Luận văn nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử sept9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam

Nghiên cứu tình trạng methyl hóa chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng trong chẩn đoán và điều trị bệnh.

• Tác giả: Trần Hoài Nam
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tình Trạng Methyl Hóa Chỉ Thị Phân Tử SEPT9 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng Việt Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỤC LỤC
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Khái niệm ung thư
• 2.2. Cơ chế hình thành bệnh ung thư
• 2.3. Ung thư đại trực tràng
• 2.4. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng
• 2.5. Tình hình ung thư đại trực tràng
• 2.6. Mối liên hệ giữa Methyl hoá DNA và ung thư đại trực tràng
• 2.6.1. Methyl hoá DNA
• 2.6.2. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite
• 2.6.3. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K
• 2.6.4. Nghiên cứu trong nước và quốc tế về methyl hóa của gene SEPT9 trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng
• 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiêm cứu
• 3.2. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu ung thư CRC ở bệnh viện K TW
• 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde
• 3.5.3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá bằng phương pháp thiết kế Insilicon
• 3.5.4. Quá trình chuyển hoá bisulfite cho mẫu DNA
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thu thập và phân tích số liệu lâm sàng trên 151 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được thu thập ngẫu nhiên tại bệnh viện K TW
• 4.2. Kết quả phân tích về độ tuổi phát hiện ung thư
• 4.3. Kết quả phân tích về giới tính
• 4.4. Kết quả phân tích về giai đoạn phát hiện bệnh
• 4.5. Khảo sát về tỷ lệ mức độ cả bệnh khi phát hiện ra bị ung thư đại trực tràng tại bệnh viện K TW
• 4.6. Kết quả tách chiết DNA
• 4.7. Kết quả lựa chọn phương pháp phù hợp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde
• 4.8. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng B đã tối ưu và phương pháp sử dụng Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit
• 4.9. Kết quả thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá
• 4.10. Thu thập thông tin gene SEPT9 từ cơ sở dữ liệu database
• 4.11. Xác định trình tự promoter trên gene SEPT9
• 4.12. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa
• 4.13. Kết quả chuyển hoá bisulfite đối với DNA được tách chiết từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng
• 4.14. Kết quả chất lượng DNA chuẩn bị cho quá trình biến đổi bisufite
• 4.15. Kết quả chuyển đổi bisufite
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào tình trạng methyl hóa của chỉ thị phân tử SEPT9 trong ung thư đại trực tràng tại Việt Nam. Methyl hóa DNA là một cơ chế biến đổi di truyền ngoại gen, có vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư. SEPT9 là một chỉ thị sinh học được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu này nhằm khảo sát mức độ methyl hóa của SEPT9 ở bệnh nhân Việt Nam, góp phần vào việc sàng lọc và chẩn đoán sớm bệnh.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu là thiết lập các kỹ thuật cơ bản để đánh giá mức độ methyl hóa của SEPT9 trong ung thư đại trực tràng. Các mục tiêu cụ thể bao gồm thu thập dữ liệu lâm sàng, tối ưu hóa phương pháp tách chiết DNA, và thiết kế bộ mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc mở rộng hiểu biết về methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong chẩn đoán ung thư và hỗ trợ điều trị bệnh.

II. Tổng quan về ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng (CRC) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới và tại Việt Nam. Bệnh thường xuất hiện ở người trên 50 tuổi, nhưng gần đây có xu hướng trẻ hóa. CRC liên quan đến nhiều yếu tố nguy cơ, bao gồm di truyền, chế độ ăn uống, và lối sống. Methyl hóa DNA được xem là một cơ chế quan trọng trong sự phát triển của CRC, đặc biệt là sự bất thường trong methyl hóa các gene ức chế khối u.

2.1. Cơ chế hình thành ung thư

Ung thư hình thành do sự đột biến gene và mất kiểm soát chu kỳ tế bào. Các gene ức chế khối u bị bất hoạt, dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào. Methyl hóa DNA đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế biểu hiện gene, đặc biệt là các gene ức chế khối u.

