Luận án nghiên cứu vai trò của nhóm gen mã hóa deubiquitinase và một số tín hiệu phân tử trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn

Nghiên cứu vai trò của nhóm gen deubiquitinase và tín hiệu phân tử trong bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế bệnh.

• Tác giả: NCS. Đỗ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Xuân
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Vai Trò Của Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase Trong Bệnh Tăng Hồng Cầu Vô Căn
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 1.1.1. Khái quát bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 1.1.2. Một số nghiên cứu về kiểu hình miễn dịch trên bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 1.1.3. Một số nghiên cứu về đột biến gen trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 1.2. Tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 1.2.1. Khái niệm và đặc điểm sinh học của tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 1.2.2. Chức năng của tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 1.2.3. Các marker sinh học liên quan đến quá trình apoptosis
• 1.2.4. Một số gen kiểm soát miễn dịch
• 1.2.5. Một số cytokine sử dụng trong nghiên cứu
• 1.2.6. Nghiên cứu sử dụng tế bào đơn nhân máu ngoại vi trên bệnh THCVC
• 1.3. Một số gen thuộc nhóm deubiquitinase và mối liên hệ với các tín hiệu phân tử
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng và tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
• 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.1.3. Hóa chất sử dụng
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Xét nghiệm sinh hóa máu
• 2.2.2. Tách huyết tương
• 2.2.3. Tách chiết DNA và RNA
• 2.2.4. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger và phân tích dữ liệu
• 2.2.5. Tổng hợp cDNA
• 2.2.6. Real-Time PCR
• 2.2.7. Một số phương pháp tin sinh sử dụng trong luận án
• 2.2.8. Đưa siRNA vào trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 2.2.9. Phân lập và nuôi cấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 2.2.10. Đếm tế bào theo dòng chảy
• 2.2.11. Xác định sự di cư tế bào
• 2.2.12. ELISA phân tích nồng độ cytokine
• 2.2.13. Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.1. Chỉ số sinh hóa máu bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.2. Phân tích sự biểu hiện một số gen deubiquitinase trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.3. Mức độ biểu hiện một số gen tín hiệu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.4. Biểu hiện một số gen kiểm soát miễn dịch trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.5. Phân tích đột biến gen JAK2 trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.6. Phân tích đột biến gen CYLD trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.7. Phân tích đột biến gen A20 trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.8. Phân tích đột biến gen Cezanne trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.9. Kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.10. Sự tiết cytokine và kháng nguyên ung thư ở bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.2. Kết quả nghiên cứu trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.2. A20 điều hòa kiểu hình miễn dịch tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.3. A20 điều hòa sự tiết cytokine
• 3.2.4. A20 điều hòa sự di cư tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.5. Protein A20 điều hòa quá trình apoptosis tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.6. Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.7. Otubain-1 điều hòa các sản phẩm cytokine
• 3.2.8. Otubain-1 điều hòa tín hiệu trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 4. CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN
• 4.1. Đa hình và biểu hiện gen deubiquitinase, gen JAK2 và kiểu hình miễn dịch trên bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 4.2. Biểu hiện một số gen tín hiệu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 4.3. Vai trò gen A20 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 4.4. Vai trò gen Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục tài liệu

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Nghiên cứu về nhóm gen mã hóa deubiquitinase (DUB) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử, đặc biệt trong bối cảnh bệnh tăng hồng cầu vô căn (THCVC). Nhóm gen này bao gồm các gen như A20, Otubain-1, CYLD và Cezanne, có vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá trình sinh học của tế bào. Việc hiểu rõ vai trò của chúng có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh nhân THCVC.

1.1. Định Nghĩa Và Tầm Quan Trọng Của Deubiquitinase

Deubiquitinase là enzyme có khả năng loại bỏ chuỗi ubiquitin khỏi protein, từ đó điều chỉnh sự ổn định và hoạt động của chúng. Sự bất thường trong hoạt động của DUB có thể dẫn đến nhiều bệnh lý, bao gồm cả ung thư và các bệnh tự miễn.

1.2. Mối Liên Hệ Giữa Deubiquitinase Và Bệnh Tăng Hồng Cầu Vô Căn

Nghiên cứu cho thấy rằng sự biểu hiện bất thường của các gen DUB có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh THCVC. Các gen như A20 và CYLD có vai trò trong việc điều hòa phản ứng viêm và sự phát triển của tế bào máu.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Bệnh Tăng Hồng Cầu Vô Căn

Bệnh THCVC là một trong những bệnh lý phức tạp, với nhiều yếu tố tác động. Việc xác định nguyên nhân chính xác và cơ chế bệnh sinh vẫn còn là thách thức lớn. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào đột biến gen JAK2, nhưng vai trò của nhóm gen mã hóa deubiquitinase vẫn chưa được làm rõ.

2.1. Những Thách Thức Trong Chẩn Đoán Bệnh

Chẩn đoán bệnh THCVC thường gặp khó khăn do triệu chứng không đặc hiệu và sự chồng chéo với các bệnh lý khác. Việc phát hiện sớm và chính xác là rất quan trọng để cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Xác Định Vai Trò Của Gen DUB

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về gen DUB, nhưng việc xác định vai trò cụ thể của chúng trong bệnh THCVC vẫn còn hạn chế. Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn để làm rõ mối liên hệ này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Vai Trò Của Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Để nghiên cứu vai trò của nhóm gen DUB trong bệnh THCVC, các phương pháp hiện đại như PCR, giải trình tự gen và phân tích tế bào được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định sự biểu hiện và đa hình của các gen DUB trong mẫu bệnh nhân.

3.1. Phương Pháp PCR Để Xác Định Biểu Hiện Gen

Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen DUB, từ đó xác định mức độ biểu hiện của chúng trong tế bào máu của bệnh nhân THCVC. Kết quả cho thấy sự biểu hiện bất thường của các gen này.

3.2. Phân Tích Tế Bào Để Đánh Giá Chức Năng

Phân tích tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) giúp đánh giá chức năng của các tế bào miễn dịch và mối liên hệ với sự biểu hiện của gen DUB. Kết quả cho thấy sự thay đổi trong thành phần tế bào miễn dịch ở bệnh nhân THCVC.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh nhân THCVC có sự biểu hiện bất thường của các gen DUB như A20, CYLD và Cezanne. Sự thay đổi này có thể liên quan đến sự gia tăng số lượng tế bào miễn dịch và nồng độ cytokine trong máu.

