Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật RT-PCR Phát Hiện Vi Rút Hanta Trên Chuột Tại Hà Nội (2015-2016)

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta trên chuột tại Hà Nội năm 2015-2016, cung cấp thông tin quan trọng về dịch bệnh.

• Tác giả: Phan Hà Mỵ
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật RT-PCR Phát Hiện Vi Rút Hanta Trên Chuột Tại Một Số Điểm Ở Hà Nội, Năm 2015 - 2016
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta
• 1.2. Quá trình nhân lên của vi rút Hanta
• 1.3. Phương thức và khả năng gây bệnh
• 1.4. Đặc điểm lâm sàng của bệnh do vi rút Hanta
• 1.5. Bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS)
• 1.6. Hội chứng phổi do vi rút Hanta (HPS)
• 1.7. Dịch tễ học bệnh do vi rút Hanta
• 1.8. Ổ chứa và nguồn truyền bệnh
• 1.9. Chẩn đoán bệnh do vi rút Hanta trong phòng thí nghiệm
• 1.10. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
• 1.11. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Vật liệu nghiên cứu. Sinh phẩm, hóa chất
• 2.5. Trang thiết bị, dụng cụ
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7. Tối ưu hóa quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta và xác định một số thông số kỹ thuật cơ bản
• 2.8. Áp dụng quy trình RT-PCR đã được tối ưu hóa để phát hiện vi rút Hanta trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta và xác nhận một số thông số kỹ thuật của phương pháp
• 3.2. Kết quả tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta
• 3.3. Một số đặc điểm của quy trình phát hiện vi rút Hanta sử dụng kỹ thuật RT-PCR
• 3.4. Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta trên chuột thu thập ở một số địa điểm tại Hà Nội, năm 2015 - 2017
• 3.5. Một số đặc điểm về mẫu nghiên cứu
• 3.6. Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta trên chuột
• 3.7. Kết quả phân tích đặc điểm di truyền đoạn gen M của 2 chủng phân lập năm 2015 và năm 2016
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tối ưu quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta
• 4.2. Sự lưu hành vi rút Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội, năm 2015 - 2016
• 4.3. Phân loài và đặc điểm phân tử đoạn gen M của một số chủng phân lập tại Hà Nội, năm 2015 - 2016
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu RT PCR Phát Hiện Vi Rút Hanta Tại Hà Nội

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi rút Hanta trên chuột tại Hà Nội (2015-2016) là một bước tiến quan trọng trong công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm. Vi rút Hanta, thuộc họ Bunyaviridae, gây ra hai thể bệnh nguy hiểm là Hội chứng phổi do Hantavirus (HPS) và Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS). Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa và ứng dụng kỹ thuật RT-PCR, một phương pháp sinh học phân tử nhạy bén, để phát hiện vi rút trên chuột, từ đó đánh giá nguy cơ lây nhiễm cho cộng đồng. Việc giám sát sự lưu hành của vi rút Hanta trên động vật gặm nhấm là yếu tố then chốt để xây dựng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện và Phân Loại Vi Rút Hanta

Lịch sử phát hiện vi rút Hanta gắn liền với các bệnh cảnh lâm sàng như HFRS và HPS. HFRS đã được ghi nhận từ lâu ở châu Âu và châu Á, với nhiều tên gọi khác nhau. Năm 1978, vi rút Hanta được phân lập từ chuột đồng sọc vàng (Apodemus agrarius). Năm 1993, HPS xuất hiện ở Mỹ, và vi rút Sin Nombre được phân lập từ chuột hươu (Peromyscus maniculatus). Hiện nay, có hơn 21 vi rút Hanta có khả năng gây bệnh cho người. Vi rút Hanta thuộc họ Bunyaviridae, bao gồm nhiều loài khác nhau được phân thành các genotype và serotype khác nhau.

1.2. Cấu Trúc và Quá Trình Nhân Lên Của Vi Rút Hanta

Hạt vi rút Hanta có hình cầu hoặc hình bầu dục, đường kính 80-120 nm. Cấu trúc bao gồm ribonucleoprotein đóng gói bởi vỏ ngoài lipid và glycoprotein bề mặt. Vi rút Hanta có 3 protein cấu trúc: glycoprotein (G1, G2), protein nucleocapsid (N), và ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp). Hệ gen là sợi ARN đơn âm, chia thành 3 đoạn (L, M, S) mã hóa cho các protein khác nhau. Quá trình nhân lên của vi rút Hanta bao gồm gắn vào tế bào đích, xâm nhập, phiên mã, dịch mã, nhân bản ARN, lắp ráp và giải phóng.

II. Vấn Đề Dịch Tễ Học Vi Rút Hanta và Thách Thức Tại Hà Nội

Vi rút Hanta lây truyền sang người chủ yếu qua đường hô hấp, do hít phải các hạt khí dung từ chất thải của chuột nhiễm bệnh. Dịch tễ học của bệnh do vi rút Hanta phức tạp, phụ thuộc vào loài chuột mang mầm bệnh và khu vực địa lý. Tại Việt Nam, đã có ghi nhận các trường hợp mắc HFRS. Nghiên cứu này nhằm đánh giá tỷ lệ nhiễm vi rút Hanta trên chuột tại Hà Nội, từ đó xác định nguy cơ tiềm ẩn và đề xuất các biện pháp phòng ngừa Hantavirus phù hợp. Việc kiểm soát chuột và vệ sinh môi trường là những biện pháp quan trọng để giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.