2.2. Yếu tố nguy cơ

Các yếu tố nguy cơ chính của CRC bao gồm di truyền, viêm loét đại tràng, chế độ ăn uống không lành mạnh, và lối sống ít vận động. Các hội chứng di truyền như Lynch và Turcot cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích phân tử để đánh giá tình trạng methyl hóa của SEPT9. Các bước chính bao gồm tách chiết DNA từ mẫu mô, thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa, và thực hiện kỹ thuật PCR. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

3.1. Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng các phương pháp khác nhau, bao gồm sử dụng bộ kit tách chiết DNA. Chất lượng DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ OD260/280 và OD260/230.

3.2. Thiết kế mồi PCR

Mồi PCR đặc hiệu methyl hóa được thiết kế dựa trên trình tự promoter của SEPT9. Quá trình chuyển đổi bisulfite được thực hiện để xác định vị trí methyl hóa trên DNA.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy tình trạng methyl hóa của SEPT9 có sự khác biệt đáng kể giữa các bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam. Các phương pháp tách chiết DNA và PCR đặc hiệu methyl hóa đã được tối ưu hóa, mang lại kết quả chính xác và đáng tin cậy. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng methyl hóa DNA có tiềm năng ứng dụng cao trong chẩn đoán ung thư và theo dõi điều trị.

4.1. Phân tích dữ liệu lâm sàng

Dữ liệu lâm sàng từ 151 mẫu bệnh phẩm cho thấy tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng cao ở nhóm tuổi trên 50. Tỷ lệ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn cũng khá cao, đặc biệt là ở các bệnh nhân không được sàng lọc định kỳ.

4.2. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng, đặc biệt là ở các quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh cao như Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) là một trong những loại ung thư phổ biến ở người. Trên thế giới, CRC xếp thứ 3 về tỷ lệ người mắc bệnh sau ung thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới, đứng thứ 2 sau ung thư vú ở nữ giới. Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc CRC đứng thứ năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày và vú. Tỉ lệ mắc CRC chiếm 8,7% tổng số bệnh nhân ung thư.000 người mắc bệnh ung thư đại trực tràng trên thế giới và có khoảng 492.000 bệnh nhân tử vong, trong số đó bệnh nhân châu Á chiếm 51,3% tổng số ca mắc trên toàn thế giới.

Theo dự đoán của các chuyên gia tại Hội thảo Ung thư Việt Pháp lần thứ 3 diễn ra tại Hà nội, tới năm 2025 ung thư đại trực tràng sẽ vươn lên hàng thứ hai ở nam giới và thứ tư ở nữ giới. Việc sàng lọc thường xuyên có thể giúp phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng. Theo thống kê của Hiệp hội phòng ngừa Hoa Kỳ công bố mỗi năm có khoảng 60% bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng tử vong, nếu được sàng lọc định kỳ thường xuyên tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh có thể sống thêm 5 năm tăng từ 46% đến 73%. Vì thế việc được sàng lọc thường xuyên sẽ giúp kéo dài thời gian sống khi phát hiện kịp thời.[5] Trong số những cơ chế gây nên ung thư nói chung và ung thư đại trực tràng nói riêng, cơ chế methyl hoá DNA có vai trò quan trọng.

Những biến đổi về di truyền ngoại gen (epigenetic) có liên quan tới quá trình phát sinh ung thư. Nghiên cứu tình trạng methyl hoá DNA có tiềm năng ứng dụng cao trong sàng lọc, chẩn đoán lâm sàng và theo dõi điều trị ung thư.3 Gen SEPT9 ở người là một trong những chỉ thị sinh học hàng đầu để giúp phát hiện và chẩn đoán lâm sàng một số bệnh ung thư trong đó có ung thư đại trực tràng.[5] Trên thế giới đã có những nghiên cứu về tình trạng methyl hoá ở gene SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, tuy nhiên những nghiên cứu trên đa số đều nghiên cứu trên đối tượng người da trắng và người da đen. Mặt khác, methyl hoá DNA có một phần nguyên nhân phụ thuộc vào sắc tộc và môi trường sống. m Hiện nay, theo tìm hiểu của chúng tôi chưa có một nghiên cứu nào nghiên cứu về tình trạng methyl hoá DNA trên gene SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.