4.1. Biểu Hiện Gen DUB Ở Bệnh Nhân THCVC

Nghiên cứu cho thấy rằng các gen DUB như A20 và CYLD có biểu hiện thấp hơn so với nhóm chứng khỏe mạnh. Điều này có thể ảnh hưởng đến khả năng điều hòa miễn dịch của bệnh nhân.

4.2. Tác Động Của Gen DUB Đến Tế Bào Miễn Dịch

Sự biểu hiện bất thường của gen DUB có thể dẫn đến sự gia tăng tế bào T điều hòa và cytokine trong máu, từ đó ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân THCVC.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Nhóm Gen DUB

Nghiên cứu về nhóm gen mã hóa deubiquitinase mở ra hướng đi mới trong việc hiểu rõ cơ chế bệnh sinh của bệnh THCVC. Việc xác định vai trò của các gen này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Gen DUB

Nghiên cứu về gen DUB không chỉ giúp hiểu rõ hơn về bệnh THCVC mà còn có thể áp dụng cho nhiều bệnh lý khác liên quan đến rối loạn miễn dịch và ung thư.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của gen DUB và mối liên hệ của chúng với các yếu tố sinh học khác để phát triển các liệu pháp điều trị mới cho bệnh nhân THCVC.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh tăng hồng cầu vô căn (Polycythemia vera - PV hay THCVC) là bệnh ung thư máu thuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy ác tính (Myeloproliferative neoplasms - MPNs) không có nhiễm sắc thể Philadelphia mang tổ hợp gen BCR-ABL1. Bệnh đặc trưng bởi sự biến đổi bất thường của các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương, dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các dòng tế bào máu, đặc biệt là dòng hồng cầu. Sự gia tăng quá mức khối lượng hồng cầu làm tăng độ nhớt máu, giảm tốc độ lưu thông tuần hoàn và gia tăng nguy cơ tắc mạch, huyết khối. Đột biến điểm soma V617F trên exon 14 của gen JAK2 (rs77375493) và đột biến trên exon 12 của gen này được xác định là nguyên nhân chính gây hoạt hóa quá mức con đường tín hiệu JAK-STAT. Tuy nhiên, các biến đổi di truyền tế bào chỉ xuất hiện ở dưới 25% bệnh nhân và cơ chế bệnh sinh phân tử, đặc biệt là vai trò của các gen điều hòa sau dịch mã và hệ miễn dịch ngoại vi, vẫn còn nhiều khoảng trống chưa được làm sáng tỏ.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là:

• Chưa có công trình nào khảo sát toàn diện vai trò của nhóm enzyme deubiquitinase (DUB) gồm A20, Otubain-1, Otubain-2, CYLD và Cezanne trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn.
• Mối liên hệ giữa sự biểu hiện/đa hình của các gen DUB với các gen kiểm soát miễn dịch (Klotho, LAG3, CTLA4, PD1), các gen truyền tín hiệu nội bào (SHP-1, SHP-2, IκB-α, họ STAT) và kiểu hình miễn dịch của tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) trên bệnh nhân THCVC chưa được xác định.
• Cơ chế phân tử của gen A20 và gen Otubain-1 trong việc điều hòa các chức năng sinh học của tế bào PBMC (sự biệt hóa, trưởng thành, tiết cytokine, di cư và quá trình chết theo chương trình apoptosis) còn chưa được nghiên cứu thực nghiệm đầy đủ.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 mục tiêu:

1. Xác định vai trò của gen A20 và gen Otubain-1 điều hòa chức năng sinh học tế bào PBMC bao gồm sự thuần thục, sự biệt hóa và sự chết apoptosis.
2. Xác định mức độ biểu hiện mRNA/đa hình của một số gen mã hóa deubiquitinase, gen tín hiệu liên quan và kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân THCVC và người khỏe mạnh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 77 mẫu bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh tăng hồng cầu vô căn và 55 mẫu đối chứng từ người khỏe mạnh. Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng 150 ml máu toàn phần từ người tình nguyện hiến máu khỏe mạnh để phân lập tế bào PBMC phục vụ các thử nghiệm nuôi cấy và can thiệp in vitro.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Hệ gen học miễn dịch và Phòng Hệ gen học chức năng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp với các cơ sở huyết học lâm sàng.
• Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2022, thuộc khuôn khổ đề tài nghiên cứu cấp Bộ Khoa học và Công nghệ (Mã số: ĐTĐL.CN-43/21).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh lý tăng sinh tủy, tế bào miễn dịch ngoại vi và hệ thống enzyme khử ubiquitin:

• Phân loại và dịch tễ học bệnh tăng sinh tủy: Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại MPNs thành 6 thể bệnh, trong đó nhóm không có nhiễm sắc thể Philadelphia gồm THCVC, tăng tiểu cầu tiền phát (ET) và xơ tủy nguyên phát (PM). Dịch tễ học tại Hoa Kỳ (năm 2014) ghi nhận tỷ lệ mắc từ 2,5 đến 10 ca/100.000 dân. Tại Châu Âu giai đoạn 1995–2002, tỷ lệ sống sót sau 5 năm đạt 84,8%, giảm xuống 79,4% ở nhóm bệnh nhân trên 70 tuổi.
• Đột biến gen trong bệnh THCVC: Bench và cộng sự (2003) đưa ra hướng dẫn chẩn đoán dựa trên xét nghiệm đột biến JAK2 V617F. Đột biến trên exon 12 của JAK2 xuất hiện ở 2-3% trường hợp âm tính với V617F, thường gặp ở người trẻ có nồng độ hemoglobin cao. Nghiên cứu của Misa Imai và cộng sự (2013) khảo sát đột biến chèn/mất đoạn trên exon 9 của gen CALR ở bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát. Nghiên cứu của Yu-Cheng Chang và cộng sự (2017) báo cáo các đột biến soma và germline ở bệnh nhân THCVC bằng giải trình tự gen thế hệ mới.
• Tế bào đơn nhân máu ngoại vi và đáp ứng miễn dịch: PBMC người bình thường chứa 70–90% tế bào lympho (T CD3+ chiếm 45–70%, T CD4+ chiếm 25–60%, T CD8+ chiếm 5–30%, tế bào B chiếm 5–15%, tế bào NK chiếm 5–10%), 10–30% bạch cầu đơn nhân, 1–2% tế bào tua (DC) và 0,1–0,2% tế bào gốc tạo máu CD34+. Kornberg A. và cộng sự chứng minh bạch cầu đơn nhân ở bệnh nhân THCVC tăng sản xuất yếu tố mô (TF) gấp 21 lần khi kích thích bằng endotoxin so với mức tăng 3,9–4,5 lần ở nhóm chứng, làm tăng mảnh prothrombin F1+2 lên 2,46 nM (so với 0,22–0,32 nM ở người bình thường).
• Các thụ thể kiểm soát miễn dịch và cytokine: Kuro-o và cộng sự (1997) phát hiện gen Klotho trên nhiễm sắc thể 13 ở người. Triebel và cộng sự (1990) phát hiện gen LAG3 trên nhiễm sắc thể 12 liền kề CD4. Vai trò của CTLA4 và PD-1 trong việc kiệt quệ tế bào T và duy trì tế bào T điều hòa (Treg Foxp3+) được tổng hợp cùng các nghiên cứu về cytokine tiền viêm (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70) và dấu ấn ung thư CA125.
• Hệ thống enzyme deubiquitinase (DUB): Masahiro Marshall Nakagawa và cộng sự chứng minh thiếu hụt A20 (TNFAIP3) dẫn đến bệnh lý tự viêm và tăng sinh tủy. Melania Tesio và cộng sự (2015) chỉ ra CYLD kiểm soát trạng thái ngủ của tế bào gốc tạo máu (dHSC) thông qua tương tác CYLD-TRAF2 và ức chế p38MAPK. Junting Cai nghiên cứu vai trò của USP50 và USP7 trong quá trình tạo hồng cầu. Borodovsky và cộng sự (2002) phát hiện Otubain-1; Durocher (2010) mô tả cơ chế hoạt động độc lập và phụ thuộc của Otubain-1; Xiaofei Zhou và cộng sự (2019) xác định Otubain-1 điều hòa tế bào T CD8+ và NK thông qua trục AKT/IL-15. David Komander và cộng sự (2012) chứng minh Cezanne (OTUD7B) có tính đặc hiệu cao trong phân cắt chuỗi polyubiquitin liên kết Lys11.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Bộ Y tế đã ban hành các hướng dẫn chẩn đoán và điều trị theo Quyết định số 1494/QĐ-BYT (năm 2015) và Quyết định số 1832/QĐ-BYT (năm 2022). Các nghiên cứu trong nước trước đây (như công bố năm 2013 trên Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh trên 30 bệnh nhân) chủ yếu khảo sát tỷ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết học lâm sàng.

Vị trí của luận án: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới tiến hành phân tích đồng bộ mức độ biểu hiện và đa hình đơn nucleotide (SNP) của nhóm gen DUB (A20, CYLD, Cezanne, Otubain-1, Otubain-2) kết hợp với các gen kiểm soát miễn dịch và các con đường tín hiệu nội bào trên bệnh nhân THCVC; đồng thời làm sáng tỏ cơ chế điều hòa miễn dịch in vitro của A20 và Otubain-1 trên tế bào PBMC.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết điều hòa sau dịch mã bằng con đường ubiquitin-proteasome và quá trình khử ubiquitin bởi các enzyme DUB. Các DUB phân cắt liên kết isopeptide giữa ubiquitin và protein đích (liên kết K63, K48, K11 hoặc M1), từ đó điều hòa sự ổn định protein, quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào và kiểm soát cân bằng nội môi miễn dịch. Khung phân tích tập trung vào mối tương tác giữa:

1. Sự biến đổi di truyền và biểu hiện của các gen DUB.
2. Các trục tín hiệu sống còn và tăng sinh: JAK-STAT (STAT1, STAT3, STAT5, STAT6, SHP-1, SHP-2) và NF-κB (qua IκB-α, TRAF, DISC, Caspase-8, JNK, p38MAPK).
3. Kiểu hình miễn dịch tế bào PBMC và các điểm kiểm soát miễn dịch (Klotho, PD-1, CTLA-4, LAG-3).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa phân tích di truyền phân tử lâm sàng và thực nghiệm sinh học tế bào in vitro:

Nhóm kỹ thuật	Mục đích / Chỉ số phân tích	Thiết bị / Hóa chất / Công cụ chính
Huyết học & Sinh hóa	Đánh giá các chỉ số tế bào máu và sinh hóa lâm sàng	Máy xét nghiệm tự động tại bệnh viện
Phân lập & Nuôi cấy PBMC	Tách PBMC từ máu toàn phần (150 ml) người hiến	Ly tâm phân lớp tỷ trọng Ficoll-Paque, kính hiển vi quang học (độ phóng đại 40x)
Sinh học phân tử	Tách chiết DNA/RNA tổng số, tổng hợp cDNA, định lượng biểu hiện mRNA	Kỹ thuật Real-Time PCR (mồi đặc hiệu cho DUB, STATs, SHP, điểm kiểm soát miễn dịch)
Giải trình tự di truyền	Xác định đa hình/đột biến gen JAK2, CYLD, A20, Cezanne	Phương pháp giải trình tự Sanger, phân tích cân bằng Hardy-Weinberg (HWE)
Tin sinh học	Dự đoán tác động gây bệnh của các biến thể vị trí cắt nối (splice site)	Phần mềm SD-Score và MaxEntScan
Can thiệp biểu hiện gen	Bất hoạt gen mục tiêu trên PBMC nuôi cấy in vitro	Chuyển nạp hạt siRNA (siRNA-A20, siRNA-Otubain-1)
Đếm tế bào dòng chảy	Xác định kiểu hình miễn dịch bề mặt và quá trình apoptosis	Máy Flow cytometry; kháng thể huỳnh quang kháng CD3, CD4, CD8, CD11b, CD19, CD25, CD40, CD44, CD56, Foxp3; nhuộm Annexin V, Caspase-3, Propidium Iodide (PI)
Thử nghiệm di cư tế bào	Đánh giá khả năng di chuyển của PBMC sau khi ức chế gen	Buồng đo di cư tế bào (Transwell migration assay)
Miễn dịch gắn enzyme	Đo nồng độ cytokine và kháng nguyên khối u trong huyết tương/dịch nổi	Kỹ thuật ELISA đo IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70, CA125

Nghiên cứu đã được thông qua bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học theo các quy định hiện hành.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng quan về bệnh tăng hồng cầu vô căn (định nghĩa, phân loại MPNs theo WHO, dịch tễ học, các triệu chứng lâm sàng và cơ chế hình thành khối u tủy xương). Tác giả phân tích chi tiết cơ chế truyền tín hiệu của trục JAK2/STAT, vai trò của đột biến soma V617F tại exon 14 và các đột biến trên exon 12 của JAK2, đột biến gen CALR trên exon 9.