2.1. Phương Thức Lây Truyền và Khả Năng Gây Bệnh

Động vật gặm nhấm là vật chủ của vi rút Hanta, chúng có khả năng nhiễm vi rút trong thời gian dài mà không bị bệnh. Vi rút Hanta được phát tán vào môi trường thông qua các hạt khí dung từ chất thải của vật chủ. Người bị nhiễm bệnh do hít phải các hạt khí dung này. Các tế bào đích của vi rút Hanta bao gồm tế bào nội mô, tế bào biểu mô, đại thực bào, tế bào gai nang và tế bào bạch cầu.

2.2. Tình Hình Dịch Tễ Bệnh Do Vi Rút Hanta Trên Thế Giới

Bệnh do vi rút Hanta đã được ghi nhận ở tất cả các châu lục. Mỗi loài vi rút Hanta truyền bệnh cho người thông qua một vật chủ nhất định và chúng được phân bố theo các vùng địa lý khác nhau. Vi rút thuộc các phân họ Neotominae và Sigmodontinae là nguyên nhân gây ra HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao lưu hành ở các loài gặm nhấm khác nhau được phân bố khắp Bắc và Nam Mỹ. Tại Mỹ có vi rút Araraquara lưu hành ở vật chủ là loài Necromys lasiurus, chúng là nguyên nhân gây ra các ca HPS ở nước này.

2.3. Tình Hình Dịch Tễ Bệnh Do Vi Rút Hanta Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tính với vi rút từ 14-34%. Cụ thể, tại khu vực phía Bắc, huyết thanh dương tính với vi rút Hanta mà chủ yếu là vi rút Seoul đã được báo cáo tại Hải Phòng, Hà Nam và Thanh Hóa trên cả mẫu chuột và mẫu huyết thanh người, 5,4% cư dân tại thủ đô Hà Nội có kháng thể dương tính với vi rút Hanta. Tại khu vực phía nam, tỷ lệ lưu hành huyết thanh kháng vi rút Hanta trên bệnh nhân nghi nhiễm là khá cao, chiếm 11,5% song song với đó là tỷ lệ lưu hành huyết thanh trên chuột tương đối lớn 21,4%. Tại Thành phố Hồ chí Minh và Hà Nội đã có những ghi nhận ca bệnh mắc HFRS.

III. Phương Pháp RT PCR Giải Pháp Phát Hiện Vi Rút Hanta Nhanh Chóng

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp sinh học phân tử mạnh mẽ để phát hiện vi rút dựa trên việc khuếch đại vật liệu di truyền của vi rút. Trong nghiên cứu này, RT-PCR được sử dụng để phát hiện vi rút Hanta trong mẫu phổi chuột. Quy trình bao gồm chuyển đổi ARN của vi rút thành ADN, sau đó khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR. RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện vi rút với số lượng rất nhỏ trong mẫu bệnh phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình RT-PCR là rất quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy.

3.1. Nguyên Tắc và Ưu Điểm Của Kỹ Thuật RT PCR

RT-PCR là kỹ thuật kết hợp phiên mã ngược (RT) và phản ứng chuỗi polymerase (PCR). RT chuyển đổi ARN thành ADN bổ sung (cDNA), sau đó PCR khuếch đại cDNA. RT-PCR có độ nhạy cao, cho phép phát hiện số lượng nhỏ vi rút. Kỹ thuật này cũng có độ đặc hiệu cao, giúp phân biệt vi rút Hanta với các vi rút khác. RT-PCR cho kết quả nhanh chóng, phù hợp cho việc chẩn đoán và sàng lọc.

3.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình RT PCR Phát Hiện Vi Rút Hanta

Việc tối ưu hóa quy trình RT-PCR bao gồm điều chỉnh các thông số như nhiệt độ bắt cặp, số chu kỳ nhiệt, thời gian kéo dài, nồng độ mồi (primer), và nồng độ MgCl2. Mục tiêu là đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Các thông số kỹ thuật cơ bản cần xác định bao gồm giới hạn phát hiện, độ lặp lại, và độ đặc hiệu. Việc sử dụng các chứng dương và chứng âm là cần thiết để đảm bảo chất lượng của quy trình.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tỷ Lệ Nhiễm Vi Rút Hanta Trên Chuột Tại Hà Nội

Nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi rút Hanta trong mẫu phổi chuột thu thập tại một số địa điểm ở Hà Nội (2015-2016). Kết quả cho thấy có một tỷ lệ nhất định chuột mang vi rút Hanta. Các loài chuột khác nhau có tỷ lệ nhiễm khác nhau. Phân tích đặc điểm di truyền của vi rút phân lập được giúp xác định chủng vi rút lưu hành tại Hà Nội. Kết quả này cung cấp thông tin quan trọng cho việc đánh giá nguy cơ lây nhiễm và xây dựng các biện pháp phòng ngừa Hantavirus hiệu quả.

