Nghiên cứu tình trạng methyl hóa các chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam

Luận văn nghiên cứu tình trạng methyl hóa các chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng về chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Phi Cường
• Người hướng dẫn: Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tình trạng methyl hóa một số chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.1.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Ung thư đại trực tràng
• 2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng
• 2.1.2. Cơ chế gây ung thư
• 2.1.3. Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới
• 2.1.4. Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam
• 2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng
• 2.2.1. Methyl hóa DNA là gì
• 2.2.2. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng
• 2.2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite
• 2.2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K
• 2.2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế
• 2.2.5.1. Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN
• 2.2.5.2. Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1
• 2.2.5.3. Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Các hóa chất, sinh phẩm
• 3.2. Mẫu bệnh phẩm
• 3.3. Trang thiết bị
• 3.4. Phương pháp
• 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde
• 3.4.2. Đánh giá chất lượng DNA tách chiết
• 3.4.3. Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion
• 3.4.4. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả đo hàm lượng DNA
• 4.1.1. Phương pháp của campos và cộng sự
• 4.1.2. Sử dụng bộ KIT
• 4.1.3. Phương pháp NaOH 2N
• 4.1.4. Phương pháp Lysis buffer
• 4.2. Phân tích in silico và thiết kế mồi
• 4.2.1. Kết quả thiết kế mồi
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào tình trạng methyl hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, một vấn đề quan trọng trong y học phân tử. Methyl hóa DNA là cơ chế biểu sinh liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen, đóng vai trò then chốt trong sự phát triển và tiến triển của ung thư. Nghiên cứu này nhằm xác định các chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân Việt Nam, góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị ung thư hiệu quả hơn.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu là tìm ra các chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn và tần số xuất hiện cao trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam. Mục tiêu cụ thể bao gồm tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde, thiết kế các cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa, và phân tích cấu trúc gen liên quan.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát hiện sớm và theo dõi tình trạng sức khỏe của bệnh nhân ung thư. Methyl hóa DNA có thể trở thành một chỉ số quan trọng trong chẩn đoán và điều trị ung thư, đặc biệt là trong bối cảnh y học Việt Nam đang phát triển.

II. Tổng quan về ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, với tỷ lệ mắc và tử vong cao. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh này đang gia tăng do các yếu tố như lối sống, chế độ ăn uống và môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào cơ chế methyl hóa DNA trong sự phát triển của ung thư, đặc biệt là sự bất thường trong quá trình này.

2.1. Khái niệm và cơ chế gây bệnh

Ung thư đại trực tràng bắt đầu từ sự biến đổi của niêm mạc biểu mô, dẫn đến sự hình thành khối u. Các cơ chế chính bao gồm mất ổn định nhiễm sắc thể, mất ổn định kính hiển vi và kiểu hình methylator đảo CpG. Những cơ chế này ảnh hưởng đến các đường dẫn tín hiệu, dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát.

2.2. Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam

Theo thống kê, ung thư đại trực tràng là một trong năm loại ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam. Tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn so với các loại ung thư khác như gan và phổi, nhưng đang có xu hướng gia tăng do lối sống và chế độ ăn uống không lành mạnh.

III. Methyl hóa DNA và ung thư đại trực tràng

Methyl hóa DNA là cơ chế biểu sinh quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen. Trong ung thư đại trực tràng, sự bất thường trong quá trình methyl hóa có thể dẫn đến sự biến đổi tế bào ác tính. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định mức độ methyl hóa của các gen cụ thể trong quần thể bệnh nhân Việt Nam.

3.1. Cơ chế methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA xảy ra khi một nhóm methyl được thêm vào cytosine trong dinucleotide CpG. Quá trình này điều chỉnh biểu hiện gen bằng cách ức chế sự gắn kết của các yếu tố phiên mã. Trong tế bào ung thư, sự methyl hóa bất thường có thể dẫn đến sự biểu hiện gen không kiểm soát.

3.2. Kỹ thuật xác định methyl hóa DNA

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật biến đổi bisulfite để xác định mức độ methyl hóa DNA. Kỹ thuật này chuyển đổi cytosine thành uracil, cho phép phân tích chính xác các vị trí methyl hóa. Ngoài ra, kỹ thuật Illumina Infinium 450K được sử dụng để phân tích hiệu năng cao các vị trí CpG trong bộ gen.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã tách chiết thành công DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde và thiết kế được các cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể trong mức độ methyl hóa của các gen cụ thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam so với các quần thể khác.

4.1. Phân tích hàm lượng DNA

Các phương pháp tách chiết DNA như sử dụng bộ KIT, NaOH 2N và lysis buffer đều cho kết quả tốt, đảm bảo chất lượng DNA phục vụ cho các phân tích tiếp theo.

4.2. Thiết kế mồi PCR

Nghiên cứu đã thiết kế thành công các cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa cho các gen FLI1 và AGRN, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc xác định các chỉ thị phân tử liên quan đến ung thư đại trực tràng.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã cung cấp những hiểu biết sâu sắc về tình trạng methyl hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam. Các kết quả thu được có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. Nghiên cứu cũng đề xuất hướng mở rộng quy mô và áp dụng các kỹ thuật tiên tiến hơn trong tương lai.

5.1. Giá trị thực tiễn

Nghiên cứu này góp phần vào việc nâng cao hiểu biết về cơ chế methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng, đồng thời cung cấp các công cụ phân tích hiệu quả cho y học phân tử tại Việt Nam.

5.2. Hướng phát triển

Trong tương lai, nghiên cứu cần mở rộng quy mô mẫu và áp dụng các kỹ thuật tiên tiến như giải trình tự thế hệ mới để phân tích toàn diện hơn về methyl hóa DNA và các cơ chế biểu sinh khác trong ung thư đại trực tràng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng (Colorectal Cancer - CRC) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu thế giới. Theo số liệu của GLOBOCAN năm 2018, ung thư đại trực tràng đứng thứ tư về tỷ lệ tử vong với gần 900.000 ca mỗi năm và là dạng ung thư phổ biến thứ ba trên toàn cầu, chiếm khoảng 11% tổng số các ca chẩn đoán ung thư. Bệnh có tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi ở nam giới cao hơn nữ giới và chênh lệch từ 3 đến 4 lần tại các quốc gia phát triển có chỉ số phát triển con người (HDI) cao so với các quốc gia đang phát triển. Dự báo đến năm 2030, gánh nặng ung thư đại trực tràng toàn cầu sẽ tăng khoảng 60%, ghi nhận thêm hơn 2,2 triệu trường hợp mới và 1,1 triệu ca tử vong mỗi năm.

Tại Việt Nam, số liệu thống kê dịch tễ của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) công bố năm 2012 và GLOBOCAN 2018 cho thấy ung thư đại trực tràng nằm trong nhóm năm bệnh ung thư thường gặp nhất ở cả hai giới (chiếm khoảng 7% tổng số ca mắc ung thư mới), xếp sau ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư vú. Tỷ lệ mắc bệnh tại Việt Nam chịu tác động bởi lối sống, tình trạng hút thuốc lá, sử dụng rượu bia, bệnh béo phì, chế độ ăn uống nhiều thịt đỏ và sự già hóa dân số.

Khối u đại trực tràng khi mới hình thành có kích thước nhỏ, sau đó xâm lấn thành ruột. Tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân đạt 90% nếu phát hiện ở giai đoạn sớm khi khối u chưa đâm thủng thành ruột, giảm xuống 70% khi khối u xâm lấn qua thành ruột nhưng chưa di căn, và chỉ còn 12% khi tế bào ác tính đã di căn xa. Tuy nhiên, dấu hiệu lâm sàng giai đoạn đầu thường nghèo nàn dẫn đến tỷ lệ phát hiện sớm chỉ đạt khoảng 39%, trong khi tỷ lệ chẩn đoán muộn khi đã di căn chiếm tới 61%.

Trong các cơ chế phân tử của ung thư đại trực tràng, biến đổi biểu sinh (epigenetics) thông qua sự methyl hóa DNA giữ vai trò quan trọng bên cạnh các đột biến di truyền. Phần lớn các nghiên cứu về methyl hóa DNA từ trước đến nay chủ yếu tập trung trên quần thể người da trắng và người da đen tại Châu Âu và Châu Mỹ; dữ liệu nghiên cứu trên quần thể người da vàng nói chung và bệnh nhân Việt Nam nói riêng còn hạn chế. Do cơ chế biểu sinh chịu tác động mạnh mẽ từ các yếu tố môi trường sống, chủng tộc và chế độ dinh dưỡng, việc nghiên cứu các chỉ thị methyl hóa trên bệnh nhân Việt Nam mang tính cấp thiết khoa học và thực tiễn cao.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

1. Mục tiêu tổng quát: Tìm ra những chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với tần số xuất hiện cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Tách chiết được DNA đạt tiêu chuẩn từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng cố định formaldehyde nhằm phục vụ cho các nội dung thí nghiệm của đề tài.
   • Thiết kế được một số cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa cho các gen mục tiêu.

Nhiệm vụ nghiên cứu tương ứng gồm: tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng; phân tích đặc điểm, cấu trúc của gen trên máy tính (in silico); thiết kế các cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa (Methylation-Specific PCR - MSP).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu mô bệnh phẩm khối u và mô lành liền kề cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng; các chỉ thị phân tử gồm gen FLI1 (Friend leukemia virus integration 1) và gen AGRN (Agrin).
• Phạm vi không gian: Mẫu mô bệnh phẩm thu thập từ Bệnh viện K Trung ương; các thực nghiệm tách chiết, đo đạc quang phổ, điện di và phân tích tin sinh học được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên.
• Phạm vi thời gian: Mẫu bệnh phẩm thu thập trong năm 2019; khóa luận hoàn thành và bảo vệ vào tháng 06 năm 2020.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên các nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và biểu sinh học:

• Cơ chế biểu sinh và methyl hóa DNA: Methyl hóa DNA là quá trình chuyển nhóm methyl (-CH3) từ phân tử S-adenosylmethionine (SAM) vào vị trí carbon số 5 (C5) của gốc cytosine tạo thành 5-methylcytosine (5mC), chủ yếu xảy ra tại các dinucleotide CpG. Quá trình này được xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferase (Dnmt): Dnmt3a và Dnmt3b đảm nhiệm vai trò methyl hóa de novo (thiết lập mô hình methyl hóa mới), trong khi Dnmt1 duy trì mô hình methyl hóa qua các lần phân bào.
• Bất thường methyl hóa trong ung thư đại trực tràng: Trong bộ gen người có hơn 28 triệu vị trí CpG. Các đảo CpG (CpG islands) có độ dài khoảng 200 đến 2000 bp, hàm lượng GC > 50%, thường nằm ở vùng promoter của 40% đến 60% gen ức chế khối u và thường không bị methyl hóa ở tế bào bình thường. Trong tế bào ung thư đại trực tràng, xảy ra hiện tượng siêu methyl hóa (hypermethylation) các đảo CpG tại promoter gây bất hoạt các gen ức chế khối u, kết hợp với hiện tượng giảm methyl hóa toàn cục (hypomethylation), thúc đẩy chuỗi chuyển biến u tuyến - ung thư biểu mô (adenoma-carcinoma sequence) và kiểu hình methylator đảo CpG (CpG island methylator phenotype - CIMP).
• Nguyên lý chuyển đổi bisulfite (Bisulfite conversion): Sử dụng natri bisulfite để biến đổi các gốc cytosine không bị methyl hóa thành uracil thông qua phản ứng khử amin, trong khi các gốc 5-methylcytosine được bảo vệ và giữ nguyên dạng cytosine. Phân tử DNA sợi đôi sau xử lý chuyển thành sợi đơn phân mảnh, làm cơ sở cho kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa phân biệt alen bị methyl hóa và không bị methyl hóa.
• Hệ thống phân tích hiệu năng cao: Tham khảo nguyên lý chip vi mảng Illumina Infinium HumanMethylation450K xác định vị trí CpG theo quy chuẩn TOP/BOT.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và phân tích tin sinh học bao gồm:

• Tách chiết DNA từ mô cố định formaldehyde (FFPE): Tiến hành khảo sát và đánh giá so sánh bốn phương pháp:
  1. Phương pháp Campos và cộng sự: Quy trình chiết xuất phenol-chloroform kết hợp đệm kiềm alkali (0,1M NaOH, 1% SDS, pH=12) có nguồn gốc từ SM Hykin, cải tiến từ Campos & Gilbert (2012) và Kearney & Stuart (2004).
  2. Phương pháp sử dụng bộ kit thương mại: Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit (FavorPrep, Favorgen) sử dụng cột lọc silica (mini FATG), kết hợp dung dịch đệm FATG1, FATG2, Proteinase K và RNase A.
  3. Phương pháp kiềm hóa NaOH 2N: Tham khảo quy trình tách chiết DNA móng tay của Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trung hòa bằng HCl 12N về pH 6,8 và chiết phenol/chloroform.
  4. Phương pháp Lysis buffer: Tham khảo quy trình ly giải kiềm cải tiến trên mẫu thực vật Osmanthus của Lisa Alexander (Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ - USDA-ARS), sử dụng đệm Lysis buffer (Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M, SDS 10%), Proteinase K, RNase và dung dịch CIAA (chloroform : isoamyl alcohol tỷ lệ 24:1).
• Quy trình rửa mẫu mô trước tách chiết: Rửa 4 lần trong dung dịch đệm GTE (100mM glycine, 10mM Tris-HCl pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ, sau đó rửa phân cấp qua chuỗi cồn giảm dần (cồn 100% trong 1 phút; cồn 70%, 40%, 20% mỗi nấc 5 phút) và nước cất 10 phút để loại bỏ formalin tồn dư.
• Phương pháp đánh giá chất lượng DNA:
  • Điện di gel agarose 1% pha trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 100V, nhuộm huỳnh quang bằng ethidium bromide (30 µl/L), chụp và phân tích hình ảnh bằng hệ thống Gel Logic 1500 (Kodak).
  • Đo mật độ quang học bằng máy quang phổ kế NanoDrop One (Thermo Scientific) để xác định nồng độ DNA (ng/µl) và tỷ số độ tinh sạch A260/A280, A260/A230.
• Phương pháp biến đổi bisulfite: Tham chiếu quy trình kit EZ DNA Methylation - Gold Kit (Zymo Research) xử lý DNA với thuốc thử CT Conversion Reagent, gắn cột IC Zymo-Spin, giải sulfat bằng đệm M-Desulphonation Buffer và rửa giải bằng M-Elution Buffer.
• Phương pháp phân tích in silico và thiết kế mồi: Truy xuất trình tự nucleotide của gen FLI1 và AGRN từ cơ sở dữ liệu Ensembl Genome Browser; phân tích cấu trúc promoter và vị trí các đảo CpG; thiết kế các cặp mồi MSP chuyên biệt cho trạng thái methyl hóa (M) và không methyl hóa (U) bằng phần mềm Methyl Primer Express v1.0.

Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm phòng thí nghiệm trên mẫu bệnh phẩm mô khối u và mô lành lưu trữ năm 2019 từ Bệnh viện K Trung ương; dữ liệu trình tự gen hệ gen người trích xuất từ cơ sở dữ liệu Ensembl.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Chương này trình bày tính cấp thiết của việc tìm kiếm các chỉ thị sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng. Tác giả phân tích khoảng trống nghiên cứu khi các dữ liệu methyl hóa DNA chủ yếu được ghi nhận trên các quần thể người Châu Âu và Châu Mỹ, trong khi các nghiên cứu trên người Việt Nam còn rất hạn chế. Phần mở đầu xác lập mục tiêu tổng quát là tìm kiếm các chỉ thị phân tử có tần số methyl hóa cao đặc thù cho bệnh nhân Việt Nam, kèm hai mục tiêu cụ thể và ba nội dung nghiên cứu thực nghiệm: tối ưu hóa kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formaldehyde, phân tích cấu trúc gen FLI1 và AGRN trên máy tính, và thiết kế các cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương tổng quan được cấu trúc thành ba mảng kiến thức:

1. Dịch tễ và cơ chế bệnh sinh ung thư đại trực tràng: Trình bày khái niệm, triệu chứng lâm sàng, các yếu tố nguy cơ (chế độ dinh dưỡng, lối sống, viêm ruột mãn tính như bệnh Crohn, viêm loét đại tràng) và cơ chế hình thành khối u qua chuỗi biến đổi u tuyến - ung thư biểu mô (adenoma-carcinoma). Tác giả dẫn chứng dữ liệu dịch tễ toàn cầu từ GLOBOCAN 2018 (tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong, các quốc gia có tỷ lệ mắc cao như Hungary ở nam giới với 70,6/100.000 dân, Na Uy ở nữ giới với 29,3/100.000 dân) và thực trạng ung thư tại Việt Nam theo số liệu IARC.
2. Cơ chế methyl hóa DNA và bệnh ung thư: Phân tích bản chất hóa sinh của phản ứng chuyển vị nhóm methyl vào cytosine; cấu trúc các đảo CpG tại vùng promoter; chức năng của các enzyme Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b; nguyên lý kỹ thuật biến đổi bisulfite chuyển cytosine thành uracil và ứng dụng mảng vi dòng Illumina Infinium 450K trong định danh các điểm CpG theo hệ quy chiếu TOP/BOT.
3. Tổng quan nghiên cứu về hai gen chỉ thị: Khảo sát các công trình trong nước về methyl hóa các gen BRCA1, RASSF1A, GSTP1 trên ung thư vú, DcR1 trên ung thư cổ tử cung, GSTP1 và RASSF1A trên ung thư tuyến tiền liệt; tổng hợp các nghiên cứu quốc tế chứng minh gen FLI1 liên quan đến sarcoma Ewing, khối u mô mềm và điều hòa phiên mã chemokine MCP-1; khảo sát vai trò của gen AGRN trong ung thư vú di căn, ung thư tuyến tiền liệt (qua trục điều hòa NEAT1/CDC5L-AGRN) và ung thư biểu mô tuyến ở phổi.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp

Chương này lập bảng chi tiết danh mục hóa chất (hãng sản xuất Merck, Thermo Scientific, Favorgen, Zymo Research) và các trang thiết bị phân tích (máy quang phổ NanoDrop One, máy PCR Applied Biosystems, hệ thống chụp gel Gel Logic 1500 Kodak, máy ly tâm Eppendorf).

Tác giả phân tích tác động tiêu cực của formaldehyde: chất cố định này tạo liên kết cộng hóa trị chéo giữa DNA và protein, gây khử amin, oxy hóa và biến tính đứt gãy DNA, làm giảm hiệu suất tách chiết và ức chế phản ứng enzyme tiếp theo. Từ đó, chương mô tả chi tiết quy trình thao tác bốn phương pháp tách chiết thử nghiệm:

• Quy trình Campos và cộng sự (xử lý mô 30–40 mg bằng đệm kiềm alkali đun 100°C trong 40 phút, chiết phenol:chloroform 25:24:1 và 24:1, tủa cồn tuyệt đối ở -20°C).
• Quy trình bộ kit FavorPrep (nghiền 25 mg mô, xử lý ly giải bằng đệm FATG1, ủ Proteinase K ở 60°C từ 1–3 giờ, bổ sung RNase A, đệm FATG2 ủ 70°C, gắn cột mini FATG, rửa cột bằng W1 Buffer và Wash Buffer, rửa giải bằng Elution Buffer).
• Quy trình NaOH 2N (xử lý 125 mg mô trong NaOH 2N qua đêm, chỉnh pH về 6,8 bằng HCl 12N, chiết phenol:chloroform và tủa bằng ethanol 95%).
• Quy trình Lysis buffer (xử lý mô trong đệm Lysis buffer, ủ Proteinase K qua đêm ở 56°C, bổ sung RNase ủ 37°C, chiết bằng dung dịch CIAA, tủa bằng isopropanol hoặc ethanol 100% ở -20°C, rửa cặn bằng ethanol 70%).

Chương này cũng trình bày chi tiết quy trình điện di gel agarose 1%, quy trình đo mật độ quang học trên NanoDrop One, các bước biến đổi bisulfite bằng EZ DNA Methylation - Gold Kit, và quy trình truy vấn Ensembl cùng phần mềm Methyl Primer Express v1.0 để thiết kế mồi MSP.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp số liệu thực nghiệm tách chiết và phân tích tin sinh học:

• Đánh giá định lượng bốn phương pháp tách chiết: Dữ liệu nồng độ và các tỷ số mật độ quang của từng nhóm mẫu được phân tích cụ thể. Phương pháp sử dụng bộ kit FavorPrep cho nồng độ DNA thấp nhất nhưng độ tinh sạch cao nhất (83% mẫu không còn tồn dư phenol, 30% mẫu có A260/A280 đạt 1,6–1,7). Phương pháp Lysis buffer cho nồng độ cao (34,40% mẫu >1000 ng/µl) và vạch điện di rõ hơn nhưng 58,06% mẫu bị tạp nhiễm phenol. Phương pháp Campos cho nồng độ khá nhưng tồn dư phenol tới 60%. Phương pháp NaOH 2N cho nồng độ cao bất thường nhưng không hiện vạch trên gel điện di và 75% mẫu nhiễm tạp chất.
• Phân tích in silico và thiết kế mồi: Định vị tọa độ của gen FLI1 trên nhiễm sắc thể số 1 (đoạn 65.058.434 – 65.058.508 bp) và gen AGRN trên nhiễm sắc thể số 1 (đoạn 1.047.475 – 1.047.838 bp) trích xuất từ Ensembl. Phần mềm Methyl Primer Express v1.0 đã tạo ra 8 cặp mồi (gồm 16 trình tự mồi) đặc hiệu cho cả vùng promoter và đảo CpG của hai gen ở trạng thái methyl hóa (M) và không methyl hóa (U).