Chương 1 cũng trình bày đặc điểm sinh học và thành phần các quần thể tế bào trong PBMC, các dấu ấn apoptosis (Annexin V gắn Phosphatidylserine, Caspase-3, Propidium Iodide kích thích ở bước sóng 488 nm phát xạ cực đại tại 617 nm), các gen điểm kiểm soát miễn dịch (Klotho, PD-1, LAG3, CTLA4) và vai trò của các cytokine viêm (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70) cùng dấu ấn CA125. Cấu trúc, cơ chế sinh học và chức năng của từng gen DUB được phân tích sâu:

• A20 (TNFAIP3): Dài 775 axit amin (87,6 kDa), chứa miền OTU ở đầu N khử ubiquitin K63 và 7 miền ngón tay kẽm (ZnF) ở đầu C có hoạt tính ubiquitin ligase E3; điều hòa ức chế NF-κB, IκB-α, STAT-1, tương tác phức hợp DISC và ức chế JNK.
• Otubain-1 (OTUB1): Nằm trên nhiễm sắc thể 11q13.1, hoạt động theo cơ chế độc lập (cắt chuỗi ubiquitin) và phụ thuộc (ức chế enzyme liên hợp ubiquitin E2 như UBCH5, UBC13); điều hòa các trục tín hiệu MAPK, ERα, FOXM1, P53, SMAD2/TGF-β, RAS và AKT.
• CYLD: Dài 956 axit amin trên nhiễm sắc thể 16q12.1, chứa 3 miền CAP-GLY và miền xúc tác USP; phân cắt đặc hiệu chuỗi K63/M1 trên TRAF, NEMO, RIP1, TAK1, Bcl-3 nhằm ức chế NF-κB, JNK, Wnt/β-catenin; tương tác với Plk1, tubulin, CEP192 để kiểm soát chu kỳ tế bào và thoi phân bào.
• Cezanne (OTUD7B): Đặc hiệu cao với chuỗi polyubiquitin liên kết Lys11, đối kháng quá trình ubiquitin hóa của phức hợp APC/C trong phân bào và điều hòa tín hiệu NF-κB.

Chương kết thúc bằng việc điểm lại tình hình nghiên cứu bệnh THCVC tại Việt Nam và trên thế giới.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ cho 77 bệnh nhân THCVC và 55 người khỏe mạnh. Chương mô tả danh mục hóa chất, sinh phẩm, trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR và Real-Time PCR (định lượng biểu hiện các gen DUB, gen tín hiệu STAT1/3/5/6, SHP1/2, gen kiểm soát miễn dịch Klotho, LAG3, CTLA4, PD1).

Quy trình giải trình tự Sanger để xác định SNP trên gen JAK2, CYLD, A20, Cezanne được mô tả đầy đủ thành phần phản ứng và chu nhiệt. Quy trình phân lập PBMC bằng ly tâm tỷ trọng Ficoll, quy trình đưa siRNA (siRNA-A20, siRNA-Otubain-1) vào PBMC nuôi cấy, phương pháp đo dòng chảy tế bào (Flow cytometry) đa màu, thử nghiệm buồng di cư Transwell và quy trình ELISA đo nồng độ cytokine (IL-6, TNF-α, IL-1β) cùng kháng nguyên CA125 được chuẩn hóa chi tiết. Phần cuối chương trình bày phê duyệt đạo đức nghiên cứu y sinh.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Kết quả được trình bày thành hai phần thực nghiệm chính:

3.1 Kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn

• Chỉ số sinh hóa máu: Xác định tỷ lệ bệnh nhân THCVC có các chỉ số huyết học và sinh hóa tăng cao bất thường so với giới hạn bình thường.
• Biểu hiện gen DUB và gen tín hiệu: Định lượng Real-Time PCR cho thấy bệnh nhân THCVC có sự giảm biểu hiện rõ rệt của các gen DUB gồm A20, CYLD và Cezanne so với nhóm chứng khỏe mạnh. Các gen tín hiệu thuộc họ STAT (STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6) và các phosphatase SHP-1, SHP-2 có sự biến đổi biểu hiện tương ứng.
• Biểu hiện gen kiểm soát miễn dịch: Mức độ biểu hiện mRNA của gen Klotho, LAG3, CTLA4 và PD1 giảm ở bệnh nhân THCVC so với người khỏe mạnh.
• Phân tích đa hình di truyền (SNP):
  • Gen JAK2: Xác định tần số kiểu gen và alen của đột biến JAK2 V617F ở bệnh nhân THCVC so với nhóm chứng.
  • Gen CYLD: Xác định được 11 SNP trên gen CYLD ở bệnh nhân THCVC. Đáng chú ý, phát hiện SNP mới p.W736G nằm trên exon 15 chưa từng được công bố trước đó. Phần mềm SD-Score và MaxEntScan dự đoán 2 SNP biến thể tại vị trí cắt nối c.2483+6 T>G có khả năng gây bệnh cao. Phân tích liên kết cho thấy các bệnh nhân mang SNP p.W736G đồng thời mang nhiều SNP khác trong gen CYLD.
  • Gen A20 và Cezanne: Phân tích tần số kiểu gen các SNP trên A20 và Cezanne; ghi nhận bệnh nhân mang SNP p.W736G trên CYLD không xuất hiện SNP đồng thời trên gen A20 hoặc Cezanne.
• Kiểu hình miễn dịch và cytokine lưu hành: Phân tích Flow cytometry cho thấy bệnh nhân THCVC có sự gia tăng tỷ lệ tế bào T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg: CD4+CD25+Foxp3+) trong máu tuần hoàn. Đo nồng độ bằng ELISA ghi nhận nồng độ cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α tăng cao trong huyết thanh bệnh nhân THCVC, cùng với sự thay đổi của nồng độ CA125.

