Nghiên Cứu Về Hệ Enzyme CYP450 Từ Mẫu Nước Suối Tại Đại Học Quốc Gia Hà Nội

• Người hướng dẫn: TS. Hà Thị Quế
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Về Hệ Enzyme CYP450 Từ Mẫu Nước Suối
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hệ Enzyme CYP450 Từ Nước Suối

Hệ enzyme CYP450 (cytochrome P450) là một họ enzyme đa dạng và phân bố rộng rãi, đóng vai trò quan trọng trong nhiều con đường chuyển hóa vật chất trong cơ thể và tự nhiên. CYP450 có mặt ở hầu hết các giới trong hệ thống sinh học, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Thậm chí, các CYP450 của một loài cũng có thể có cấu trúc, chức năng và tính chất khác nhau, đặc biệt là tính đặc hiệu cơ chất. Do đó, CYP450 được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, công nghiệp, môi trường, y dược. Để đáp ứng yêu cầu của các quy trình sản xuất một số sản phẩm sinh học ở quy mô công nghiệp như thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao, trong sự có mặt của một số loại dung môi đòi hỏi các enzyme tham gia vào các quy trình này phải có tính chất đặc biệt như bền nhiệt, chịu dung môi, chịu áp. Vì vậy, việc tìm kiếm các CYP450 bền nhiệt mới từ tự nhiên hoặc gây đột biến định hướng để nâng cao tính bền nhiệt của các CYP450 đã được đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Các enzyme bền nhiệt thường được thu nhận từ các vùng địa nhiệt như suối nước nóng, miệng núi lửa, giàn khoan dầu khí.

1.1. Vai Trò Của Enzyme CYP450 Trong Chuyển Hóa Xenobiotic

Các enzyme CYP450 đóng vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa các hợp chất ngoại sinh (xenobiotic), bao gồm dược phẩm, chất ô nhiễm môi trường và các hóa chất công nghiệp. Quá trình này thường bao gồm các phản ứng pha I, như oxy hóa, hydroxyl hóa, và khử alkyl, giúp tăng tính tan trong nước của các hợp chất, tạo điều kiện cho việc đào thải chúng ra khỏi cơ thể. Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa xenobiotic của CYP450 từ mẫu nước suối có thể cung cấp thông tin quan trọng về độc tính học môi trường và đánh giá rủi ro môi trường.

1.2. Ứng Dụng Của Nghiên Cứu CYP450 Trong Đánh Giá Chất Lượng Nước

Nghiên cứu về hệ enzyme CYP450 từ mẫu nước suối có thể được ứng dụng để đánh giá chất lượng nước và mức độ ô nhiễm nước suối. Sự hiện diện và hoạt động của các isoenzyme CYP450 có thể được sử dụng như biomarker hoặc chỉ thị sinh học để phát hiện các chất ô nhiễm trong nước, bao gồm dược phẩm trong nước và chất gây rối loạn nội tiết. Phân tích hoạt tính enzyme và biểu hiện gen có thể cung cấp thông tin về ảnh hưởng của ô nhiễm đến enzyme và đánh giá nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe môi trường.

II. Thách Thức Nghiên Cứu CYP450 Từ Mẫu Nước Suối Nhiệt Độ Cao

Một trong những lợi thế của Việt Nam là có một mạng lưới hơn ba trăm suối nước nóng vô cùng phong phú, trải dài từ Bắc tới Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu đánh giá về khu hệ vi sinh vật ưa nhiệt ở các suối nước nóng để có thể thấy được tiềm năng và vai trò của chúng đối với hệ sinh thái và con người còn hạn chế. Các enzyme bền nhiệt thường được thu nhận từ các vùng địa nhiệt như suối nước nóng, miệng núi lửa, giàn khoan dầu khí… Mặt khác, suối nước nóng thường có số lượng vi sinh vật rất thấp, chỉ 0,1% tổng số vi sinh vật có thể phân lập được trực tiếp bằng phương pháp truyền thống. Kỹ thuật metagenomics ra đời cho phép các nhà nghiên cứu tiếp cận sâu hơn với hệ gen của vi sinh vật không thông qua nuôi cấy.

2.1. Khó Khăn Trong Phân Lập và Nuôi Cấy Vi Sinh Vật Ưa Nhiệt

Việc phân lập và nuôi cấy vi sinh vật từ nguồn nước có nhiệt độ cao như nước suối tự nhiên gặp nhiều khó khăn do điều kiện môi trường khắc nghiệt và sự phức tạp của hệ sinh thái vi sinh vật. Các phương pháp nuôi cấy truyền thống thường không thể tái tạo đầy đủ các điều kiện tự nhiên, dẫn đến việc bỏ sót nhiều loài vi sinh vật quan trọng. Điều này đặt ra thách thức trong việc nghiên cứu sinh học phân tử và sinh hóa học của hệ enzyme CYP450 từ các vi sinh vật này.

2.2. Giới Hạn Của Phương Pháp Phân Tích Truyền Thống

Các phương pháp phân tích truyền thống, như phương pháp sắc ký và phương pháp khối phổ, có thể không đủ nhạy để phát hiện và định lượng các enzyme CYP450 trong mẫu môi trường phức tạp như mẫu nước suối. Hơn nữa, các phương pháp này thường đòi hỏi quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp, có thể làm mất hoạt tính enzyme hoặc gây sai lệch kết quả. Do đó, cần phát triển các phương pháp phân tích mới, có độ nhạy cao và khả năng phân tích đồng thời nhiều isoenzyme CYP450.

III. Phương Pháp Metagenomics Khám Phá CYP450 Từ Nước Suối

Trong những năm gần đây đã có rất nhiều công bố khai thác những gen mới, protein/enzyme mới của vi sinh vật nhờ kỹ thuật này. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đặt mục tiêu tìm kiếm gen mới mã hóa cho cytochrome P450 từ suối nước nóng Bình Châu – một trong những suối nước nóng có nhiệt độ nóng nhất tại Việt Nam với hy vọng sẽ tìm thấy P450 bền nhiệt mới bằng kỹ thuật không nuôi cấy. Để thực hiện được mục tiêu này, chúng tôi đã thực hiện những nội dung nghiên cứu như sau: - Thu nhận, tách chiết DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu, giải trình tự và xây dựng cơ sở dữ liệu về nhóm gen mã hóa cho P450. - Biểu hiện gen mã hóa P450 mới, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của P450 tái tổ hợp. - Nghiên cứu hệ thống truyền điện tử và xác định phổ cơ chất tiềm năng của enzyme thu được.

3.1. Tách Chiết DNA Metagenome Từ Mẫu Nước Suối

Quá trình tách chiết DNA metagenome từ mẫu nước suối là bước quan trọng để thu thập thông tin di truyền của toàn bộ cộng đồng vi sinh vật. Việc sử dụng các phương pháp tách chiết hiệu quả giúp đảm bảo thu được lượng DNA đủ lớn và chất lượng cao, phù hợp cho các bước phân tích tiếp theo, như giải trình tự gen và phân tích tin sinh học. Các phương pháp này cần tối ưu hóa để loại bỏ các chất ức chế PCR và đảm bảo tính đại diện của mẫu.

3.2. Giải Trình Tự Gen và Xây Dựng Cơ Sở Dữ Liệu CYP450

Giải trình tự DNA metagenome bằng các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) cho phép thu thập lượng lớn dữ liệu về trình tự gen của cộng đồng vi sinh vật. Dữ liệu này sau đó được sử dụng để xây dựng cơ sở dữ liệu về các gen mã hóa enzyme CYP450. Quá trình này bao gồm các bước tiền xử lý dữ liệu, lắp ráp trình tự, dự đoán gen, và chú thích chức năng, sử dụng các công cụ tin sinh học chuyên dụng.

3.3. Phân Tích Tin Sinh Học Tìm Kiếm Gen Mã Hóa CYP450 Mới

Phân tích tin sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân tích các gen mã hóa enzyme CYP450 từ dữ liệu metagenome. Các công cụ và thuật toán tin sinh học được sử dụng để tìm kiếm các trình tự gen tương đồng với các CYP450 đã biết, dự đoán cấu trúc protein, và phân tích chức năng enzyme. Quá trình này giúp xác định các CYP450 mới có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp và môi trường.

IV. Biểu Hiện và Nghiên Cứu Tính Chất Enzyme CYP450 Tái Tổ Hợp

Biểu hiện gen mã hóa P450 mới, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của P450 tái tổ hợp. - Nghiên cứu hệ thống truyền điện tử và xác định phổ cơ chất tiềm năng của enzyme thu được. CYP450 (viết tắt là CYP hoặc P450) là các protein enzyme có chứa phân tử sắt, đã được phát hiện và nghiên cứu trên 55 năm nay. Có thể nói, P450 là họ enzyme phân bố rộng rãi nhất, đa dạng nhất và có mặt trong tất cả các giới trong hệ thống sinh vật học, từ vi sinh vật đến thực vật, động vật và con người [1]. Sở dĩ nhóm enzyme có tên gọi cytochrome P450 vì chúng có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 450 nm khi bão hòa trong khí CO.

4.1. Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen Mã Hóa CYP450

Để nghiên cứu tính chất của enzyme CYP450, cần thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa enzyme trong các hệ thống biểu hiện phù hợp, như vi khuẩn E. coli. Vector biểu hiện cần chứa các yếu tố điều khiển biểu hiện mạnh, như promoter và terminator, để đảm bảo sản xuất lượng lớn enzyme. Quá trình này cũng bao gồm tối ưu hóa codon để tăng hiệu quả dịch mã.

4.2. Tinh Sạch Protein CYP450 Tái Tổ Hợp

Sau khi biểu hiện gen, cần tinh sạch protein CYP450 tái tổ hợp để loại bỏ các protein và tạp chất khác. Các phương pháp tinh sạch protein thường được sử dụng bao gồm sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, và sắc ký lọc gel. Quá trình này cần được thực hiện cẩn thận để bảo toàn hoạt tính enzyme và đảm bảo độ tinh khiết cao.

4.3. Xác Định Đặc Tính Enzyme CYP450 Tái Tổ Hợp

Sau khi tinh sạch, cần xác định các đặc tính của enzyme CYP450 tái tổ hợp, bao gồm hoạt tính enzyme, tính đặc hiệu cơ chất, và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH) đến hoạt tính enzyme. Các phương pháp phân tích enzyme thường được sử dụng bao gồm quang phổ UV-Vis, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), và khối phổ (MS).

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu CYP450 Trong Xử Lý Ô Nhiễm Nước

Các P450 là các monooxygenase bên ngoài, do đó, chúng cần một chất cho điện tử để khởi động quá trình oxy hóa và hydroxyl hóa cơ chất (Bernhardt, 2006) như sơ đồ phản ứng sau: RH + O2 + NAD(P)H + H+→ROH + H2O + NAD(P)+ Số lượng các gen mã hóa cho các P450 ở tất cả các loài trong hệ thống sinh vật học hiện nay là khoảng hơn 37.000 trình tự được công bố trên Ngân hàng gen và số lượng này tiếp tục được tăng lên khi các nhóm nghiên cứu tìm ra được các gen P450 mới ở các loài sinh vật khác nhau. Năm 2009, Nelson và cộng sự [2] đã tổng kết có khoảng 3282 gen P450 của động vật, 1015 gen P450 của vi khuẩn, 22 gen P450 của cổ khuẩn và 2 gen P450 từ virus thì hiện nay đã có 30171 gen P450 của động vật, 7606 gen P450 của vi khuẩn, 70 gen P450 của cổ khuẩn và 14 gen P450 của virus.

5.1. Phát Triển Công Nghệ Xử Lý Nước Thải Dựa Trên CYP450

Nghiên cứu về hệ enzyme CYP450 có thể mở ra cơ hội phát triển các công nghệ xử lý nước thải hiệu quả hơn. Các enzyme CYP450 có khả năng phân hủy nhiều loại chất ô nhiễm trong nước, bao gồm dược phẩm môi trường và chất gây rối loạn nội tiết. Việc sử dụng enzyme CYP450 trong các hệ thống xử lý nước thải có thể giúp loại bỏ dược phẩm khỏi nước và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

5.2. Ứng Dụng CYP450 Trong Giám Sát Chất Lượng Nước

Các enzyme CYP450 có thể được sử dụng như biomarker để giám sát chất lượng nước và phát hiện các chất ô nhiễm tiềm ẩn. Việc phát triển các phương pháp phân tích nhanh và chính xác dựa trên hoạt tính enzyme và biểu hiện gen có thể giúp cải thiện hiệu quả hệ thống giám sát nước và bảo vệ nguồn nước.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về CYP450

Mặt dù có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau nhưng cytochrome P450 có một vài hạn chế như độ ổn định kém, hoạt tính thấp [3], [4]. Việc tìm ra cytochrome P450 bền nhiệt có thể cải thiện độ ổn định của enzyme này [5]. Sự phân bố rộng rãi của chúng trong tự nhiên là tiềm năng lớn cho việc khám phá và khai thác cytochrome P450 bền nhiệt từ các chủng vi sinh vật chịu nhiệt [6], [7]. Lý do số lượng các P450 mới tiếp tục tăng lên nhanh chóng, thu hút sự tập trung nghiên cứu của các nhà khoa học là do nhóm enzyme này có khả năng ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp, môi trường, y học, dược học, nông nghiệp khi chúng tham gia vào hơn 20 loại phản ứng xúc tác khác nhau bao gồm hydroxyl hóa các hợp chất hydrocarbon, các hợp chất vòng thơm, các hợp chất nitơ, dealkyl hóa các hợp chất nitơ, các hợp chất oxy, các hợp chất lưu huỳnh, epoxide hóa các hợp chất alkene, các hợp chất arene, oxy hóa các hợp chất nitơ, các hợp chất lưu huỳnh, các hợp chất alkyne, deamine oxy hóa, oxy hóa khử các hợp chất halogen, oxy hóa các hợp chất alcohol và aldehyde, dehydro hóa, dehydrate hóa, khử các hợp chất N-oxide, khử các hợp chất epoxide, khử NO, phân nhánh hóa và oxy hóa mối liên kết C-C…

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu CYP450 Trong Tương Lai

Nghiên cứu về hệ enzyme CYP450 từ mẫu nước suối có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về vai trò của enzyme này trong môi trường và phát triển các ứng dụng tiềm năng trong quản lý chất lượng nước và bảo vệ nguồn nước. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc khám phá các CYP450 mới có hoạt tính cao và khả năng phân hủy các chất ô nhiễm khó phân hủy.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về CYP450 Bền Nhiệt

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tìm kiếm và phân tích các CYP450 bền nhiệt từ các nguồn nước có nhiệt độ cao. Các enzyme này có tiềm năng ứng dụng lớn trong các quy trình công nghiệp và môi trường đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt. Việc nghiên cứu cấu trúc và cơ chế hoạt động của các CYP450 bền nhiệt có thể giúp phát triển các enzyme có hoạt tính cao và ổn định hơn.