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận thu thập và so sánh dữ liệu thực nghiệm tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư đại trực tràng cố định formaldehyde qua bảng tổng hợp định lượng:

Chỉ tiêu theo dõi	Phương pháp Campos và cộng sự	Phương pháp sử dụng bộ KIT	Phương pháp NaOH 2N	Phương pháp Lysis buffer
Số lượng mẫu khảo sát	10 mẫu	43 mẫu	8 mẫu	84 mẫu
Khối lượng mẫu mô sử dụng	125 mg	25 – 30 mg	125 mg	25 – 125 mg
Nồng độ DNA > 1000 ng/µl	4 mẫu (40,0%)	0 mẫu (0,0%)	4 mẫu (50,0%)	32 mẫu (34,40%)
Nồng độ DNA > 500 ng/µl	0 mẫu (0,0%)	0 mẫu (0,0%)	3 mẫu (37,5%)	18 mẫu (19,35%)
Nồng độ DNA > 100 ng/µl	6 mẫu (60,0%)	6 mẫu (13,95%)	0 mẫu (0,0%)	31 mẫu (33,33%)
Nồng độ DNA < 100 ng/µl	0 mẫu (0,0%)	37 mẫu (86,05%)	0 mẫu (0,0%)	12 mẫu (14,29%)
Tỷ lệ A260/A280	1,0 – 1,4	1,6 – 1,7 (30% số mẫu)	1,5 – 1,8 (3 mẫu)	1,0 – 1,4
Tỷ lệ A260/A230	Hầu hết < 1,8	Không ổn định (> 1,0)	Đa số < 1,5 (1 mẫu > 2,0)	Đều < 1,0
Tình trạng tạp nhiễm hóa chất	6 mẫu nhiễm phenol (60%)	83% mẫu sạch phenol	6 mẫu nhiễm tạp (75%)	54 mẫu nhiễm phenol (58,06%)
Đánh giá hình ảnh điện di gel	Vạch mờ, chất lượng kém	Band DNA yếu, đứt gãy	Không hiển thị vạch DNA	Hiển thị vạch rõ hơn
Kết luận đánh giá quy trình	Cần tối ưu loại bỏ phenol	Tối ưu nhất về độ tinh sạch	Không phù hợp, bị loại bỏ	Cho nồng độ tốt, cần tối ưu độ sạch

Về phân tích tin sinh học, đề tài đã thiết kế hoàn chỉnh hệ thống 16 trình tự mồi phân tử phục vụ phản ứng PCR đặc hiệu methyl hóa cho hai gen AGRN và FLI1:

1. AGRN CpG M-F: TTTTATTTATTTTTTTAGTTTCGCG
2. AGRN CpG M-R: CGAAAATCTACTATCCCCGTC
3. AGRN CpG U-F: TTTATTTATTTTTTTAGTTTTGTGG
4. AGRN CpG U-R: CCAAAAATCTACTATCCCCATC
5. AGRN Promoter M-F: TTTTTCGTTTGCGTTATGGTC
6. AGRN Promoter M-R: GTATACTACACCGAATCCACGTT
7. AGRN Promoter U-F: GTTTTTTGTTTGTGTTATGGTTGG
8. AGRN Promoter U-R: ACATATACTACACCAAATCCACATT
9. FLI1 Promoter M-F: AATGTGTTTGGGTATTTTCGC
10. FLI1 Promoter M-R: AAATAACTTCACTTTACGAATCGAA
11. FLI1 Promoter U-F: TATGAATGTGTTTGGGTATTTTTGT
12. FLI1 Promoter U-R: AAATAACTTCACTTTACAAATCAAA
13. FLI1 CpG M-F: CGTTCGTATAGATTTTTAGCGTTTC
14. FLI1 CpG M-R: TTACAACCTAAACCCAAACTTAACG
15. FLI1 CpG U-F: TTTGTTTGTATAGATTTTTAGTGTTTT
16. FLI1 CpG U-R: CAACCTAAACCCAAACTTAACA

Đóng góp của tác giả: Đề tài là nghiên cứu bước đầu tại Việt Nam khảo sát tình trạng methyl hóa trên hai gen FLI1 và AGRN. Nghiên cứu đã thực hiện so sánh đối chứng đồng thời bốn quy trình tách chiết trên mẫu mô bệnh phẩm ngâm formaldehyde lưu trữ tại Bệnh viện K Trung ương, xác định rõ ưu nhược điểm của từng phương pháp trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm tại Việt Nam; đồng thời cung cấp bộ mồi đặc hiệu làm công cụ cho các nghiên cứu dịch tễ phân tử tiếp theo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có các hạn chế được ghi nhận từ nội dung văn bản:

• Chất lượng DNA tách chiết từ mô bảo quản formaldehyde còn thấp: DNA bị phân mảnh, đứt gãy nhiều và chịu ảnh hưởng tiêu cực của phản ứng liên kết chéo do formaldehyde gây ra.
• Hiệu suất loại bỏ tạp chất ở các phương pháp thủ công chưa cao: phương pháp Campos và phương pháp Lysis buffer còn tồn dư phenol cao (từ 58% đến 60% số mẫu), trong khi phương pháp dùng bộ kit cho độ tinh sạch tốt nhưng nồng độ DNA thu được còn thấp.
• Nghiên cứu mới dừng lại ở bước khảo sát quy trình tách chiết và thiết kế mồi in silico, chưa triển khai phản ứng biến đổi bisulfite thực tế và chưa chạy thực nghiệm khuếch đại PCR trên mẫu bệnh nhân để định lượng tỷ lệ methyl hóa thực tế của gen FLI1 và AGRN trong quần thể.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả kiến nghị:

• Tối ưu hóa điều kiện rửa mẫu và tinh sạch của phương pháp Campos và phương pháp Lysis buffer để tăng nồng độ đồng thời loại bỏ triệt để tồn dư phenol.
• Ứng dụng các cặp mồi MSP đã thiết kế vào thực nghiệm biến đổi bisulfite và khuếch đại PCR trên tập mẫu lâm sàng ung thư đại trực tràng mở rộng nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của các chỉ thị phân tử này.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho các đối tượng:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ sinh học và Sinh học phân tử: Cung cấp tài liệu tham khảo thực tế về các bước xử lý mẫu mô khó (mô FFPE ngâm bảo quản formaldehyde lâu ngày), kỹ thuật đánh giá quang phổ NanoDrop (giải thích ý nghĩa tỷ số A260/A280, A260/A230 và nhận diện tạp nhiễm phenol/muối).
• Cán bộ nghiên cứu biểu sinh học và ung thư học thực nghiệm: Tham khảo quy trình thiết kế mồi MSP trên phần mềm Methyl Primer Express v1.0, cách lựa chọn đảo CpG và promoter từ cơ sở dữ liệu Ensembl.
• Phần đáng tham khảo nhất trong văn bản: Quy trình xử lý rửa mô phân cấp bằng đệm GTE kết hợp cồn giảm dần (Mục 3.4) và bảng tổng hợp 16 trình tự mồi phân biệt trạng thái methyl hóa của hai gen AGRN và FLI1 (Mục 4.2).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn phương pháp tách chiết DNA từ mô cố định formaldehyde được thử nghiệm trong khóa luận là gì và phương pháp nào cho độ tinh sạch tốt nhất?
Bốn phương pháp gồm: phương pháp phenol-chloroform kết hợp đệm alkali của Campos và cộng sự; phương pháp sử dụng bộ kit thương mại FavorPrep Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit; phương pháp kiềm hóa NaOH 2N (mô phỏng tách DNA móng tay); và phương pháp Lysis buffer (mô phỏng tách DNA thực vật Osmanthus). Trong đó, phương pháp sử dụng bộ KIT đạt độ tinh sạch cao nhất khi có 83% mẫu không còn tồn dư phenol và 30% mẫu đạt tỷ lệ A260/A280 từ 1,6–1,7, dù nồng độ DNA thu được thấp hơn các phương pháp khác.

2. Tọa độ nhiễm sắc thể và kích thước vùng gen phân tích của FLI1 và AGRN được xác định như thế nào?
Theo dữ liệu trích xuất từ cơ sở dữ liệu Ensembl Genome Browser trong khóa luận:

• Gen FLI1 nằm trên nhiễm sắc thể số 1, đoạn trình tự phân tích có chiều dài từ vị trí nucleotide 65.058.434 bp đến 65.058.508 bp.
• Gen AGRN nằm trên nhiễm sắc thể số 1, đoạn trình tự phân tích có chiều dài từ vị trí nucleotide 1.047.475 bp đến 1.047.838 bp.

3. Vì sao phương pháp tách chiết sử dụng NaOH 2N bị loại bỏ?
Mặc dù nồng độ đo được trên máy quang phổ rất cao (50% mẫu >1000 ng/µl), phương pháp NaOH 2N có tỷ lệ nhiễm tạp chất lên tới 75%, tỷ số A260/A230 thấp (<1,5) và khi điện di kiểm tra trên gel agarose hoàn toàn không hiển thị vạch DNA (không có band). Tác giả nhận định nồng độ cao đo được là do tạp chất gây nhiễu và phương pháp này không thích hợp cho mẫu mô cố định formalin.

4. Khóa luận đã thiết kế được bao nhiêu mồi PCR và cấu trúc các cặp mồi này như thế nào?
Tác giả đã thiết kế tổng cộng 16 trình tự mồi (tương ứng 8 cặp mồi) sử dụng phần mềm Methyl Primer Express v1.0. Mỗi gen (AGRN và FLI1) được thiết kế 4 cặp mồi chia đều cho hai vùng (vùng promoter và vùng đảo CpG), trong đó mỗi vùng gồm 1 cặp mồi nhận diện trạng thái methyl hóa (M) và 1 cặp mồi nhận diện trạng thái không methyl hóa (U) sau khi xử lý biến đổi bisulfite.

5. Mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu được thu thập từ nguồn nào và được bảo quản ra sao?
Mẫu nghiên cứu là mô khối u và mô lành liền kề được cố định trong formaldehyde, thu thập trực tiếp từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng phẫu thuật tại Bệnh viện K Trung ương vào năm 2019, sau đó được chuyển về lưu trữ và xử lý tại Viện Khoa học Sự sống – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Nguyễn Phi Cường đã tiến hành so sánh thực nghiệm bốn quy trình tách chiết DNA trên mẫu mô ung thư đại trực tràng cố định formaldehyde và xác định phương pháp sử dụng bộ kit thương mại cho độ tinh sạch cao nhất dù nồng độ còn hạn chế. Nghiên cứu đồng thời định vị tọa độ phân tử của hai gen FLI1 và AGRN trên nhiễm sắc thể số 1 thông qua cơ sở dữ liệu Ensembl. Kết quả thiết kế thành công 8 cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP) bằng Methyl Primer Express v1.0 tạo lập cơ sở kỹ thuật và dữ liệu mồi quan trọng phục vụ các bước thực nghiệm sinh học phân tử tiếp theo trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Trong các cơ chế phân tử liên quan đến ung thư đại trực tràng, sự methyl hóa DNA là một trong những cơ chế có ảnh hưởng lớn. Các nghiên cứu về methyl hóa ở DNA đa phần được thực hiện trên quần thể người Châu Âu và người Châu Mỹ, hay nói cách khác là người da trắng là chính và một phần là người da đen. Các nghiên cứu trên quần thể người da vàng còn hạn chế về mặt số lượng.

DNA methylation là một cơ chế epigenetics và cơ chế này không giống như cơ chế di truyền, cơ chế epigenetics có sự khác biệt bởi yếu tố môi trường. Yếu tố môi trường ở đây rất rộng, nó bao gồm các yếu tố như chủng tộc, chế độ ăn uống, chế độ sinh hoạt,… Trong những năm đầu của cuộc cách mạng sinh học phân tử, nghiên cứu ung thư chủ yếu tập trung vào thay đổi di truyền, bao gồm cả ung thư đại trực tràng. Cơ chế epigenetics là cơ chế rất cần thiết cho sự phát triển bình thường và duy trì các mẫu biểu hiện gen đặc hiệu của mô ở động vật có vú. Sự gián đoạn của quá trình biểu sinh có thể dẫn đến thay đổi chức năng gen và biến đổi tế bào ác tính.[1] Ở người, methyl hóa DNA là một trong những vấn đề được quan tâm và nghiên cứu chuyên sâu.

Trong các tế bào bình thường, nó đảm bảo sự điều hòa biểu hiện gen và làm gen ổn định. Quá trình methyl hóa DNA có liên quan đến thay đổi histone và sự tương tác của các thay đổi biểu sinh, các thay đổi này rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động của bộ gen bằng cách thay đổi cấu trúc chromatin. Quá trình methyl hóa bị hạn chế ở dư lượng cytosine và chủ yếu gặp trong dinucleotide cytosine-guanine (CG) (thường được viết tắt là CpGine). Dinucleotide này không được thể hiện trong toàn bộ bộ m 2 gen, nhưng nó xuất hiện với độ dài tăng dần trong khoảng 0,3 kb và khoảng 40% gen người có chứa một đảo CpG trong vùng promoter.

Việc bổ sung cộng hóa trị của một nhóm methyl thường xảy ra ở cytosine trong các dinucleotide CpG và tập trung thành các cụm lớn gọi là đảo CpG [2]. Việc phát hiện ra ung thư đại trực tràng hiện nay được xem là điều cần thiết, nhưng để phát hiện sớm không hề dễ dàng. Đặc điểm của khối u khi mới phát sinh là kích thước còn rất nhỏ, sau đó khối u tăng kích thước và bám vào thành ruột nhưng chưa đâm thủng thành ruột. Khi ở dai đoạn này, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh là 90%.

Khối u sẽ tiếp tục tăng kích thước, đâm thủng thành ruột nhưng chưa di căn, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh lúc này giảm đi còn 70%. Bản thân những người mắc ung thư đại trực tràng họ thường không thể biết được những triệu chứng ban đầu của bệnh, tỷ lệ phát hiện bệnh là 39%. Khi tế bào ung thư đã di căn đến các vùng khác của cơ thể thì tỷ lệ phát hiện bệnh là 61%, lúc này tỉ lệ sống sót của người bênh chỉ còn 12% vì phát hiện quá muộn. Vì vậy, việc phát hiện sớm bệnh và tầm quan trọng của sự thay đổi methyl hóa DNA trong khối u có một ý nghĩa rất lớn đối với con người, trong tương lai methyl hóa có thể được phát triển thành một chỉ số theo dõi phác đồ điều trị ung thư.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng em tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM”. Mục tiêu nghiên cứu 1. Mục tiêu tổng quát Tìm ra những chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với tần số xuất hiện cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam. Mục tiêu cụ thể - Tách chiết được DNA đạt được tiêu chuẩn từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng từ mẫu cố định formaldehyde để vụ cho các nội dung thí nghiệm của đề tài.

- Thiết kế được một số cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. - Phần tích được các đặc điểm, cấu trúc của gene trên máy tính. - Thiết kế được cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.

m 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.Ung thư đại trực tràng 2. Khái niệm ung thư đại trực tràng Vài thập kỷ trước, do điều kiện khoa học và cơ sở vật chất trang thiết bị chưa phát triển, bệnh ung thư đại trực tràng được chẩn là một bệnh rất mới. Ngày nay, ung thư đại trực tràng được xem là căn bệnh nguy hiểm đứng thứ tư trên thế giới với gần 900 000 ca tử vong hàng năm [3]. Ung thư ruột hay ung thư đại trực tràng là tên gọi chung của ung thư đại tràng và và ung thư trực tràng, tức là ung thư phát triển từ đại tràng hay trực tràng (là những phần của ruột già), nó được tạo nên bởi sự phát triển bất thường của các tế bào và có khả năng lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể.

Dấu hiệu và triệu chứng bao gồm xuất hiện máu trong phân, tụt cân, đau bụng giữ dội, có sự thay đổi trong nhu động ruột và cơ thể luôn luôn cảm thấy mệt mỏi. Hầu hết các nguyên nhân gây bệnh ung thư đại trực tràng là do các yếu tố về lối sống không lành mạnh và độ tuổi, với chỉ một số ít trường hợp là do rối loạn gen di truyền. Bên cạnh vấn đề về tỷ lệ dân số già và thói quen ăn uống của các nước có thu nhập bình quân đầu người cao thì các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh có thể kể đến ở đây bao gồm chế độ ăn không tốt, bệnh béo phì, hút nhiều thuốc lá, và ít hoạt động thể chất, lười tập thể dục. Những yếu tố về chế độ ăn làm tăng nguy cơ hình thành bệnh là nhiều người ăn thịt đỏ, thịt sống, sử dụng những sản phẩm thịt để lâu quá hạn, không đảm bảo về ăn chín uống sôi.

Không chỉ thế mà vấn đề về sử dụng rượu cũng rất đáng nói, vì uống rượu nhiều cũng là yếu tố nguy cơ gây nên các bệnh về đường ruột như viêm đường ruột, trong đó bao gồm bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [4].Cơ chế gây ung thư Sự hình thành ung thư đại trực tràng bắt đầu với sự biến đổi của niêm mạc biểu mô bình thường thành biểu mô tăng sinh. Những tế bào biểu mô ruột m 5 tăng sinh mất tổ chức và cấu trúc của chúng và có khả năng hình thành adenomas. Adenomas sau đó có thể phát triển và xâm lấn vào vùng dưới niêm mạc và trở thành ung thư với khả năng phổ biến vào đại tràng. Chuỗi hoạt động này được gọi là chuỗi adenoma-carcinoma, từ đó có thể dẫn đến CRC.

Ba cơ chế chính của sự mất ổn định di truyền: mất ổn định nhiễm sắc thể, mất ổn định kính hiển vi và kiểu hình methylator đảo CpG. Các cơ chế này có tác động đến các đường dẫn tín hiệu chính và dẫn đến mất kiểm soát sự tăng sinh tế bào, tăng trưởng tế bào không giới hạn và phát triển khối u [5].Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới Theo dữ liệu của GLOBOCAN 2018, ung thư đại trực tràng (CRC) là bệnh ung thư đứng thứ tư trên thế giới và là dạng ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ ba trên toàn cầu, bao gồm 11% trong số tất cả các chẩn đoán ung thư khác nhau.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính năm 2018 http://globocan.000 trường hợp ung thư ruột kết mới ước tính sẽ được chẩn đoán vào năm 2018, trong khi khoảng 704.000 trường hợp ung thư trực tràng mới được phát hiện. CRC là bệnh ung thư được chẩn đoán có tỷ lệ mắc nhiều m 6 nhất ở nam giới với 10 trong số 191 quốc gia trên toàn thế giới. Còn chẩn đoán trên phụ nữ thì không có quốc gia nào có tỉ lệ cao cả [6].

Tỷ lệ mắc bệnh CRC không chỉ xảy ra nhiều ở nam giới hơn là nữ giới mà tỷ lệ đó còn gấp 3 đến 4 lần đối với các quốc gia đang phát triển. Tỷ lệ mắc bệnh chuẩn theo tuổi trên thế giới là 100.000 ca, ở cả hai giới là 19,7%, ở nam là 23,6% và ở nữ là 16,3%. Mặc dù tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở nam giới là 30,1%/100.000 ở các quốc gia có chỉ số HDI (chỉ số phát triển con người) cao, nhưng ở các quốc gia có HDI thấp thì tỷ lệ này giảm xuống (thống kê tương tự ở nữ là 20,9% và 5,9%).000 đàn ông và 521.000 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng [6].2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018 http://globocan.fr/ Các nước phát triển là các nước có nguy cơ mắc ung thư đại tràng và trực tràng cao nhất. Đối với ung thư ruột kết, Nam Âu, Úc / New Zealand và Bắc m 7 Âu là những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất.

Đối với ung thư trực tràng, các khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là Đông Âu, Úc / New Zealand và Đông Á. Bắc Mỹ cũng là một trong những nơi có tỷ lệ mắc cao nhất đối với cả hai bệnh ung thư. Quốc gia có tỷ lệ mắc CRC cao nhất trên 100,000 dân là Hungary (70,6%) ở nam và Na Uy (29,3%) ở nữ. Tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Ả Rập Saudi, Ô-man, Yemen, Bahrain, Qatar, Kuwait và Slovakia CRC cũng là bệnh ung thư được chẩn đoán nhiều nhất ở nam giới.

Trong khi đó, tất cả các khu vực của Châu Phi, cũng như Nam Á thì CRC có tỷ lệ mắc thấp nhất đối với cả hai giới [6] .3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm 2018 http://globocan.fr/ Ung thư trực tràng là một trong những bệnh gây tử vong nhiều nhất, với 310.000 ca tử vong, chiếm 3,2% tổng số ca tử vong do ung thư, ở độ tuổi từ 0 đến 74 tuổi, tử vong do ung thư đại tràng là 0,66% ở nam giới và 0,44% ở phụ m 8 nữ. Nguy cơ tương tự ung thư trực tràng là 0,46% ở nam và 0,26% ở nữ. Tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) ở cả hai giới là 8.