3.2 Kết quả nghiên cứu trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC)

• Nuôi cấy và can thiệp gen: Phân lập thành công PBMC từ máu người khỏe mạnh và chuyển nạp siRNA đặc hiệu để bất hoạt gen A20 và Otubain-1.
• Vai trò của gen A20: Khi làm bất hoạt gen A20 bằng siRNA-A20 trên PBMC:
  • Tăng tỷ lệ hoạt hóa các phân nhóm tế bào miễn dịch: tế bào tủy (CD11b+CD40+), tế bào T (CD3+CD25+) và tế bào B (CD19+CD25+).
  • Tăng giải phóng các cytokine tiền viêm TNF-α và IL-1β vào môi trường nuôi cấy.
  • Tăng khả năng di cư của tế bào PBMC qua màng Transwell.
  • Tăng tỷ lệ tế bào đi vào quá trình chết apoptosis (đánh giá qua Annexin V, Caspase-3 và PI), chứng minh protein A20 nội sinh có vai trò bảo vệ tế bào PBMC khỏi apoptosis và ức chế hoạt hóa miễn dịch quá mức.
• Vai trò của gen Otubain-1: Khi bất hoạt gen Otubain-1 bằng siRNA-Otubain-1 trên PBMC:
  • Tăng tỷ lệ hoạt hóa của tế bào diệt tự nhiên NK (CD56+CD44+).
  • Thay đổi mức giải phóng cytokine trong dịch nổi nuôi cấy.
  • Tăng mức độ biểu hiện của các gen truyền tín hiệu nội bào SHP-1 và STAT-6, chứng minh Otubain-1 có vai trò ức chế hoạt hóa tế bào NK và kìm hãm biểu hiện của SHP-1 và STAT-6.

Nhóm đối tượng / Thử nghiệm	Chỉ số / Gen phân tích	Kết quả chính ghi nhận trong luận án
Bệnh nhân THCVC (n=77)	Biểu hiện gen DUB	Biểu hiện A20, CYLD, Cezanne bị giảm (bất hoạt)
Bệnh nhân THCVC (n=77)	Gen kiểm soát miễn dịch	Giảm biểu hiện mRNA của Klotho, LAG3, CTLA4, PD1
Bệnh nhân THCVC (n=77)	Đột biến/SNP gen CYLD	Xác định 11 SNP; phát hiện SNP mới p.W736G (exon 15) và 2 biến thể vị trí cắt nối c.2483+6 T>G
Bệnh nhân THCVC (n=77)	Kiểu hình miễn dịch & Cytokine	Tăng tế bào CD25+CD4+, Th1, Treg; tăng nồng độ IL-6 và TNF-α
PBMC can thiệp in vitro	Knockdown A20 (siRNA)	Tăng CD11b+CD40+, CD3+CD25+, CD19+CD25+; tăng tiết TNF-α, IL-1β; tăng di cư; tăng apoptosis
PBMC can thiệp in vitro	Knockdown Otubain-1 (siRNA)	Tăng hoạt hóa tế bào NK (CD56+CD44+); tăng biểu hiện SHP-1 và STAT-6

Chương 4: Thảo luận

Tác giả thảo luận về ý nghĩa sinh học của sự suy giảm biểu hiện các gen DUB (A20, CYLD, Cezanne) trên bệnh nhân THCVC:

• Sự bất hoạt các gen DUB dẫn đến mất khả năng kìm hãm con đường NF-κB và STAT, giải thích cho hiện tượng tăng sản xuất các cytokine viêm (IL-6, TNF-α) và kích thích tăng sinh dòng tế bào tủy.
• Mối liên hệ giữa đa hình di truyền trên gen CYLD (đặc biệt là biến thể mới p.W736G và các biến thể cắt nối) với cơ chế bệnh sinh của bệnh tăng sinh tủy.
• Sự gia tăng tỷ lệ tế bào T điều hòa (Treg) trong máu tuần hoàn là một trạng thái bất lợi, góp phần ức chế đáp ứng miễn dịch chống khối u của cơ thể.
• Biện giải cơ chế hoạt động của A20 trong việc kiểm soát sự hoạt hóa của tế bào lympho T, B, tủy bào và ức chế cytokine viêm thông qua phức hợp DISC và tín hiệu JNK.
• Biện giải vai trò của Otubain-1 trong việc điều hòa chức năng tế bào NK và con đường truyền tín hiệu SHP-1/STAT-6.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các kết quả đạt được đối với 2 mục tiêu nghiên cứu và đưa ra các kiến nghị khoa học tiếp theo.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Phát hiện di truyền mới trên gen CYLD: Xác định được 11 SNP trên gen CYLD ở bệnh nhân THCVC; trong đó phát hiện SNP mới p.W736G thuộc exon 15 và 2 biến thể tại vị trí cắt nối p.2483+6 T>G được dự đoán bằng công cụ tin sinh học (SD-Score, MaxEntScan) là có khả năng liên quan trực tiếp đến cơ chế sinh bệnh THCVC. Bệnh nhân mang SNP p.W736G có nhiều SNP đồng thời trong CYLD nhưng không mang SNP trong gen A20 hoặc Cezanne.
2. Đặc trưng biểu hiện gen và miễn dịch ở bệnh nhân THCVC: Chứng minh bệnh nhân THCVC có sự giảm biểu hiện (bất hoạt) của các gen DUB (A20, CYLD, Cezanne) và gen kiểm soát miễn dịch Klotho; nồng độ các cytokine IL-6 và TNF-α trong máu tuần hoàn tăng cao; số lượng tế bào T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg) tăng lên đáng kể so với người khỏe mạnh.
3. Làm sáng tỏ chức năng sinh học của gen A20 trên tế bào PBMC: Chứng minh gen A20 có vai trò ức chế sự hoạt hóa của tế bào T, tế bào B và tủy bào (thể hiện qua các dấu ấn CD11b+CD40+, CD3+CD25+ và CD19+CD25+), ức chế sự giải phóng TNF-α, IL-1β, ức chế sự di chuyển của tế bào PBMC và tham gia điều hòa quá trình apoptosis.
4. Làm sáng tỏ chức năng sinh học của gen Otubain-1 trên tế bào PBMC: Chứng minh gen Otubain-1 có vai trò ức chế sự hoạt hóa của tế bào diệt tự nhiên NK (thể hiện qua dấu ấn CD56+CD44+) và kìm hãm mức độ biểu hiện của các gen tín hiệu nội bào SHP-1 và STAT-6.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Cần tiếp tục tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử điều hòa của các gen DUB, đặc biệt là vai trò cấu trúc - chức năng của SNP mới p.W736G trên gen CYLD đối với hoạt động của hệ thống miễn dịch trên bệnh nhân THCVC.
• Nghiên cứu định hướng ứng dụng các chỉ thị phân tử DUB và đột biến gen CYLD trong việc phối hợp chẩn đoán phân tử, tiên lượng và phát triển các liệu pháp điều trị nhắm trúng đích kết hợp cho bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn và các bệnh lý tăng sinh tủy ác tính khác.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Dữ liệu nghiên cứu được thực hiện trên cỡ mẫu xác định gồm 77 bệnh nhân THCVC và 55 người khỏe mạnh; chưa mở rộng đánh giá trên các nhóm bệnh tăng sinh tủy ác tính không có nhiễm sắc thể Philadelphia khác (như tăng tiểu cầu tiền phát ET hay xơ tủy nguyên phát PM) để đối chứng chéo.
• Các thử nghiệm chức năng về vai trò của gen A20 và Otubain-1 được tiến hành bằng mô hình can thiệp siRNA in vitro trên tế bào PBMC phân lập từ người khỏe mạnh, chưa thực hiện trực tiếp trên các tế bào gốc tạo máu CD34+ phân lập từ tủy xương của bệnh nhân THCVC.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu cơ chế chi tiết ở cấp độ protein đối với biến thể p.W736G trên gen CYLD để đánh giá sự thay đổi hoạt tính enzyme cắt chuỗi polyubiquitin liên kết K63.
• Mở rộng phân tích các con đường tín hiệu xuôi dòng khi bất hoạt đồng thời nhiều gen DUB trên mô hình động vật hoặc nuôi cấy tế bào gốc tủy xương.
• Đánh giá tiềm năng kết hợp giữa các chất ức chế kinase (như ức chế JAK2) với các phân tử điều hòa enzyme deubiquitinase trong điều trị thử nghiệm tiền lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn trong các lĩnh vực:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học và Miễn dịch học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về hệ thống enzyme deubiquitinase (A20, Otubain-1, CYLD, Cezanne), cơ chế ubiquitin hóa/khử ubiquitin và các kỹ thuật can thiệp gen bằng siRNA trên tế bào miễn dịch nguyên phát.
• Bác sĩ huyết học, chuyên viên xét nghiệm và các nhà nghiên cứu y sinh: Cung cấp dữ liệu về tần số đột biến JAK2 V617F, các biến thể mới trên gen CYLD, đặc điểm biến đổi cytokine và kiểu hình các dưới nhóm lympho T (đặc biệt là tế bào T điều hòa Treg) phục vụ định hướng nghiên cứu chẩn đoán và tiên lượng bệnh tăng sinh tủy.
• Các nội dung có giá trị tham khảo kỹ thuật cao:
  • Quy trình phân lập, nuôi cấy và chuyển nạp siRNA vào tế bào PBMC người.
  • Hệ thống các cặp mồi Real-Time PCR và chu nhiệt chuẩn hóa để định lượng biểu hiện các gen DUB, các gen tín hiệu họ STAT và phosphatase SHP.
  • Phương pháp phân tích giải trình tự Sanger kết hợp phần mềm tin sinh học (SD-Score, MaxEntScan) để dự đoán tác động của các đột biến tại vị trí cắt nối (splice site).

Câu hỏi thường gặp

1. Đột biến mới nào trên gen CYLD được phát hiện ở bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn trong luận án?

Luận án đã xác định được 11 SNP trên gen CYLD ở bệnh nhân THCVC, trong đó phát hiện SNP mới p.W736G nằm trên exon 15 chưa từng được công bố trước đó. Ngoài ra, phân tích bằng hai phần mềm tin sinh học SD-Score và MaxEntScan đã dự đoán 2 biến thể tại vị trí cắt nối p.2483+6 T>G thuộc gen CYLD có khả năng cao liên quan đến cơ chế gây bệnh.

2. Sự biểu hiện của nhóm gen DUB và các cytokine ở bệnh nhân THCVC thay đổi như thế nào so với người khỏe mạnh?

Ở bệnh nhân THCVC, mức độ biểu hiện mRNA của các gen DUB gồm A20, CYLD và Cezanne cùng gen kiểm soát miễn dịch Klotho bị suy giảm (bất hoạt) rõ rệt. Đồng thời, phân tích huyết thanh bằng phương pháp ELISA ghi nhận nồng độ của các cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α tăng cao đáng kể so với nhóm chứng khỏe mạnh.

3. Tỷ lệ các phân nhóm tế bào miễn dịch trong máu tuần hoàn của bệnh nhân THCVC có đặc điểm gì?

Phân tích bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry) cho thấy bệnh nhân THCVC có sự gia tăng đáng kể về số lượng tế bào T hoạt hóa mang dấu ấn CD25+CD4+, tế bào Th1 và quần thể tế bào T điều hòa (Treg: CD4+CD25+Foxp3+) trong máu ngoại vi so với người khỏe mạnh.

4. Khi làm bất hoạt gen A20 bằng siRNA trên tế bào PBMC, những hiện tượng sinh học nào xảy ra?

Việc làm bất hoạt gen A20 bằng siRNA-A20 trên tế bào PBMC in vitro dẫn đến:

• Tăng tỷ lệ hoạt hóa của tế bào tủy (CD11b+CD40+), tế bào T (CD3+CD25+) và tế bào B (CD19+CD25+).
• Tăng giải phóng các cytokine tiền viêm TNF-α và IL-1β.
• Tăng khả năng di cư của tế bào PBMC.
• Tăng tỷ lệ tế bào đi vào chu trình chết apoptosis (thông qua tăng dương tính với Annexin V, Caspase-3 và PI).