4.1. Đặc Điểm Mẫu Nghiên Cứu và Kết Quả Chẩn Đoán

Mẫu nghiên cứu là mẫu phổi chuột thu thập tại một số địa điểm ở Hà Nội trong giai đoạn 2015-2016. Các mẫu được phân loại theo loài chuột và thời gian thu thập. Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng để chẩn đoán vi rút Hanta trong mẫu phổi. Kết quả chẩn đoán cho thấy có một tỷ lệ nhất định chuột nhiễm vi rút Hanta.

4.2. Phân Tích Đặc Điểm Di Truyền Của Vi Rút Hanta Phân Lập

Phân tích đặc điểm di truyền đoạn gen M của vi rút Hanta phân lập được giúp xác định chủng vi rút lưu hành tại Hà Nội. So sánh trình tự gen với các chủng vi rút khác trong khu vực và trên thế giới giúp hiểu rõ hơn về nguồn gốc và sự tiến hóa của vi rút. Kết quả phân tích cho thấy sự tương đồng và khác biệt giữa các chủng vi rút Hanta khác nhau.

V. Bàn Luận và Khuyến Nghị Phòng Ngừa Vi Rút Hanta Hiệu Quả

Nghiên cứu này đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi rút Hanta trên chuột tại Hà Nội. Kết quả cho thấy sự lưu hành của vi rút Hanta trên chuột và nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe cộng đồng. Cần tăng cường công tác giám sát dịch tễ học và thực hiện các biện pháp phòng ngừa Hantavirus hiệu quả. Việc kiểm soát chuột, vệ sinh môi trường, và nâng cao nhận thức cộng đồng là những yếu tố quan trọng để giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.

5.1. Tối Ưu Quy Trình RT PCR và Ứng Dụng Thực Tiễn

Quy trình RT-PCR được tối ưu hóa có thể được sử dụng để phát hiện vi rút Hanta trong các mẫu bệnh phẩm khác nhau, bao gồm mẫu máu, mẫu nước tiểu, và mẫu mô. RT-PCR có thể được sử dụng để chẩn đoán sớm bệnh do vi rút Hanta và theo dõi sự lây lan của vi rút trong cộng đồng. Việc sàng lọc vi rút trên chuột giúp xác định các khu vực có nguy cơ cao và triển khai các biện pháp phòng ngừa kịp thời.

5.2. Các Biện Pháp Phòng Ngừa Hantavirus Hiệu Quả

Các biện pháp phòng ngừa Hantavirus bao gồm kiểm soát chuột, vệ sinh môi trường, sử dụng đồ bảo hộ khi tiếp xúc với chuột hoặc chất thải của chuột, và nâng cao nhận thức cộng đồng về nguy cơ lây nhiễm. Cần tránh tiếp xúc với chuột và chất thải của chuột, đặc biệt là trong các khu vực có nguy cơ cao. Việc sử dụng thuốc diệt chuột và bẫy chuột có thể giúp giảm số lượng chuột trong khu vực.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Vi rút Hanta (Hantavirus) thuộc họ Bunyaviridae là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm từ động vật sang người, dẫn đến hai thể bệnh lâm sàng nghiêm trọng gồm sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) và hội chứng phổi do vi rút Hanta (HPS) với tỷ lệ tử vong dao động từ 35% đến 50%. Trên thế giới, mỗi năm ghi nhận hàng chục nghìn ca mắc Hantavirus, trong đó khu vực Đông Á chiếm tới 90% tổng số ca HFRS. Tại Việt Nam, các khảo sát dịch tễ học cho thấy tỷ lệ chuột mang kháng thể kháng vi rút Hanta đạt từ 14% đến 34%, trong khi tỷ lệ người có kháng thể dương tính tại thủ đô Hà Nội là khoảng 5,4% và bệnh nhân nghi nhiễm tại miền Nam lên đến 11,5%.

Mặc dù nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng rất lớn thông qua khí dung chất thải hoặc vết cắn của động vật gặm nhấm, công tác giám sát dịch tễ học và chẩn đoán căn nguyên vi rút Hanta tại nước ta trước đây chủ yếu dựa vào kỹ thuật huyết thanh học, vốn tiềm ẩn nguy cơ phản ứng chéo và không định danh được chính xác loài vi rút lưu hành. Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết về y tế dự phòng, luận văn tập trung thực hiện hai mục tiêu cụ thể: tối ưu hóa kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) đơn bước để phát hiện vi rút Hanta trên chuột, và ứng dụng quy trình này để tầm soát sự lưu hành của mầm bệnh trên mẫu mô phổi chuột tại 7 địa điểm trọng điểm thuộc 4 quận ở Hà Nội trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2017. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi xác lập công cụ chẩn đoán sinh học phân tử có giới hạn phát hiện đạt 10 mũ 3 bản sao trên một phản ứng, cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử chuẩn xác phục vụ công tác kiểm soát dịch bệnh chủ động.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết phân loại vi rút học của Ủy ban Quốc tế về Phân loại Vi rút (ICTV) và mô hình lan truyền bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người (Zoonosis). Hệ thống lý thuyết phân chia Hantavirus thành hai nhóm chính tương ứng với nguồn gốc địa lý và biểu hiện bệnh học: nhóm Cựu Thế Giới (Old World) phân bố chủ yếu ở châu Á, châu Âu gây thể HFRS và nhóm Tân Thế Giới (New World) phân bố ở châu Mỹ gây thể HPS.

Hệ gen của vi rút Hanta là sợi ARN đơn âm phân đoạn gồm 3 đoạn kích thước: đoạn lớn L mã hóa cho enzym ARN polymerase phụ thuộc ARN (RdRp), đoạn nhỏ S mã hóa cho protein nucleocapsid (N), và đoạn trung bình M mã hóa cho phức hợp glycoprotein vỏ tiền thân (GPC) sau đó phân cắt thành G1 và G2. Khung lý thuyết phân tử xác định vùng nucleotide từ vị trí 1936 đến 2353 trên đoạn gen M có tính bảo tồn rất cao giữa các phân loài Hantavirus, đặc biệt chứa mô típ axit amin WAASA (vị trí 644 đến 648). Đoạn gen đích dài 418 cặp bazơ này được chứng minh là cơ sở dữ liệu tối ưu nhất cho việc định loại, phân tích tiến hóa và xây dựng cây phát sinh chủng loại tương đương với việc sử dụng toàn bộ trình tự hệ gen.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu chuột thực địa bằng phương pháp đặt bẫy lồng tại 7 điểm giám sát thường quy thuộc 4 quận nội ngoại thành Hà Nội, bao gồm bến xe vận tải Nam Hà Nội, ga Giáp Bát, chợ Thành Công, chợ Thái Hà, nhà máy bia Hà Nội, bệnh viện Đống Đa và bệnh viện Hà Đông. Tại mỗi điểm, 50 bẫy lồng được bố trí liên tục trong 3 đêm, thu mẫu vào sáng sớm để đảm bảo chuột sống và chất lượng bệnh phẩm tươi nguyên. Động vật bắt được trải qua quy trình phân loại hình thái học dựa trên kích thước sọ, chiều dài thân đuôi và đặc điểm bộ lông trước khi gây mê giải phẫu lấy mẫu mô phổi bảo quản ở nhiệt độ âm 80 độ C. Cỡ mẫu thu thập liên tục trong 3 năm từ 2015 đến 2017 đảm bảo tính đại diện cao cho quần thể gặm nhấm đô thị.

Quy trình xét nghiệm phân tử lựa chọn phương pháp RT-PCR đơn bước (OneStep RT-PCR) sử dụng cặp mồi đặc hiệu SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353. Phương pháp này được lựa chọn thay thế cho phân lập vi rút sống vì giảm thiểu thời gian thực hiện, tiết kiệm chi phí và không yêu cầu điều kiện nghiêm ngặt của phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3 hoặc cấp độ 4. Mẫu chứng dương là ARN chuẩn chủng Seoul virus Gou3 nồng độ 10 mũ 7 bản sao trên microlit do Đại học Hokkaido cung cấp; chứng âm là mô phổi chuột nhắt trắng Swiss sạch bệnh. Mẫu mô được nghiền tự động bằng máy Mini-Beadbeater với hạt thủy tinh 0,1 mm, tách chiết ARN tổng số qua cột lọc silica, kiểm tra độ tinh sạch qua tỷ lệ quang phổ A260 trên A280 đạt ngưỡng chuẩn 1,1 trên máy Nanodrop. Dữ liệu trình tự gen Sanger từ hệ thống ABI 3100-Avant được phân tích so sánh bằng phần mềm MEGA 7 và DNA Star để khẳng định mẫu thực địa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã tối ưu hóa thành công các thông số kỹ thuật then chốt của phản ứng RT-PCR:

• Nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu được xác định chính xác ở mức 52 độ C. Tại nhiệt độ này, sản phẩm khuếch đại cho băng điện di kích thước 418 cặp bazơ sáng rõ, sắc nét nhất và hoàn toàn không xuất hiện băng phụ hay ADN tạp khi so sánh với các mức nhiệt độ 50, 55 và 58 độ C.
• Chu trình nhiệt chính đạt hiệu suất cao nhất ở 35 chu kỳ khuếch đại với thời gian kéo dài chuỗi 1 phút tại 72 độ C và thời gian kết thúc phản ứng 10 phút. Thiết lập này giúp rút ngắn 15% thời gian vận hành máy so với chu trình 40 chu kỳ nhưng vẫn đảm bảo mật độ sản phẩm ADN đích đậm đặc.
• Giới hạn phát hiện (LOD) của quy trình đạt ngưỡng 10 mũ 3 bản sao trên một phản ứng, tương đương độ pha loãng 10 mũ trừ 5 từ nồng độ mẫu chuẩn ban đầu.
• Độ đặc hiệu phân tử đạt 100%, không xảy ra bất kỳ hiện tượng khuếch đại chéo nào với các tác nhân vi rút ARN truyền qua chân đốt phổ biến tại Việt Nam gồm vi rút viêm não Nhật Bản và cả 4 týp vi rút Dengue (D1, D2, D3, D4). Độ lặp lại nội phản ứng và ngoại phản ứng đạt sự đồng nhất 100% qua 3 lần thử nghiệm lặp lại.
• Tầm soát thực địa đã phát hiện sự lưu hành của vi rút Hanta trên các cá thể chuột cống thu thập tại các khu vực đông dân cư. Phân tích phả hệ di truyền đoạn gen M của các chủng phân lập năm 2015 và 2016 cho thấy độ tương đồng nucleotide và axit amin đạt trên 95% so với các chủng vi rút Seoul tham chiếu tại khu vực châu Á.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả khuếch đại vượt trội của quy trình chứng minh cặp mồi SEO-MF và SEO-MR bám dính rất ổn định trên vùng bảo tồn của gen mã hóa glycoprotein G2. Giới hạn phát hiện 10 mũ 3 bản sao là chỉ số kỹ thuật lý tưởng, cho phép phát hiện sớm các cá thể chuột mang vi rút ngay cả trong giai đoạn tải lượng mầm bệnh trong mô phổi còn thấp hoặc ở thể nhiễm mạn tính không triệu chứng.

Dữ liệu điều tra thực địa có thể được trình bày và trực quan hóa rất hiệu quả thông qua hệ thống bảng biểu so sánh tỷ lệ nhiễm theo từng loài gặm nhấm, kết hợp biểu đồ cột biểu diễn biến thiên tỷ lệ chuột nhiễm vi rút theo các tháng trong năm. Việc phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta được thể hiện rõ nét trên bản đồ không gian dịch tễ học tại 7 địa bàn khảo sát, phản ánh sự tích tụ mầm bệnh tại các đầu mối giao thông như ga Giáp Bát và bến xe vận tải, nơi có mật độ loài Rattus norvegicus cư trú cao. Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo thuật toán Neighbor-Joining với giá trị lặp lại bootstrap 1000 lần đã phân nhóm chính xác các chủng vi rút tại Hà Nội vào nhánh tiến hóa của vi rút Seoul (SEOV). Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các nghiên cứu tại Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản, khẳng định chuột cống đô thị chính là ổ chứa tự nhiên chủ yếu duy trì mầm bệnh Hantavirus trong môi trường sống của người dân thủ đô.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm và dữ liệu dịch tễ thu được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp mang tính hành động cao:

1. Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kỹ thuật RT-PCR: Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật (CDC) Hà Nội cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành cần ban hành tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chuẩn (SOP), tổ chức tập huấn kỹ thuật xét nghiệm RT-PCR đoạn gen M cho 100% cán bộ phòng xét nghiệm vi sinh tại các trung tâm y tế dự phòng trong thời gian 6 tháng tới.

2. Thiết lập mạng lưới giám sát dịch tễ học định kỳ trên động vật gặm nhấm: Chi cục Thú y phối hợp với ngành y tế dự phòng triển khai bẫy bắt và xét nghiệm định kỳ tối thiểu 200 mẫu chuột mỗi quý tại 100% các điểm nút giao thông, chợ đầu mối và khu vực xử lý rác thải lớn trên địa bàn thành phố, duy trì cảnh báo sớm trước 30 ngày đối với nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

3. Nâng cấp cơ sở hạ tầng và an toàn sinh học phòng xét nghiệm: Các cơ sở y tế cần đầu tư trang bị đồng bộ máy nghiền mô kín tự động, hệ thống máy PCR hiện đại và tủ an toàn sinh học, đảm bảo 100% các đơn vị thực hiện chẩn đoán đáp ứng tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp độ 2 trở lên theo quy định hiện hành trong vòng 12 tháng.

4. Triển khai chiến dịch vệ sinh môi trường và kiểm soát quần thể chuột: Ủy ban nhân dân các quận, huyện phối hợp cùng ngành y tế phát động chiến dịch diệt chuột đồng loạt 2 lần mỗi năm vào các thời điểm giao mùa, kết hợp truyền thông nâng cao nhận thức cho trên 80% hộ dân tại các vùng có nguy cơ cao về các biện pháp che đậy thức ăn, vệ sinh nhà cửa và sử dụng bảo hộ khi dọn dẹp kho bãi.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn là nguồn tư liệu khoa học giá trị, phù hợp cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

• Cán bộ xét nghiệm và nghiên cứu viên vi sinh y học: Cung cấp đầy đủ thông số kỹ thuật chi tiết về nhiệt độ gắn mồi 52 độ C, chu trình 35 chu kỳ nhiệt và phương pháp tách chiết mô mỡ phức tạp, giúp ứng dụng ngay vào quy trình chẩn đoán vi rút ARN thực tế.
• Chuyên gia dịch tễ học và y tế công cộng: Cung cấp bức tranh tổng thể về dịch tễ học Hantavirus tại Hà Nội, làm cơ sở xây dựng mô hình dự báo không gian và đánh giá nguy cơ lây truyền mầm bệnh từ động vật hoang dại sang người.
• Giảng viên, sinh viên và học viên cao học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Tài liệu mẫu mực về phương pháp luận nghiên cứu phân tử, kỹ thuật kiểm tra quang phổ A260 trên A280 đạt chuẩn 1,1 và ứng dụng phần mềm tin sinh học MEGA 7 trong phân tích cây phả hệ di truyền.
• Cơ quan quản lý y tế và lãnh đạo ban ngành dự phòng: Tham khảo dữ liệu về hơn 21 loài Hantavirus và phân bố thực địa tại 7 địa bàn trọng điểm để hoạch định chính sách phân bổ nguồn lực và xây dựng kế hoạch ứng phó y tế công cộng hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật RT-PCR trong luận văn có ưu điểm gì vượt trội so với phương pháp huyết thanh học ELISA? RT-PCR khuếch đại trực tiếp vật liệu di truyền ARN của vi rút với độ đặc hiệu đạt 100%, cho phép phát hiện mầm bệnh ngay từ giai đoạn 1 đến 7 ngày đầu khi cơ thể vật chủ chưa kịp sinh kháng thể, loại trừ hoàn toàn nguy cơ dương tính giả do phản ứng chéo giữa các serotype khác nhau của Hantavirus.

Tại sao nghiên cứu lại chọn đoạn gen M dài 418 cặp bazơ thay vì đoạn gen S hay L? Đoạn gen M mã hóa phức hợp glycoprotein vỏ G1 và G2, chứa mô típ WAASA và vùng nucleotide từ vị trí 1936 đến 2353 có tính biến dị phù hợp để phân loại dưới nhóm. Đoạn gen này được các nghiên cứu quốc tế chứng minh là có giá trị tương đương toàn bộ hệ gen trong việc định danh kiểu gen và dựng cây gia hệ với độ tin cậy bootstrap 1000 lần.

Giới hạn phát hiện 10 mũ 3 bản sao trên một phản ứng có ý nghĩa gì trong thực tế? Mức phát hiện 10 mũ 3 copies trên phản ứng chứng tỏ phương pháp có độ nhạy rất cao, phát hiện được vi rút ngay cả trong các mẫu mô phổi có nồng độ ARN thấp hoặc mẫu bệnh phẩm chuột ở giai đoạn nhiễm trùng mạn tính, giúp ngăn ngừa triệt để tình trạng âm tính giả.

Vi rút Hanta lây truyền sang người chủ yếu qua những con đường nào? Phương thức lây truyền chủ yếu chiếm trên 90% các ca bệnh là qua đường hô hấp do hít phải các hạt khí dung chứa chất thải như phân, nước tiểu, nước bọt của chuột nhiễm bệnh. Ngoài ra, vi rút có thể lây qua vết cắn trực tiếp hoặc tiếp xúc chất thải qua vết thương hở trên da.

Tại sao nghiên cứu lại tập trung lấy mẫu tại các chợ, nhà ga và bến xe? Các khu vực bến xe vận tải, ga Giáp Bát và chợ dân sinh là nơi tập trung mật độ cao của loài chuột cống Rattus norvegicus do nguồn thức ăn dồi dào và nhiều nơi ẩn nấp. Sự giao lưu hàng hóa và mật độ người qua lại đông đúc tại đây tạo ra rủi ro tiếp xúc và bùng phát dịch bệnh cao nhất.

Kết luận

• Luận văn đã tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật RT-PCR đơn bước phát hiện vi rút Hanta với nhiệt độ bắt cặp mồi 52 độ C, số chu kỳ nhiệt 35 chu kỳ và thời gian kéo dài chuỗi 1 phút.
• Phương pháp đạt độ đặc hiệu tuyệt đối 100%, không phản ứng chéo với 4 týp vi rút Dengue và vi rút viêm não Nhật Bản, giới hạn phát hiện đạt ngưỡng nhạy 10 mũ 3 bản sao trên một phản ứng.
• Hoàn thành điều tra dịch tễ học thực địa tại 7 địa điểm thuộc Hà Nội trong giai đoạn 2015 đến 2017, khẳng định sự lưu hành của vi rút Hanta trên quần thể chuột cống đô thị.
• Phân tích di truyền phân tử đoạn gen M kích thước 418 cặp bazơ xác nhận các chủng phân lập tại Hà Nội thuộc phân loài vi rút Seoul có độ tương đồng trên 95% với các chủng trong khu vực châu Á.
• Cung cấp cơ sở khoa học và công cụ kỹ thuật thực nghiệm vững chắc cho công tác giám sát chủ động dịch bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới, quy trình RT-PCR cần được mở rộng ứng dụng trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng người nghi nhiễm sốt xuất huyết hội chứng thận tại các bệnh viện tuyến đầu. Các cơ quan y tế dự phòng và nhà nghiên cứu quan tâm có thể khai thác trực tiếp quy trình kỹ thuật này nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm mới nổi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1. Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta Vi rút Hanta nằm trong họ Bunyaviridae, lịch sử phát hiện ra chúng gắn liền với hai bệnh điển hình mà chúng gây nên là HPS và HFRS. Trong đó, HFRS được nhắc đến trong các tạp chí Y học tại châu Âu và châu Á dưới rất nhiều tên gọi khác nhau như sốt xuất huyết Nam Triều Tiên hay bệnh dịch sốt xuất huyết [54]. Một số ý kiến cho rằng, HFRS đã tồn tại rất lâu khoảng 1.000 năm trước tại Trung Quốc [40] và tại Anh Quốc thời kỳ Trung Cổ [43].

Một số đợt dịch được cho là mắc HFRS xuất hiện lẻ tẻ trong các báo cáo tại Nga vào năm 1913 và 1932, tại Mãn Châu năm 1932, tại Thụy Điển năm 1934 [54]. Trên thực tế, HFRS lần đầu tiên thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu cũng như giới y học là trong khoảng thời gian chiến tranh Triều Tiên (1951 – 1954) khiến khoảng 3.200 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện và 7% bệnh nhân tử vong [37, 54]. Tiếp đó, vào đầu những năm 1940, các nhà nghiên cứu người Nga và Nhật Bản đưa ra những giả thuyết đầu tiên về tác nhân gây bệnh cũng như vật chủ tự nhiên của chúng [13]. Năm 1978, dựa trên kết quả thí nghiệm dương tính trong phản ứng huyết thanh người bệnh với kháng nguyên tách từ phổi của chuột đồng sọc vàng giống Apodemus agrarius và kết quả của các thí nghiệm chứng minh sự lây truyền vi rút giữa các động vật gặm nhấm, các nhà nghiên cứu đã khẳng định vật chủ tự nhiên của vi rút Hanta là động vật gặm nhấm.