Xuất phát từ những luận điểm trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam”.1 Mục tiêu của đề tài 1.1 Mục tiêu tổng quát Thiết lập một số kỹ thuật làm nền tảng cho nghiên cứu khảo sát mức độ methyl hóa chỉ thị SEPT9 trên khối u của bệnh nhân CRC Việt Nam.2 Mục tiêu cụ thể - Thu thập và phân tích một số dữ liệu lâm sàng trên tập hợp 151 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được thu thập ngẫu nhiên tại Việt Nam. - Tìm và tối ưu được phương pháp thích hợp để tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde. Tách chiết khoảng 50 mẫu DNA và đánh giá được chất lượng. - Phân tích in silico cấu trúc gene SEPT9 và thiết kế được bộ mồi PCR đặc hiệu methyl hoá.

- Thực hiện được kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam tạo tiền đề cho các nghiên cứu về methyl hoá gen chỉ thị phân tử khác của các bệnh ung thư.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam mở ra những hướng nghiên cứu liên quan đến ứng dụng trong sàng lọc, chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư đại trực tràng. m Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Khái niệm ung thư Ung thư là sự tăng trưởng bất thường của các tế bào.

Ung thư có thể phát sinh từ bất cứ cơ quan nào trên cơ thể hoặc có thể là các tế bào nhỏ đã mất khả năng ngừng phát triển, dẫn đến cơ thể bị mất khả năng kiểm soát. Cơ chế hình thành bệnh ung thư Có nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều làm biến đổi hoặc đột biến các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào này. Cơ thể được cấu tạo từ rất nhiều loại tế bào, các tế bào đều có sự phát triển và phân chia một cách có kiểm soát, các tế bào sẽ chết theo chu trình được lập sẵn (chương trình Apoptosis) và thay vào là các tế bào mới mạnh khoẻ để duy trì các chức năng của cơ thể. Các tác nhân gây đột biến như hoá chất độc hại, tia phóng xạ, các virus ung thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gene hoặc NST, nên tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào.

Vật liệu di truyền (DNA) của một tế bào bị thay đổi hoặc hư hỏng làm tăng sinh vô tổ chức các tế bào lỗi (tế bào ung thư). Các tế bào không chết đi theo chương trình Apoptosis như các tế bào bình thường mà tăng sinh và nhân lên một cách mất kiểm soát. Các tế bào này có thể sẽ tạo thành một khối lớn gọi là khối u. Không phải khối u nào cũng là ung thư, các khối u không lây lan ra các phần khác của cơ thể là khối u lành tính, không phải ung thư.

Các khối u lành tính được cắt bỏ và đa số sẽ tái phát. Các khối u có khả năng di căn sang các phần khác gọi là u ác tính hay còn được gọi là ung thư.[1] Cơ chế gây bệnh ung thư do đột biến gene làm mất kểm soát chu kỳ tế bào. Cơ thể có hai nhóm gene kiểm soát chu kỳ của tế bào: Nhóm gene quy định yếu tố sinh trưởng và nhóm gene gây ức chế khối u. Ở các tế bào bình thường hai nhóm gene này hoạt động hài hoà với nhau.

Tuy nhiên khi có đột biến, cơ chế này bị phá vỡ và tế bào nhân lên không kiểm soát.[1] Các giai đoạn phát triển của ung thư [1] : m - Giai đoạn khởi phát: Bắt đầu từ khi tế bào gốc tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến và trở thành tế bào khởi phát. - Giai đoạn tăng trưởng, thúc đẩy, chuyển biến: tế bào ung thư còn ở mức độ nhỏ, cư trú ở một mô trên cơ thể - Gian đoạn lan tràn: Giai đoạn này có thể kéo dài vài tháng hoặc vài năm. Các khối u tăng sinh mạnh mẽ. - Giai đoạn tiến triển, xâm lấn, di căn: Giai đoạn này là sự tăng kích thước của các khối u.

