Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng (Colorectal Cancer - CRC) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu trên thế giới và tại Việt Nam. Theo thống kê dịch tễ học, CRC xếp thứ ba về tỷ lệ mắc ở nam giới (sau ung thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt) và đứng thứ hai ở nữ giới (sau ung thư vú). Tại Việt Nam, CRC đứng hàng thứ năm trong các bệnh ung thư phổ biến (sau ung thư gan, phổi, dạ dày và vú), chiếm khoảng 8,7% tổng số ca mắc ung thư. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2018), Việt Nam ghi nhận khoảng 15.000 ca mắc mới mỗi năm (tỷ lệ 13,4/100.000 dân) cùng 7.000 trường hợp tử vong. Việc sàng lọc và phát hiện sớm có ý nghĩa quyết định đối với tiên lượng điều trị, giúp nâng tỷ lệ sống sau 5 năm từ 46% lên 73%.

Bên cạnh các đột biến di truyền kinh điển, biến đổi ngoại di truyền (epigenetics) – đặc biệt là cơ chế methyl hóa DNA – đóng vai trò chủ chốt trong quá trình khởi phát và tiến triển của ung thư đại trực tràng. Hiện tượng tăng methyl hóa (hypermethylation) bất thường tại các đảo CpG ở vùng promoter dẫn đến bất hoạt các gene ức chế khối u. Gene SEPT9 ở người đã được chứng minh là một chỉ thị sinh học phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong sàng lọc, chẩn đoán CRC qua máu hoặc mô sinh thiết. Tuy nhiên, mức độ methyl hóa DNA chịu sự chi phối của yếu tố sắc tộc và môi trường sống. Trong khi các nghiên cứu quốc tế chủ yếu tập trung trên người da trắng và da đen, dữ liệu về tình trạng methyl hóa gene SEPT9 trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam chưa được công bố.

Khóa luận được triển khai nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể:

  1. Mục tiêu tổng quát: Thiết lập một số kỹ thuật làm nền tảng cho nghiên cứu khảo sát mức độ methyl hóa chỉ thị phân tử SEPT9 trên khối u của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
  2. Mục tiêu cụ thể:
    • Thu thập và phân tích một số dữ liệu lâm sàng trên tập hợp 151 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư đại trực tràng thu thập ngẫu nhiên tại Bệnh viện K Trung ương.
    • Tìm và tối ưu hóa phương pháp thích hợp để tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde; tiến hành tách chiết và đánh giá chất lượng DNA.
    • Phân tích in silico cấu trúc gene SEPT9 và thiết kế bộ mồi PCR đặc hiệu methyl hóa (Methylation-Specific PCR - MSP).
    • Thực hiện kỹ thuật chuyển đổi bisulfite và kiểm tra chất lượng DNA phục vụ phản ứng PCR đặc hiệu methyl hóa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Mẫu mô khối u và mô lành lân cận khối u của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được bảo quản trong dung dịch formaldehyde do Bệnh viện K Trung ương cung cấp.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện Khoa học sự sống – Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên, trong thời gian từ tháng 12/2019 đến tháng 07/2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

  • Methyl hóa DNA và cơ chế sinh ung: Methyl hóa DNA là quá trình gắn nhóm methyl (-CH3) vào vị trí carbon số 5 của vòng cytosine trong phức hợp dinucleotide CpG tạo thành 5-methylcytosine (5mC). Trong hệ gene người, các đảo CpG (kích thước 0,5 – 5,0 kb) tập trung chủ yếu ở vùng promoter. Ở tế bào bình thường, vùng promoter thường không bị methyl hóa để duy trì cấu trúc nhiễm sắc thực cho phép phiên mã. Khi xảy ra biến đổi bất thường, hiện tượng hypermethylation khiến nhiễm sắc chất chuyển thành dạng dị nhiễm sắc, làm "im lặng" các gene ức chế khối u (như MGMT, BRCA1, RASSF1A, GSTP1, DcR1).
  • Nguyên lý chuyển đổi bisulfite: Xử lý DNA bằng natri bisulfite làm khử amin biến đổi các cytosine không bị methyl hóa thành uracil (sau đó chuyển thành thymine qua khuếch đại PCR), trong khi các cytosine đã bị methyl hóa (5mC) được giữ nguyên. Phản ứng này tạo ra sự khác biệt về trình tự nucleotide để mồi đặc hiệu có thể phân biệt trạng thái methyl hóa.
  • Kỹ thuật phân tích: Giới thiệu công nghệ vi mảng hiệu năng cao Illumina Infinium Human Methylation 450K BeadChip và kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP) sử dụng các cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với trình tự biến đổi sau bisulfite.