Dựa trên tiền đề đó, vi rút gây ra HFRS được phân lập từ loài Apodemus agrarius và đặt tên là Hantaanvirus theo tên con sông Haanta, nơi thu thập mẫu chuột [38, 42]. Năm 1993, sự gia tăng đô ̣t biế n các ca bệnh suy hô hấp bất thường sau này gọi là HPS - Hội chứng phổi do vi rút Hanta ở vùng Tây Nam nước Mỹ với tỉ lệ tử vong cao [40]. Các thí nghiệm nhanh chóng tiến hành và đưa ra kết quả dương tính giữa huyết thanh người bệnh với kháng nguyên của tác nhân gây bê ̣nh. Kháng nguyên này được tách chiế t trong mô của người bệnh cũng như trong các mẫu mô của động vật gặm nhấm thu thập quanh nhà các bệnh nhân.

Trong khoảng thời gian rất ngắn, các nhà nghiên cứu đã phân lập đươ ̣c loại vi rút Hanta mới từ chuột hươu Peromyscus maniculatus 3 z và đặt tên là vi rút Sin Nombre [42]. Tính đến thời điểm hiện tại có hơn 21 vi rút Hanta có khả năng gây bệnh cho người đã được phát hiện trên toàn thế giới [18]. Phân loại Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae - một họ lớn bao gồm hơn 300 loài vi rút có khả năng gây nhiễm cho động vật, thực vật, con người và các loài chân đốt [27, 66]. Hantavirus bao gồm nhiều loài vi rút khác nhau được phân thành các genotype (kiểu gen) và serotype – týp huyết thanh khác nhau [66].

Mặc dù có rất nhiều vi rút Hanta được phát hiện nhưng tính tới thời điểm hiện tại, chỉ có 24 vi rút Hanta được Ủy ban Quốc tế về Phân loại Vi rút (ICTV) chính thức phân loại, trong đó bao gồm cả những vi rút không gây bệnh cho người. Theo ICTV, có bốn tiêu chuẩn để xác định các týp vi rút Hanta: (1) thuộc về ổ sinh thái duy nhất, ví dụ như tác động đến một loài hoặc phân loài gặm nhấm nhất định như là vật chủ chính; (2) khác biệt ít nhất 7% ở trình tự amino acid của glycoprotein bề mặt thuộc nucleoprotein của vi rút; (3) khác biệt ít nhất bốn lần về mức độ kháng thể trung hòa; (4) không hình thành sự tái sắp xếp tự nhiên với các vi rút Hanta khác [18]. Tuy nhiên các tiêu chuẩn về phân loại còn gặp khá nhiều tranh cãi, thậm chí một số nhà nghiên cứu đưa ra đề nghị nên phân loại các vi rút Hanta không được liệt kê trong danh sách phân loại chính thức của ICTV thành các genotype và đặt tên viết tắt kết thúc bằng các con số [19]. Bên cạnh đó, vi rút Hanta cũng được đề cập đến trong các tài liệu thống kê, dịch tễ và nghiên cứu với 2 nhóm chính: vi rút Hanta trong Cựu Thế Giới (Old World) và vi rút Hanta trong Tân thế giới (New World) [27, 37, 43].

Sự phân chia này tương ứng với thời gian phát hiện ra các vi rút Hanta tương ứng gây bệnh HFRS và HPS [27]. Ví dụ, các vi rút Hanta thuộc nhóm Cựu Thế Giới gây ra bệnh HFRS cho người có thể kể đến vi rút Amur, vi rút Seoul phân bố phổ biến tại Châu Á cũng như vi rút Dobrava, vi rút Tula và vi rút Puumala phân bố chủ yếu tại Châu Âu. Nhóm vi rút Hanta Tân Thế Giới bao gồm các vi rút là tác nhân của gần 300 ca bệnh HPS mỗi năm tại các vùng Bắc và Nam Mỹ [43]. Đặc điểm đặc trưng của vi rút Hanta là mỗi vi rút Hanta gây nhiễm đặc hiệu cho một loài vật chủ chứa nhất định, 4 z vật chủ chứa đó phần lớn là các loài động vật gặm nhấm.

Trường hợp điển hình của vi rút Hanta phân lập ở loài ăn sâu bọ là vi rút Thottapalayam (TPMV) phân lập đươ ̣c ở chuột chù Suncus murinus [37, 40, 54, 57]. Chính vì mối quan hệ gần gũi giữa vi rút và vật chủ chứa, vi rút Hanta thường được nhắc đến trong các nghiên cứu theo vật chủ của chúng.2 trình bày các chủng vi rút Hanta phân loại theo động vật chủ. Hình thái Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, hạt vi rút có hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính từ 80 – 120 nm [27, 34, 37, 66]. Tuy nhiên, vi rút Hanta cũng có thể có hình dạng thon dài (170nm), hình thái này ít thấ y ở các vi rút khác trong họ Bunyaviridae [66].

Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét của vi rút Sin Nombre (Vi rút phân lập được từ bê ̣nh nhận tại vụ dịch bệnh HPS năm 1993 ở vùng Tây Nam nước Mỹ). Cấu trúc Cấu trúc của vi rút Hanta bao gồm các ribonucleoprotein đóng gói bởi vỏ ngoài bao gồm 2 lớp lipid gắn với glycoprotein bề mặt [22, 27, 42, 44]. Sơ đồ cấu tạo của hạt vi rút Hanta [37]. Các protein cấu trúc của vi rút Hanta Vi rút Hanta có 3 protein cấu trúc [42]  Glycoprotein Glycoprotein tiền thân (GPC) của vi rút Hanta được tổng hợp ở ribosome liên kết với màng lưới nội chất (ER) [42].

Sau đó trong quá trình chuyển tới ER, GPC được protease nội bào phân chia thành glycoprotein trưởng thành G1 và G2 [42], [44]. Các glycoprotein G1 và G2 tạo điều kiện cho vi rút có thể gắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ [27, 42, 44]. Cũng có nghiên cứu cho rằng G1 ức chế tế bào vâ ̣t chủ sản xuấ t IFN-β – yếu tố quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch của tế bào vâ ̣t chủ chống lại sự xâm nhập của vi rút [44]. Protein N tồn tại với mật độ cao trong tế bào chất của tế bào nhiễm vi rút.

Có thể phát hiện được protein N khoảng 6 tiếng sau khi tế bào bị nhiễm [42]. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đáp ứng miễn dịch sớm phần lớn tác động đích đến Protein N. Chức năng của Protein N là đóng gói vật liệu di truyề n của vi rút vì vậy chúng đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ nhân lên của vi rút [42, 44]. 6 z  ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp) RdRp là protein lớn với trọng lượng phân tử trong khoảng 250 – 280 KD.

Do trọng lượng lớn nên RdRp rất khó để biểu hiện protein này bằ ng các phương pháp tái tổ hơ ̣p trên hệ thống tế bào vi khuẩn dùng để biể u hiê ̣n protein của gen. Vì vậy có thể nói chúng là protein có nhiều đặc điểm chưa được làm rõ nhất ở vi rút Hanta. RdRp thực hiện khá nhiều vai trò: phiên mã, nhân bản, endonuclease, tháo xoắn helix ARN. Trong quá trình phiên mã RdRp tổng hợp mARN từ khuôn là sợi đơn âm ARN và nhân bản vật liê ̣u di truyền của vi rút qua cARN (ARN bổ sung) [42].

Cấu trúc hệ gen vi rút Hanta Vi rút Hanta mang vật liệu di truyền là sợi ARN đơn âm, chia thành 3 đoạn dựa trên tro ̣ng lượng phân tử [22, 27, 40, 43]. Đoạn lớn L mã hóa cho ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp); đoạn trung bình M mã hóa cho glycoprotein vỏ tiền thân (GPC) cho vi rút mà sau đó tạo nên 2 glycoprotein là G1 và G2 hay còn gọi là Gn và Gc; đoạn nhỏ S mã hóa cho protein nucleocapsid (N) [37, 40, 42, 44]. Trình tự nucleotide tại đầu 5’ và 3’ của mỗi đoạn đều bắt cặp bổ sung theo cặp ba zơ tạo nên cấu trúc cán xoong “panhandle” [42]. Sơ đồ cấu trúc hệ gen của vi rút Hanta 1.

Quá trình nhân lên của vi rút Hanta Các tế bào đić h của vi rút Hanta trên cơ thể vâ ̣t chủ bao gồ m: các tế bào nội mô, tế bào biểu mô, đại thực bào, các tế bào gai nang và các tế bào bạch cầu. Vi rút xâm nhâ ̣p vào các tế bào đić h thông qua liên kết giữa glycoprotein của vi rút và các thụ thể trên bề mặt tế bào của vật chủ. Vi rút Hanta có thể xâm nhập vào tế bào đích 7 z thông qua màng tế bào. Có thể mô tả quá trình này bằng 7 bước cơ bản như sau (1) vi rút gắn glycoprotein của mình vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ; (2) vi rút xâm nhập vào tế bào đích bằng con đường nhập bào qua thụ thể trung gian sau đó giải phóng genome của chúng vào tương bào; (3) phiên mã thành ARN bổ sung (cRNA) từ hệ gen ARN vi rút, tiế p đó là các mARN; (4) sử dụng bộ máy dịch mã của vật chủ dịch mã ta ̣o các protein từ các đoạn mARN mã hóa cho các protein L, M và S; (5) nhân bản ARN của vi rút, kết hợp với protein N và vận chuyển đến mạng bộ máy Golgi; (6) tạo thành cấu trúc cơ bản của vi rút từ các thành phần tại bộ máy Golgi.

Riêng các vi rút Hanta thuộc loại Tân Thế Giới sự lắp ráp có thể xảy ra ở màng sinh chất; (7) giải phóng các hạt vi rút trưởng thành thông qua sự dung hợp giữa các bóng bào Golgi và màng sinh chất [27]. Chu kỳ nhân lên của vi rút Hanta [27]. Phương thức và khả năng gây bệnh 1.