MỞ ĐẦU Hoseradish perosidase (HRP) là một loại enzyme chứa heme sử dụng hydrogen peroxide (H2O2) để oxi hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ [1]. Tuy nhiên, HRP bị mất hoạt tính khi H2O2 có nồng độ cao và có giá thành đắt, không tự tổng hợp được. Do đó, việc nghiên cứu tạo ra xúc tác nhằm thay thế HRP ngày càng được quan tâm. Hematin là một hợp chất hình thành từ heme có trong máu, có cấu trúc và khả năng xúc tác tương tự như enzyme HRP trong phản ứng tạo liên kết ngang hình thành hydrogel.
Tuy nhiên, hematin chỉ hòa tan trong dung dịch có pH cao, không hiệu quả trong điều kiện nước có pH từ thấp đến trung tính vì cấu trúc porphyrin trong hematin là một nhóm chức không tan trong nước. Để giải quyết vấn đề này, nhóm nghiên cứu của thầy Trần Ngọc Quyển đã tổng hợp thành công dẫn xuất Gelatin-Hematin nhằm thay thế enzyme HRP trong phản ứng tạo liên kết hydrogel. Nghiên cứu đã chứng minh được Ge-He là chất xúc tác giả sinh học mới thay thế enzyme HPR để điều chế hydrogel. Mặc dù, Ge-He đã thể hiện xuất sắc chức năng thay thế HRP nhưng vẫn chưa có báo cáo nói về việc thu hồi xúc tác, đặc biệt xúc tác có ứng dụng trong y sinh.
Nanozyme là các enzyme nhân tạo dựa trên các nano. Bằng cách mô phỏng hiệu quả các vị trí xúc tác của enzyme tự nhiên hoặc chứa các nguyên tố đa hóa trị cho các phản ứng, các nanozyme đã thành công vai trò là chất thay thế trực tiếp các enzyme tự nhiên để xúc tác. Peroxidase bao gồm một nhóm lớn các enzyme xúc tác cho quá trình oxy hóa cơ chất với sự có mặt của H2O2. Trong số đó, các hạt nano Fe3O4 từ tính (NP) với các chức năng giống như peroxidase được nghiên cứu vào năm 2007.
Người ta cũng phát hiện ra rằng khi các hạt nano sắt từ tiếp xúc với các tế bào sống, là chất mang thuốc hoặc chất tương phản thì sự hiện diện của H2O2 sẽ kích hoạt phản ứng xúc tác để tạo ra các gốc tự do và thậm chí các hạt nano từ tính có thể tiêu diệt 80% tế bào HeLa. Nghiên cứu cũng cho rằng khi các hạt nano từ tính được sử dụng trong cơ thể người thì thể hiện hết hoạt tính xúc tác và an toàn sinh học. n 2 Việc kết hợp giữa hệ xúc tác Gelatin –Hematin và Fe3O4 là ứng dụng tiềm năng nhằm thu hồi xúc tác để sản phẩm đạt được độ tinh khiết cao hơn nhờ việc không còn lẫn xúc tác sau phản ứng, giảm giá thành và tiết kiệm vật liệu. Từ những cơ sở khoa học trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tổng hợp nano sắt từ biến tính dẫn xuất hematin hòa tan và định hướng ứng dụng làm xúc tác giả sinh học’’ để thay thế vai trò xúc tác của enzyme HRP trong phân tích sinh hóa.
Hơn nữa, hệ nano sắt từ biến tính dẫn xuất hematin có thể thu hồi sau khi phản ứng để có thể ứng dụng trong các phản ứng như : tổng hợp polyaniline, polyrutin, polycatechin… Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Tổng hợp hạt nano từ Fe3O4 có kích thước nhỏ và ổn định từ. Tổng hợp hạt nano từ Fe3O4 bọc TSPED. Tổng hợp hạt nano từ được biến tính dẫn xuất gelatin-hematin hòa tan.
Đánh giá hiệu quả oxy hóa enzyme của xúc tác giả từ tính. Ứng dụng của xúc tác từ tính trong phản ứng trùng hợp catechin. Đánh giá quá trình trùng hợp catechin của xúc tác giả từ tính. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược Horseradish (Amoracia Rusticana) là loại thảo mộc lâu năm được trồng ở các vùng ôn đới trên thế giới chủ yếu do giá trị thực phẩm của rễ cây.
Đây cũng là một nguồn giàu peroxidase, một loại enzyme có chứa heme sử dụng hydrogen peroxide (H2O2) để oxi hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ [1]. Do bản chất oxy hóa của peroxidase, HRP được ứng dụng thực tế trong nhiều lĩnh vực: chất khử màu thuốc nhuộm, xử lý nước thải sinh học (loại bỏ chất gây ô nhiễm nhóm phenolic và amin), khử mùi hôi lợn, phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể (ELISA), xúc tác trong cảm biến sinh học và chẩn đoán, tổng hợp polymer và chất hữu cơ, ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý [2]. Các phản ứng tạo liên kết ngang nhờ enzyme cho thấy tính tương thích sinh học và hữu ích cho việc hình thành hydrogel in situ và in vitro. Trong đó, liên kết ngang được xúc tác bởi enzyme HRP có tốc độ tạo gel nhanh, dễ xử lý và do có sẵn lượng chất nền sinh học lớn nên nó trở thành phương pháp phù hợp cho các ứng dụng y sinh như: kỹ thuật mô, y học tái sinh, vận chuyển thuốc, chữa lành vết thương cùng nhiều ứng dụng in vivo và in vitro khác.
Ngoài ra, HRP còn xúc tác cho một loạt phản ứng với các chất nền và nhóm chức khác nhau [3]. Trong những năm gần đây, các phương pháp tạo liên kết ngang hình thành hydrogel xúc tác bởi enzyme trở nên phổ biến. Đặc biệt là enzyme HRP do khả năng tự điều chỉnh cao để thu được hydrogel với các đặc tính như mong muốn. Phản ứng tạo liên kết ngang xúc tác bởi HRP ngay lập tức xảy ra khi trộn các polymer giàu phenol với HRP và H2O2.
Dựa trên tính năng tạo gel độc đáo này, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các tính chất khác nhau của hydrogel như thời gian tạo gel, độ cứng, tốc độ phân hủy có thể dễ dàng thao tác bằng cách thay đổi nồng độ HRP và H2O2. Các ứng dụng dùng xúc tác HRP trong việc hình thành hydrogel in situ: Các hydrogel Dex-TA, HA-g-Dex-TA, Dex-TA/Hep-TA, Dex-TA/platelet lysate, GPT/PRP, HATyr được ứng dụng trong tái tạo sụn, các hydrogel CPT/rutin, Gtn-HPA, CPT, GH, GHT ứng dụng n 4 trong chữa lành vết thương, Gtn-HPA ứng dụng trong kỹ thuật mô não, GPT ứng dụng trong tái tạo cơ xương, CMC-Ph ứng dụng trong kỹ thuật mô mỡ, Tet-TA ứng dụng trong điều trị bệnh động mạch ngoại biên, HA-TA ứng dụng trong điều trị ung thư… [4]. Nhìn chung, phản ứng tạo liên kết ngang xúc tác bởi HRP là một phương pháp hữu ích để hình thành hydrogel. Tốc độ gel hóa có thể được điều chỉnh bằng nồng độ HRP để tạo thành hydrogel từ vài giây đến vài phút.
Gel hóa nhanh đảm bảo hình thành gel cục bộ, phù hợp cho việc vận chuyển thuốc và chất kết dính mô. Gel hóa chậm cho phép lấp đầy các vết thương có hình dạng bất thường bằng tiền chất gel, dẫn đến sự gắn kết giữa hydrogel và mô tự nhiên. Mật độ liên kết ngang có thể được điều chỉnh bằng nồng độ H2O2 để tạo thành hydrogel với tính chất cơ học tương đương với các mô tự nhiên. Thay đổi mật độ liên kết ngang cũng có thể thay đổi tốc độ giải phóng của các protein.