Phương pháp nghiên cứu

  • Phương pháp dịch tễ học mô tả: Thu thập, xử lý và phân tích dữ liệu lâm sàng (tuổi, giới tính, giai đoạn bệnh, tình trạng di căn) của 151 bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
  • Phương pháp tách chiết DNA từ mô cố định formaldehyde (FFPE): Tiến hành khảo sát so sánh 4 quy trình tách chiết trên 8 mẫu thử nghiệm ban đầu (khối lượng 25 mg/mẫu):
    • Phương pháp bộ kit: Dùng Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit (FavorPrep), ly giải tế bào bằng FATG1 buffer và Proteinase K, tinh sạch qua cột silica.
    • Phương pháp A: Dựa trên quy trình tách lá tươi (Phòng Nuôi cấy mô tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học), ly giải bằng đệm kiềm alkali (100°C trong 40 phút), tinh sạch bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1).
    • Phương pháp B: Dựa trên nghiên cứu của Campos và Gilbert (2012), ly giải bằng Lysis buffer (Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M, SDS 10%) kết hợp Proteinase K (56°C trong 10 giờ) và RNase A (37°C trong 1 giờ), tinh sạch bằng dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (CIAA).
    • Phương pháp C: Dựa trên nghiên cứu của Alexander (2016) trên mẫu sừng móng tay, ly giải bằng NaOH 2N (37°C trong 12 giờ), trung hòa về pH 6,8 bằng HCl 12N, tinh sạch bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1).
  • Phương pháp đánh giá chất lượng DNA:
    • Điện di trên gel agarose 1% pha dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide, quan sát dưới máy soi gel UV và máy phân tích hình ảnh Gellogic 1500; dùng thang chuẩn GeneRuler 1kb.
    • Đo quang phổ hấp thụ bằng máy NanoDrop One (Thermo Scientific) để xác định nồng độ DNA (ng/µl) và độ sạch qua các tỷ số hấp thụ quang học OD260/280 và OD260/230.
  • Phương pháp tin sinh học (in silico):
    • Khai thác cơ sở dữ liệu GeneCards và trình tự hệ gene Ensembl để xác định tọa độ, kích thước gene SEPT9.
    • Tra cứu cấu trúc promoter của gene SEPT9 từ cơ sở dữ liệu Eukaryotic Promoter Database (EPD).
    • Thiết kế mồi MSP chuyên biệt qua phần mềm trực tuyến MethPrimer.
  • Phương pháp chuyển đổi bisulfite: Ứng dụng bộ kit EZ DNA Methylation - Gold Kit (Zymo Research) xử lý biến tính và khử sulfonate qua các chu kỳ nhiệt (98°C trong 10 phút, 64°C trong 2,5 giờ, 4°C trong 20 giờ).
  • Phương pháp kiểm tra PCR: Chạy phản ứng PCR khuếch đại gene nội chứng FAT1 (kích thước 695 bp) trên máy luân nhiệt để đánh giá độ nguyên vẹn của DNA tách chiết từ mô FFPE; sử dụng gene RBCL trên mẫu cây dong riềng đỏ làm đối chứng dương cho hệ thống hóa chất phản ứng.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tổng quan về gánh nặng bệnh tật của ung thư đại trực tràng trên quy mô toàn cầu và tại Việt Nam. Nêu bật tầm quan trọng của các biến đổi biểu sinh, đặc biệt là hiện tượng methyl hóa promoter gene SEPT9. Đặt ra mục tiêu xây dựng quy trình kỹ thuật nền tảng bao gồm tách chiết DNA mô FFPE, thiết kế mồi MSP và chuyển đổi bisulfite phục vụ cho các nghiên cứu dịch tễ phân tử tại Việt Nam.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa cơ chế bệnh sinh của ung thư, giải phẫu đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ (di truyền: hội chứng Lynch, Turcot, Peutz-Jeghers; không di truyền: viêm loét tiêu hóa, chế độ ăn, lão hóa). Tổng hợp các công trình quốc tế về chỉ thị phân tử SEPT9 (Lele Song và cộng sự, 2017; Xue Yang và cộng sự; Rohit Harihara và Mark Jenkins, 2020 trên 19 nghiên cứu độc lập cho thấy xét nghiệm mSEPT9 phát hiện được khoảng 2/3 ca mắc CRC và loại trừ 92% ca không mắc). Điểm qua các nghiên cứu methyl hóa các gene BRCA1, RASSF1A, GSTP1, DcR1 tại Việt Nam và nhấn mạnh khoảng trống nghiên cứu đối với gene SEPT9.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết hóa chất, trang thiết bị tại Viện Khoa học sự sống. Trình bày từng bước thực nghiệm 4 quy trình tách chiết DNA mẫu mô cố định formaldehyde, các bước cải tiến tối ưu hóa cho phương pháp B, các bước xử lý chuyển hóa bisulfite bằng bộ kit EZ DNA Methylation - Gold, cùng các thông số chu trình nhiệt phản ứng PCR đối với gene FAT1 và mồi RBCL.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

1. Phân tích đặc điểm lâm sàng trên 151 bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Phân tích dữ liệu lâm sàng từ 151 mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện K Trung ương cho thấy các đặc trưng phân bố về nhân khẩu học và giai đoạn bệnh:

Chỉ tiêu lâm sàng Phân loại Số lượng (n = 151) Tỷ lệ (%)
Nhóm tuổi 30 – 50 tuổi 29 19,20
50 – 59 tuổi 49 32,45
60 – 69 tuổi 42 27,81
Trên 70 tuổi 31 20,54
Dưới 30 tuổi 0 0,00
Giới tính Nam 88 58,30
Nữ 63 41,70
Giai đoạn phát hiện Giai đoạn I 18 11,92
Giai đoạn II 77 50,99
Giai đoạn III 54 35,76
Giai đoạn IV 2 1,33
Tình trạng di căn Đã di căn 57 38,00
Chưa di căn 93 62,00

Ghi chú: Tỷ lệ phát hiện bệnh khi đã di căn trong nghiên cứu (38%) thấp hơn so với số liệu thống kê tại Hoa Kỳ do Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ công bố (58%). Tỷ lệ nam giới mắc bệnh cao gấp 1,39 lần nữ giới. Đa số bệnh nhân phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn II và III chiếm tổng cộng 86,75%).

2. Kết quả tách chiết và tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ mô FFPE

So sánh 4 phương pháp tách chiết ban đầu (mỗi phương pháp thực hiện trên 8 mẫu, 25 mg/mẫu):

Đặc tính so sánh Bộ kit FavorPrep Phương pháp A Phương pháp B Phương pháp C
Cơ chế phá vỡ màng/mô FATG1 buffer + Proteinase K Đệm kiềm alkali (100°C) SDS 10% + Proteinase K NaOH 2N (37°C)
Phương pháp tinh sạch Cột silica Phenol/Chloroform/IAA Chloroform/IAA (CIAA) Phenol/Chloroform/IAA
Thời gian thực hiện 3 giờ 30 phút 5 giờ 50 phút 16 giờ 00 15 giờ 00
Chi phí ước tính/mẫu ~50.000 VNĐ < 50.000 VNĐ < 50.000 VNĐ < 50.000 VNĐ
Tỷ lệ nhiễm tạp chất/phenol 16,27% 50,00% 40,47% 50,00%
Hình ảnh điện di gel Vệt smear rõ (250–500 bp) Không có vạch/smear Vệt smear rõ (250–500 bp) Không có vạch/smear

Kết quả đo độ quang phổ cho thấy phương pháp A và C cho nồng độ DNA cao trên lý thuyết nhưng không hiện băng khi điện di. Ngược lại, phương pháp B và bộ kit FavorPrep cho kết quả điện di rõ ràng với dải phân mảnh tập trung ở kích thước 250 – 500 bp (phù hợp với đặc điểm đứt gãy của mẫu mô ngâm formaldehyde lâu ngày). Tất cả 4 phương pháp đều có tỷ số OD260/280 và OD260/230 phần lớn dưới 1,6 do ảnh hưởng của liên kết chéo protein và hóa chất cố định mô.

Tối ưu hóa phương pháp B: Tác giả cải tiến phương pháp B bằng cách tăng lượng mô từ 25 mg lên 125 mg, băm nhỏ mẫu trước khi rửa nhằm loại bỏ triệt để formaldehyde dư thừa và rút ngắn thời gian phân hủy mô, đồng thời giảm tốc độ ly tâm từ 13.000 vòng/phút. Kết quả điện di cho thấy nồng độ DNA tăng từ 150 ng/µl (chưa tối ưu) lên 936 ng/µl (sau tối ưu).

Tách chiết số lượng lớn trên mẫu bệnh phẩm:

  • Phương pháp B tối ưu (n = 84 mẫu, 125 mg): Có 34,52% mẫu đạt nồng độ > 1000 ng/µl; 20,24% mẫu từ 500 – 1000 ng/µl; 34,52% mẫu từ 100 – 500 ng/µl; 10,72% mẫu < 100 ng/µl. Tỷ số OD260/280 dưới 1,6 chiếm 92,86%.
  • Phương pháp sử dụng bộ kit FavorPrep (n = 43 mẫu, 25 mg): 90,69% mẫu có nồng độ < 100 ng/µl; 9,31% mẫu đạt 100 – 500 ng/µl. Tỷ số OD260/280 dưới 1,6 chiếm 69,77%. Khối lượng mẫu tăng làm tăng nồng độ DNA thu hồi nhưng không làm thay đổi tỷ số OD260/280 và OD260/230.

3. Kết quả thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa gene SEPT9 bằng phương pháp in silico

  • Gene SEPT9 nằm trên nhiễm sắc thể số 17 ở người, tọa độ từ 77.280.569 bp đến 77.500.596 bp, chiều dài 220.027 bp.
  • Trình tự vùng promoter của gene SEPT9 được xác định: ggcgggggcgcagcgcgcggggaggggccggcgcccgccttcctcccccattcattcagc
  • Phần mềm MethPrimer xác định các đảo CpG và thiết kế được 2 cặp mồi MSP đặc hiệu:
    • Cặp mồi 1:
      • Mồi xuôi (Left M Primer): 5'-GATTTTGTTAGGGGTATTCGC-3'
      • Mồi ngược (Right M Primer): 5'-ATTTCCCAAAATAAAACTATACGTC-3'
    • Cặp mồi 2:
      • Mồi xuôi (Left M Primer): 5'-GATTTTGTTAGGGGTATTTGTGT-3'
      • Mồi ngược (Right M Primer): 5'-ATTTCCCAAAATAAAACTATACATC-3'

4. Đánh giá chất lượng DNA trước chuyển đổi bisulfite qua PCR gene FAT1

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene nội chứng FAT1 (kích thước 695 bp) được thực hiện trên mẫu DNA 50216 L (mô FFPE, nồng độ gốc 514,8 ng/µl) ở các độ pha loãng 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000. Mẫu đối chứng dương RBCL từ lá dong riềng đỏ xuất hiện băng khuếch đại rõ nét (chứng minh hệ thống hóa chất, enzyme Taq và chu trình nhiệt hoạt động chuẩn xác). Tuy nhiên, các đường chạy khuếch đại gene FAT1 trên mẫu DNA mô FFPE ở tất cả các nồng độ đều không cho sản phẩm PCR. Nguyên nhân được xác định do DNA tách chiết từ mô FFPE ngâm lâu ngày bị phân mảnh thành các đoạn ngắn (250 – 500 bp), không đủ độ nguyên vẹn để khuếch đại đoạn gene mục tiêu dài 695 bp.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Xác lập bức tranh dịch tễ học lâm sàng trên 151 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam: bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên chiếm 80,80% (tập trung cao nhất ở nhóm 50–59 tuổi với 32,45%), tỷ lệ nam/nữ là 1,39:1, tỷ lệ phát hiện ở giai đoạn II–III là 86,75% và tỷ lệ di căn là 38,00%.
  • Tối ưu hóa thành công quy trình tách chiết DNA từ mô cố định formaldehyde quy mô phòng thí nghiệm (Phương pháp B cải tiến: Lysis buffer + Proteinase K + CIAA), nâng nồng độ DNA thu hồi lên mức 936 ng/µl, cung cấp giải pháp thay thế hiệu quả và tiết kiệm chi phí so với bộ kit thương mại FavorPrep.
  • Thiết kế thành công 2 cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP primers) cho vùng promoter giàu đảo CpG của gene SEPT9 bằng các công cụ tin sinh học.
  • Xác định được giới hạn kỹ thuật của DNA tách từ mô FFPE: DNA bị đứt gãy mạnh dưới 500 bp, đòi hỏi các thiết kế mồi cho phản ứng PCR sau chuyển hóa bisulfite phải hướng đến các phân đoạn khuếch đại có kích thước ngắn.

Giải pháp và đóng góp

  • Giải pháp kỹ thuật: Đưa ra quy trình xử lý và tách chiết DNA mô FFPE chi phí thấp (< 50.000 VNĐ/mẫu) phù hợp với điều kiện trang thiết bị của các phòng thí nghiệm trong nước.
  • Đóng góp khoa học: Đặt nền móng kỹ thuật và dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu dịch tễ học phân tử và phân tích methyl hóa gene chỉ thị SEPT9 trên quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Mẫu mô bảo quản bằng phương pháp cố định formaldehyde trong thời gian dài khiến DNA bị phân mảnh nghiêm trọng và còn tồn dư tạp chất (chỉ số OD260/280 và OD260/230 phần lớn dưới 1,6), gây ức chế phản ứng khuếch đại enzyme polymerase với các đoạn trình tự dài (như gene FAT1 695 bp).
  • Nghiên cứu dừng lại ở bước tách chiết, tối ưu quy trình, xử lý bisulfite và thiết kế mồi in silico; chưa tiến hành phản ứng MSP thực nghiệm trực tiếp trên toàn bộ các mẫu bệnh phẩm để đưa ra tỷ lệ methyl hóa SEPT9 cụ thể trên khối u lâm sàng.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tối ưu hóa các cặp mồi kiểm tra chất lượng nội chứng có kích thước phân đoạn khuếch đại ngắn hơn (< 250 bp) phù hợp với đặc điểm phân mảnh của DNA từ mô FFPE.
  • Ứng dụng hai cặp mồi MSP đã thiết kế để tiến hành phản ứng PCR khuếch đại trên tập hợp mẫu DNA khối u và mô lành sau khi xử lý bisulfite.
  • Mở rộng nghiên cứu đánh giá mức độ methyl hóa gene SEPT9 trên mẫu huyết tương (ctDNA) để hướng tới phát triển quy trình chẩn đoán không xâm lấn.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học y học, Ung thư học và Kỹ thuật xét nghiệm y sinh.
  • Nội dung giá trị:
    • Quy trình thực nghiệm so sánh và tối ưu hóa tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde (FFPE) xử lý các mẫu bệnh phẩm lưu trữ lâu năm.
    • Phương pháp luận ứng dụng tin sinh học (in silico) kết hợp các cơ sở dữ liệu GeneCards, Ensembl, EPD và phần mềm MethPrimer trong thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.
    • Số liệu thực tế về đặc điểm lâm sàng của 151 bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện K Trung ương.

Câu hỏi thường gặp

1. Phân bố độ tuổi và giai đoạn bệnh của 151 bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện K Trung ương có đặc điểm gì?

Dữ liệu lâm sàng cho thấy không có bệnh nhân nào dưới 30 tuổi; nhóm tuổi 50 – 59 chiếm tỷ lệ cao nhất (32,45%), tiếp theo là nhóm 60 – 69 tuổi (27,81%), trên 70 tuổi (20,54%) và nhóm 30 – 50 tuổi chiếm 19,20%. Hầu hết bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn tiến triển: giai đoạn II chiếm 50,99% (77 bệnh nhân), giai đoạn III chiếm 35,76% (54 bệnh nhân), giai đoạn I chỉ chiếm 11,92% (18 bệnh nhân) và giai đoạn IV chiếm 1,33% (2 bệnh nhân). Tỷ lệ phát hiện bệnh khi đã di căn là 38,00%.

2. Vì sao phương pháp B (dựa trên Campos và Gilbert) được chọn để tối ưu thay vì phương pháp A hay C?

Qua khảo sát 4 phương pháp trên 8 mẫu mô ban đầu, phương pháp A (đệm kiềm alkali) và phương pháp C (NaOH 2N) tuy đo nồng độ quang phổ cao nhưng khi điện di không xuất hiện băng hay vệt DNA, đồng thời tỷ lệ nhiễm tạp chất/phenol lên tới 50%. Trong khi đó, phương pháp B (Lysis buffer SDS 10% kết hợp Proteinase K và CIAA) cho hình ảnh điện di vệt smear rõ ràng (tương đương bộ kit chuẩn), tỷ lệ nhiễm tạp chất thấp hơn (40,47%) và chi phí thấp (< 50.000 VNĐ/mẫu), do đó được chọn làm cơ sở để tối ưu hóa.

3. Quy trình tách chiết theo phương pháp B đã được tối ưu hóa như thế nào và đem lại hiệu quả gì?

Quy trình được tối ưu hóa qua ba điểm: (1) tăng lượng mẫu mô từ 25 mg lên 125 mg; (2) băm nhỏ mẫu trước khi rửa bằng GTE và cồn bậc hạ dần nhằm loại bỏ formaldehyde triệt để và tăng diện tích tiếp xúc với đệm ly giải; (3) giảm tốc độ ly tâm từ 13.000 vòng/phút. Kết quả sau tối ưu giúp nâng nồng độ DNA tách chiết từ 150 ng/µl lên 936 ng/µl, khi triển khai trên 84 mẫu có tới 34,52% mẫu đạt nồng độ trên 1000 ng/µl.

4. Hai cặp mồi MSP thiết kế cho gene SEPT9 có trình tự như thế nào?

Dựa trên phân tích vùng promoter ggcgggggcgcagcgcgcggggaggggccggcgcccgccttcctcccccattcattcagc qua phần mềm MethPrimer, 2 cặp mồi đặc hiệu methyl hóa được thiết kế gồm:

  • Cặp 1: Left M: 5'-GATTTTGTTAGGGGTATTCGC-3' và Right M: 5'-ATTTCCCAAAATAAAACTATACGTC-3'.
  • Cặp 2: Left M: 5'-GATTTTGTTAGGGGTATTTGTGT-3' và Right M: 5'-ATTTCCCAAAATAAAACTATACATC-3'.

5. Nguyên nhân nào khiến phản ứng PCR khuếch đại gene nội chứng FAT1 không thành công trên mẫu DNA mô FFPE?

Phản ứng PCR gene nội chứng FAT1 không xuất hiện sản phẩm dù đối chứng dương RBCL lên băng rõ là do DNA tách chiết từ mô cố định formaldehyde bị đứt gãy và phân mảnh mạnh, cường độ sáng tập trung ở kích thước ngắn từ 250 – 500 bp. Do đó, khuôn mẫu DNA không đủ độ dài và tính nguyên vẹn để enzyme polymerase khuếch đại đoạn gene mục tiêu có kích thước lên đến 695 bp.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Hoài Nam đã thực hiện khảo sát dịch tễ lâm sàng trên 151 mẫu bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện K Trung ương, phản ánh thực trạng phát hiện bệnh chủ yếu ở độ tuổi trên 50 và giai đoạn muộn (giai đoạn II và III chiếm 86,75%). Nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công quy trình tách chiết DNA từ mô bảo quản formaldehyde bằng hệ đệm Lysis buffer kết hợp Proteinase K và CIAA, mang lại nồng độ DNA cao với chi phí thấp. Đồng thời, tác giả đã thiết kế thành công 2 cặp mồi MSP đặc hiệu cho vùng promoter gene SEPT9 và xác định được đặc tính phân mảnh của DNA mô FFPE làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu chuyển hóa bisulfite và chẩn đoán phân tử tiếp theo.