5. Gen Otubain-1 thể hiện vai trò gì đối với tế bào diệt tự nhiên (NK) và các gen truyền tín hiệu nội bào?

Khi bất hoạt gen Otubain-1 bằng siRNA-Otubain-1 trên tế bào PBMC, hoạt độ của tế bào NK tăng lên (thông qua sự gia tăng tỷ lệ tế bào mang kiểu hình CD56+CD44+), đồng thời mức độ biểu hiện của hai gen truyền tín hiệu nội bào quan trọng là SHP-1 và STAT-6 tăng lên. Điều này chứng minh trong điều kiện sinh lý bình thường, Otubain-1 đóng vai trò ức chế hoạt hóa tế bào NK và kìm hãm biểu hiện của SHP-1 và STAT-6.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Thị Trang đã khảo sát toàn diện vai trò của nhóm gen mã hóa enzyme deubiquitinase (A20, CYLD, Cezanne, Otubain-1, Otubain-2) cùng các tín hiệu phân tử và kiểu hình miễn dịch trên 77 bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn và người khỏe mạnh. Nghiên cứu đã phát hiện biến thể di truyền mới p.W736G cùng các biến thể vị trí cắt nối trên gen CYLD, đồng thời chỉ ra tình trạng suy giảm biểu hiện của các gen DUB (A20, CYLD, Cezanne), sự tăng cao của các cytokine IL-6, TNF-α và sự gia tăng quần thể tế bào T điều hòa ở bệnh nhân. Thông qua các thực nghiệm can thiệp siRNA in vitro trên tế bào PBMC, luận án đã làm sáng tỏ cơ chế của gen A20 trong việc ức chế hoạt hóa tế bào T, B, tủy bào, giảm tiết cytokine viêm và bảo vệ tế bào khỏi apoptosis, cũng như vai trò của gen Otubain-1 trong việc kìm hãm hoạt hóa tế bào NK và các tín hiệu SHP-1, STAT-6.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về bệnh tăng hồng cầu vô căn 1.1 Khái quát bệnh tăng hồng cầu vô căn Bệnh tăng hồng cầu vô căn (Polycythaemia vera- PV) là bệnh ung thư máu thuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy ác tính (Myeloproliferative neoplasms- MPNs), đặc trưng bởi sự tăng sinh quá mức các tế bào dòng tủy trưởng thành và chưa trưởng thành. Sự tăng sinh quá mức các tế bào dòng tủy dẫn tới sự tăng sinh vượt mức của các tế bào máu bao gồm: hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) bệnh tăng sinh tủy được phân làm 6 loại bệnh bao gồm: bệnh đa hồng cầu hay còn gọi là bệnh THCVC, tăng tiểu cầu tiền phát (essential thrombocythaemia- ET) và xơ tủy nguyên phát (primary myelofibrosis- PM) được phân loại cùng với bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (chronic myelogenous leukaemia- CML), bạch cầu mạn dòng bạch cầu trung tính và bạch cầu mạn dòng bạch cầu ái toan (chronic neutrophilic leukaemia- CNL) [1]. Tăng sinh tủy là nhóm bệnh phát triển chậm trong đó mỗi loại bệnh trong nhóm đều ảnh hưởng tới nhiều loại tế bào máu khác nhau.

Ba trong số các bệnh tăng sinh tủy bao gồm THCVC, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ tủy nguyên phát có đặc điểm chung là không chứa nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph) là nhiễm sắc thể số 22 có chứa tổ hợp gen BCR-ABL1 [2]. Tế bào ác tính trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn (https://www.net/rumanahameed1/polycythemia-vera-rumana) Bệnh THCVC là bệnh phổ biến nhất trong nhóm bệnh tăng sinh tủy với đặc điểm là sự tăng lên bất thường của số lượng tế bào hồng cầu (Hình 1. Đây là bệnh phát sinh trong quá trình rối loạn hình thành tế bào gốc tạo máu, tuy nhiên ban đầu 6 bệnh có thể có những biểu hiện như tăng hồng cầu, tăng bạch cầu và tăng tiểu cầu hay sự kết hợp của các triệu chứng trên với lách to hay xơ tủy nguyên phát [3]. Tại Hoa Kỳ, báo cáo dịch tễ năm 2014 cho thấy có 148.000 người đang mắc bệnh THCVC với tỷ lệ rơi vào khoảng 2,5-10 người/ 100.

Bệnh THCVC là bệnh có tỷ lệ mắc và sống sót sau 5 năm phụ thuộc vào độ tuổi. Ở Châu Âu, số liệu thống kê từ những năm 1995 đến 2002 cho thấy, tỷ lệ sống sau 5 năm của THCVC là 84,8% (81,5–87,5%) và tỷ lệ sống sót tương đối giảm xuống còn 79,4% ở những người 70 tuổi [4]. Đến thời điểm hiện tại các nhà khoa học vẫn chưa có sự đồng thuận trong chẩn đoán và điều trị chứng bệnh THCVC [5, 6].2 Một số nghiên cứu về kiểu hình miễn dịch trên bệnh tăng hồng cầu vô căn Bệnh THCVC được đặc trưng bởi sự dư thừa hồng cầu và sự tham gia chủ yếu của dòng hồng cầu với sự tăng sinh ấy có thể thay đổi các dòng megakaryocytic hoặc bạch cầu hạt [7]. Năm 2015, nghiên cứu trên 20 bệnh nhân dương tính với JAK2V617F trong đó 14 bệnh nhân mắc bệnh THCVC và 6 bệnh nhân mắc bệch tăng tiểu cầu tiền phát (ET) đã chỉ ra rằng, interferon-α thay đổi rõ rệt số lượng tế bào T điều hòa (CD4+ CD25+ Foxp3+), tế bào NK và tế bào DC [8].

Nghiên cứu khác chỉ ra rằng tỷ lệ tế bào NK tăng lên ở bệnh nhân THCVC so với nhóm khỏe mạnh, mặc dù khả năng gây độc tế bào của tế bào NK ở bệnh nhân THCVC so với người khỏe mạnh là tương tự nhau [9]. Bệnh nhân THCVC có số lượng tăng các tế bào T CD8+ nhớ cùng với sự biểu hiện của phân tử MHC-1 trên bề mặt tế bào giảm đi, chính vì thế khả năng tiêu diệt tế bào ung thư bị giảm đi đáng kể [10]. Đột biến JAK2V617F được phát hiện trong tất cả các tế bào dòng tủy và một số ít tế bào dòng lympho. Điều này đã đặt ra câu hỏi cho các nghiên cứu trên bệnh THCVC rằng liệu đột biến này có tần suất xảy ra khác biệt trên tế bào dòng lympho và dòng tủy hay không? Nghiên cứu về sự hiện diện của đột biến JAK2V617F trong các tế bào máu ngoại vi từ bệnh THCVC đã phát hiện ra rằng đột biến JAK2V617F trong tế bào B và NK xảy ra ở một số ít bệnh nhân mắc bệnh THCVC.

Bên cạnh đó, đột biến JAK2V617F cũng được phát hiện trong tất cả các tế bào T có nguồn gốc từ tế bào CD34+ bệnh THCVC [11]. Ngoài ra, nghiên cứu 7 trên tế bào NK từ chuột đột biến JAK2V617F đã chỉ ra rằng, tế bào NK trên chuột đột biến có khả năng tăng sinh và hoạt hóa thấp hơn so với tế bào NK kiểu dại. Ngoài ra, tế bào NK từ chuột đột biến JAK2V617F thiếu khả năng điều hòa miễn dịch, do đó hoạt động của hệ miễn dịch trong những con chuột này không bình thường [13]. Tiếp đó, sự thay đổi biểu hiện một số gen như gen CASP2, CASP3, DAPK1, ALG2 của tế bào CD34+ từ tủy xương của bệnh nhân THCVC đã được chỉ ra liên quan đến sự phát triển ác tính của tế bào gốc tạo máu trong bệnh THCVC.

Trong số các gen thay đổi biểu hiện, gen quy định các yếu tố tăng trưởng kích thích xơ hóa (TGF-β1, TGF-β2, BMP-2 và VEGF) được biểu hiện ở mức cao hơn đáng kể trong các tế bào CD34+ trong bệnh THCVC [12].3 Một số nghiên cứu về đột biến gen trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn Nhiều nghiên cứu ở cấp độ phân tử trên những bệnh nhân THCVC để có thể hiểu thêm về cơ chế bệnh sinh, từ đó tìm ra được phương pháp trị liệu phù hợp. Nghiên cứu ở cấp độ phân tử đã cho thấy một số kết quả về các đột biến gen xuất hiện trong bệnh THCVC. Hầu hết các bệnh nhân THCVC đều cho thấy sự xuất hiện của đột biến trên gen JAK2 và đó chính là đột biến JAK2 V617F [14]. Đột biến JAK2 V617F được coi là một marker cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh THCVC.

Kiểm tra đột biến JAK2 V617F được cho là cần thiết cho việc xác định và chẩn đoán sớm từ giai đoạn 1 của bệnh THCVC. Năm 2003 Bench và cộng sự đã đưa ra hướng dẫn riêng cho việc chẩn đoán chứng THCVC bằng việc xét nghiệm đột biến JAK2 V617F [15]. Ngoài đột biến JAK2 V617F, ở những bệnh nhân THCVC trên gen JAK2 cũng nhận thấy xuất hiện đột biến trên exon số 12. Không giống như đột JAK2 V617F xuất hiện ở hầu hết các bệnh nhân THCVC, đột biến trên exon số 12 của gen này chỉ nhận thấy ở 2% đến 3% các bệnh nhân THCVC.

Tuy nhiên so với đột biến JAK2 V617F, đột biến trên exon 12 của gen JAK2 có xu hướng trẻ hơn với nồng độ hemoglobin cao hơn, số lượng bạch cầu và tiểu cầu thấp hơn cùng với sự gia tăng hồng cầu mà không có bất thường về hình thái bạch cầu hạt [16]. 8 Bên cạnh đột biến trên gen JAK2, các đột biến trên gen Calretaculin (CALR) cũng được nghiên cứu và báo cáo ở trên những bệnh nhân THCVC. CALR nằm ở vị trí chromosome 19p13.2 và chứa 9 exon kéo dài 4,2 kb. Nghiên cứu trên đối tượng là chuột cho thấy, chuột bị loại bỏ CALR thường chết trước khi được sinh ra.

Chuột mất gen CALR sẽ bị suy tim hoặc tim chậm phát triển. Bên cạnh đó, nếu gen CALR biểu hiện quá mức cũng dẫn tới sự khiếm khuyết về tim sau khi sinh [17]. CALR có vai trò quan trọng và được cho là tham gia vào quá trình cân bằng Ca2+ nội môi, giúp phân giải các protein được sản xuất lỗi, bám dính tế bào, đáp ứng miễn dịch ung thư và thực bào. Bất thường của biểu hiện CALR đã được báo cáo trong các bệnh ung thư khác nhau [18].

Nghiên cứu của Misa Imai và cộng sự năm 2013 đã báo cáo đột biến CARL mới (mất và chèn ở exon 9) và JAK2 ở bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát. Trong tăng tiểu cầu nguyên phát, đột biến gen CALR có mức độ huyết sắc tố thấp hơn, số lượng bạch cầu thấp hơn, số lượng tiểu cầu cao hơn và khả năng sống sót tốt hơn so với đột biến trên gen JAK2 [19]. Cho đến nay, tất cả các đột biến CARL được tìm thấy trong tăng sinh tủy đều liên quan đến exon 9. Đột biến gen CALR hiếm khi xuất hiện ở bệnh THCVC còn đột biến gen MPL thì gần như không có.

Kể từ khi được miêu tả vào năm 1892 đến nay, hơn 125 năm đã qua nhưng nguyên nhân về bệnh tăng hồng cầu vô căn vẫn chưa hoàn toàn được sáng tỏ [20]. Bệnh THCVC được cho rằng xuất hiện do sự rối loạn trong quá trình hình thành các tế bào máu. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra cơ chế hình thành bệnh THCVC. Kết quả của nhiều nghiên cứu đưa ra cho thấy đột biến của gen JAK là một trong những nguyên nhân dẫn tới THCVC.

Đột biến gen JAK2-V617F gây tăng khả năng phosphoryl hóa của JAK2, dẫn tới tăng sinh quá mức của các tế bào dòng tủy [21]. Trên 90% người mắc bệnh đa hồng cầu nguyên phát đều có đột biến này. Nghiên cứu di truyền tế bào và đột biến gen JAK2 cho thấy các bất thường về di truyền tế bào trong THCVC không phải là biểu hiện đặc hiệu khi chưa tới 25% số bệnh nhân có bất thường về di truyền tế bào [21]. Sự bất thường trong kiểu nhân (karyotypic) thường gặp nhất ở những bệnh nhân mắc THCVC là mất đoạn 20q, trisomies 8 và 9, tuy nhiên tỷ lệ phát hiện gần như không đáng kể khi đánh giá bằng kỹ thuật sử dụng lai huỳnh quang tại chỗ (FISH- Fluorescence in situ hybridization).

Tương tự, các nghiên cứu dựa trên kỹ thuật FISH 9 trong các tế bào tủy xương từ những bệnh nhân THCVC, với karyotype bình thường không cho thấy sự mất đoạn liên quan đến vùng nhiễm sắc thể 20q11 khi quan sát dưới kính hiển vi [22]. Nhiễm sắc thể 9p24 chứa gen JAK2, gần đây đã được chứng minh là mang đột biến điểm V617F soma ở exon 14 xuất hiện trong phần lớn bệnh nhân mắc bệnh THCVC [23]. Quá trình truyền tín hiệu của protein JAK2 [24] JAK (Janus kinases) là một họ protein truyền tín hiệu nội bào bao gồm bốn thành viên: JAK1, JAK2, JAK3 và Tyk2. JAK được kích hoạt khi xảy ra sự gắn của phối tử với các thụ thể trung gian.

Thông qua quá trình gắn của phối tử và thụ thể này làm thay đổi cấu trúc không gian của thụ thể truyền tin, hai protein JAK tiếp tục được đưa đến gần nhau, cho phép phosphoryl hóa giữa hai protein JAK và hoạt hóa phân tử JAK. Các protein JAK được kích hoạt sau đó phosphoryl hóa các mục tiêu bổ sung, bao gồm cả các thụ thể và các protein STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) là protein hoạt hóa phiên mã (Hình 1.