Điểm nhấn của phản ứng xúc tác bởi HRP là khả năng miễn dịch tiềm tàng của enzyme do nguồn gốc thực vật của nó. Tuy nhiên, sự an toàn của HRP cần được thiết lập trước khi phê duyệt lâm sàn các hệ hydrogel, và vẫn còn phải nghiên cứu xem liệu peroxidase của con người có thể xúc tác cho liên kết ngang của các liên hợp polymer-phenol hay không. Nếu enzyme không được giữ lại trong hydrogel thì không cần quan tâm đến sự an toàn của HRP. Để đạt được mục đích này, hydrogel không có enzyme được hình thành bằng cách trộn hỗn hợp polymer-phenol và H2O2 thông qua một ống tiêm có phủ hematin hoặc các hạt HRP.
Những phương pháp đầy hứa hẹn này mở đường cho các ứng dụng lâm sàn của hydrogel [5]. Cơ chế xúc tác của enzyme HRP với sự có mặt H2O2 [1,2,4,6,7]: Giai đoạn đầu là quá trình xúc tác có sự tương tác giữa Fe(III) của enzyme ở trạng thái nghỉ với H2O2. Trong phản ứng này, một phân tử nước được giải phóng với quá trình oxy hóa tâm sắt heme thành hợp chất A. Hợp chất A có trạng thái oxy hóa cao gồm một tâm Fe(IV) oxoferryl và một gốc cation porphyrin (Por.
Giai đoạn hai là bước chuyển 2 electron đơn để đưa hợp chất A về trạng thái nghỉ của enzyme. Việc khử electron đầu tiên của gốc cation porphyrin cần phải có chất nền khử (phenol hoặc dẫn xuất của n 5 anillin) để hình thành hợp chất B (Fe(IV)=O). Việc khử electron thứ hai đưa hợp chất B về trạng thái nghỉ của enzyme. Cơ chế xúc tác của enzyme HRP với sự có mặt H2O2 và cơ chất thơm (phenol) “Enzyme nhân tạo”, một thuật ngữ do Breslow đặt ra để gọi những hợp chất hóa học phỏng sinh học nhằm mục đích bắt chước các nguyên tắc chung và thiết yếu của các enzyme tự nhiên bằng cách sử dụng nhiều loại vật liệu thay thế bao gồm cả chất xúc tác không đồng nhất.
Enzyme peroxidase đại diện cho một họ lớn các chất oxy hóa thường xúc tác các phản ứng sinh học với ái lực cơ chất cao và tính đặc hiệu trong các điều kiện tương đối ôn hòa, do đó cung cấp một loạt các ứng dụng thực tế trong nhiều lĩnh vực khoa học [2]. Enzyme HRP là một metalloenzyme đóng vai trò xúc tác quan trọng trong thực tế, là một nguồn giàu peroxidase, một loại enzyme có chứa heme sử dụng hydrogen peroxide (H2O2) để oxy hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ.2 Nghiên cứu về HRP Năm 2007, Selene M. Souza và các cộng sự đã khảo sát về khả năng HRP trong việc khử màu thuốc nhuộm và loại bỏ độc tố từ nước thải. Trong đó, thuốc nhuộm là Remazol Turquoise Blue G 133%, Lanaset Blue 2R và nước thải từ dệt nhuộm được thu thập từ nhà xưởng ở Santa Catarina ở pH 4.
Từ đó, kết quả thu được cho thấy rằng HRP có thể khử màu rất nhanh chỉ sau 5 phút tiếp xúc với khả năng là 59% và có thể xử lý độc tố từ nước thải một n 6 cách dễ dàng với khả năng giảm 10% tử vong trước và sau khi sinh vật tiếp xúc với nước thải [8]. Sigg và các cộng sự đã sử dụng HRP làm xúc tác cho quá trình polymer hoá N – isopropyl – acrylamide và alkyl bromide trong điều kiện chất hoạt hoá được tái tạo bằng phản ứng trùng hợp gốc chuyển điện tử phóng xạ không có peroxide. Kết quả thu được rất khả quan khi tổng hợp thành công các polymer đã khử bromide ở chỉ số phân tử 1,44 và có trọng lượng trung bình từ 50. Tuy đây không phải là một kết quả cao nhưng đã mở ra một hướng mới trong việc sử dụng HRP vào polymer hoá [3].
Cơ chế giả định của phản ứng trùng hợp dùng xúc tác HRP [3].