Đây là giai đoạn khối u phát triển nhanh và xâm lấn các mô tổ chức khác. Có rất nhiều nguyên nhân gây nên bệnh ung thư, như: Yếu tố di truyền, tiếp xúc với các chất hoá học, các tia phóng xạ, hút thuốc lá thường xuyên, chế độ ăn uống không lành mạnh, lười vận động …Hầu hết các ung thư lần đầu được chẩn đoán dựa vào các triệu chứng xuất hiện hoặc nhờ vào quá trình tầm soát. Qua đó không thể chẩn đoán xác định được mà phải nhờ vào sinh thiết. Một số trường hợp ung thư khác được chẩn đoán tình cờ nhờ khi đang khám hoặc điều trị bệnh khác.

Triệu chứng của hầu hết các bệnh nhân ung thư đều không rõ ràng. Khi xuất hiện triệu chúng rõ ràng thường là khi bệnh đã tiến triển trầm trọng. Thông thường ung thư có thời gian ủ bệnh khá dài, khoảng 10 năm hoặc hơn nữa tuỳ vào từng thể loại ung thư. Do đó cách phòng và điều trị ung thư hiệu quả nhất được khuyến cáo là nên đi khám sức khỏe định kì 6 tháng một lần.

Do ung thư là tập hợp của nhiều dạng bệnh khác nhau nên triệu chứng của ung thư rất đa dạng và khác nhau tuỳ vào từng thể loại ung thư. Nói chung, triệu chứng của ung thư được chia làm ba nhóm chính : Triệu chứng tại chỗ: Các khối u bất thường hay phù nề, chảy máu, đau hoặc loét. Chèn ép vào các mô xung quanh có thể gây ra các triệu chứng như vàng da. Triệu chứng di căn : Hạch bạch huyết lớn lên, ho ra máu, gan to, đau xương, gãy xương ở những xương bị tổn thương và các triệu chứng thần kinh.

Đau có thể gặp ở ung thư giai đoạn tiến triển, nhưng thông thường đó không phải là triệu chứng đầu tiên. Triệu chứng toàn thân : Sụt cân, chán ăn, suy mòn, tiết nhiều mồ hôi, thiếu máu và các hội chứng cận u đặc hiệu, đó là tình trạng đặc biệt được gây ra bởi ung thư đang hoạt động, chẳng hạn như huyết khối hay thay đổi nội tiết tố. Ung thư đại trực tràng 2. Khái niệm Ung thư đại trực tràng (CRC) hay còn gọi là ung thư ruột, ung thư ruột kết hoặc ung thư trực là một trong những ung thư hàng đầu trên thế giới cũng như ở Việt Nam.

Ung thư đại trực tràng được đánh giá là dạng ung thư đứng thứ ba ở Mỹ trên cả nam và nữ .Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày, vú.[5] Ung thư đại trực tràng thường xuất hiện phổ biến ở những người trên 50 tuổi.Tuy nhiên, những năm gần đây ung thư đại trực tràng có xu hướng xuất hiện ngày càng nhiều ở những người có độ tuổi trẻ hơn. Theo số liệu thống kê của WHO 2018, Việt Nam mỗi năm ghi nhận 15.000 ca mắc mới, tỷ lệ 13,4/100.000 dân và khoảng 7.000 ca tử vong. Trên thới giới, mỗi năm có thêm 8 triệu ca mắc mới, trong đó có 860.000 ca tử vong và con số này đang không ngừng tăng lên. Trong đó, các quốc gia châu Á chiếm 51,3% tổng ca mắc trên toàn cầu.[18] Đại tràng và trực tràng là phần cuối của hệ thống ống tiêu hóa, thường gọi là ruột già, đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý các thức ăn không tiêu hóa được (chất xơ,.), một số vi khuẩn ở ruột già có thể sản xuất các vitamin cho cơ thể, hấp thụ thức ăn và tạo nên phân để thải ra ngoài.

Đại trực tràng ở người trường thành thường có kích thước khoảng 1,5 - 1,8 m; phần ruột lớn hình chữ N gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tàng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng.