa, v., đƣợc phát hiện có hệ vi sinh vật cộng sinh tổng hợp trong ruột chịu trách nhiệm tiêu hóa thức ăn cellulose.
Nhiều vi sinh vật đã đƣợc báo cáo với các hoạt động phân giải celulose bao gồm nhiều chủng vi khuẩn và nấm, cả hiếu khí và kỵ khí. Chaetomium, Fusarium Myrothecium, Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, v., là một số loài nấm đƣợc báo cáo sản sinh enzyme phân giải cellulose. Các loài vi khuẩn phân giải cellulose nhƣ: Trichonympha, Clostridium, Actinomycetes, Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, và Methanobrevibacter ruminantium,… Enzyme thủy phân cellulose do khả năng ứng dụng rộng rãi của nó đã đƣợc sử dụng trong các quy trình công nghiệp khác nhau nhƣ: nhiên liệu sinh học (cồn sinh học), quá trình metan hóa sinh học ba pha: quản lý chất thải nông nghiệp và thực vật; nghiên cứu tách đối xứng và liên kết phối tử. Các dẫn xuất 4 cellulose khác đƣợc sử dụng làm chất kết dính, chất nổ, chất làm đặc cho thực phẩm và trong lớp phủ chống ẩm.
Vi sinh vật phân giải cellulose Đã có rất nhiều nghiên cứu lớn, nhỏ tiến hành phân lập các loài vi sinh vật sinh enzyme phân giải cellulose và đánh giá khả năng phân giải cellulose của chúng. Các vi sinh vật phân giải cellulose chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa của động vật ăn cỏ nhƣ: trâu, bò, dê, cừu và một số loài côn trùng dùng cellulose làm nguồn thức ăn chính nhƣ: mối, mọt, bọ cánh cứng. Ngoài ra, chúng còn tồn tại trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải. Nấm Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong trong lĩnh vực phân hủy cellulose.
Các enzyme phân giải cellulose từ nấm hầu hết có hoạt lực cao và dƣờng nhƣ không có cấu trúc vật lý phức tạp nhƣ enzyme này từ vi khuẩn. Một số loài có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose ở nhiều môi trƣờng khác nhau nhƣ: Acremonium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhiropus oryzae. Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn gram (+) có dạng sợi nhƣ nấm. Chúng là những vi sinh vật hiếu khí tồn tại ở khắp mọi nơi trong tự nhiên.
DNA của xạ khuẩn bao gồm rất nhiều G và C (chiếm khoảng 57-75%). Chúng chiếm ƣu thế trong đất phèn khô. Xạ khuẩn còn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ: streptomycin, 5 gentamicin, rifamycin và erythomycin. Xạ khuẩn rất quan trọng trong công nghiệp dƣợc phẩm và nông nghiệp.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose rất đƣợc quan tâm nghiên cứu. Một số loại đáng chú ý thuộc giống này nhƣ: Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans. Thermoactinomyces đƣợc tìm thấy trong trầm tích đại dƣơng Streptosporangium đƣợc tìm thấy trong quặng apatit cũng có khả năng phân giải cellulose. Vi khuẩn Các loài vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm: Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii và Pseudomonas nitroreduces.
Các loài này phần lớn là vi sinh vật kị khí, chúng đƣợc phân lập từ ruột của các loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn. Trong lòng đất ngƣời ta cũng phân lập đƣợc các vi khuẩn gram (+) hiếu khí nhƣ: Brevibacillus, Paenibacillus, Bacillus và Geobacillus. Đối với các loài ƣa ấm, PH và nhiệt độ tối ƣu cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 55°C còn đối với các dòng ƣa nhiệt là 5,0 và 75°C. Hiện nay, phần lớn các cellulase trong phòng thí nghiệm và thƣơng mại thu đƣợc từ nấm: chủ yếu là Trichoderma, Aspergillus và Penicillium do hoạt tính enzyme và khả năng thủy phân cao của chúng.
Tuy nhiên, cellulase có nguồn gốc vi khuẩn hấp dẫn hơn do tính đa dạng tự nhiên và tốc độ tăng trƣởng cao của vi khuẩn tiết ra chúng. Quan trọng hơn, vi khuẩn sống trong nhiều hốc môi trƣờng khác nhau có khả năng chọn lọc các chủng phân giải tế bào có khả 6 năng chống lại các áp lực môi trƣờng cực cao. Hơn nữa, những chủng này thƣờng tạo ra các enzyme ổn định trong điều kiện khắc nghiệt. Nhiều chi vi khuẩn đƣợc mô tả trong tài liệu là những nhà sản xuất cellulase ngoại bào, bao gồm: Acetivibrio, Alteromonas, Bacillus, Clostridium, Cellulomonas và Ruminococcus.
Chi Bacillus vẫn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣợc trích dẫn nhiều nhất. Các loài thuộc chi này đƣợc phân lập từ nhiều loại môi trƣờng khác nhau cho phép chúng chống lại các áp lực lý hóa và do đó chúng là những loài sản xuất đầy hứa hẹn tạo ra các enzym phân hủy cellulose ƣa kiềm, ƣa nhiệt, ƣa lạnh, ƣa axit và ƣa mặn. là một trong những vi khuẩn hấp dẫn nhất trong công nghệ sinh học công nghiệp; đặc biệt, đối với việc sản xuất cellulase, chúng thƣờng đƣợc nuôi cấy dễ dàng và nhanh chóng, có rất ít yêu cầu về dinh dƣỡng và tạo ra một lƣợng lớn enzyme. Ngoài ra, gần đây ngƣời ta đã nỗ lực rất nhiều để xác định các chủng Bacillus chịu đƣợc môi trƣờng cực khắc nghiệt: ƣa mặn, ƣa nhiệt, ƣa lạnh, ƣa axit và ƣa kiềm, ƣa khô và các gen của chúng liên quan đến việc sản xuất cellulase.
Chế phẩm vi sinh phân giải cellulose 2.