Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chuyển hóa sinh học và thu nhận γ decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men yarrowia lipolytica

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chuyển hóa sinh học và thu nhận γ decalactone từ dầu thầu dầu, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Xuân Việt
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Hoài Trâm
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nấm men Yarrowia lipolytica
• 1.2. Đặc điểm hình thái, di truyền
• 1.3. Đặc điểm sinh lý học
• 1.3.1. Về nguồn cacbon
• 1.3.2. Nhu cầu oxy
• 1.4. Chất thơm từ lipit
• 1.4.1. Vài nét về các chất thơm dùng trong công nghiệp thực phẩm
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu
• 2.2. Vi sinh vật
• 2.3. Môi trường
• 2.4. Phương pháp
• 2.4.1. Nhân giống và lên men trên máy lắc
• 2.4.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5L
• 2.4.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5L
• 2.4.4. Lên men theo mẻ trên nồi 50L
• 2.4.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50L
• 2.4.6. Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
• 2.4.7. Lactone hóa dịch sau lên men
• 2.4.8. Chưng cất dịch lên men đã được lactone hóa. Tách chiết γ-decalactone bằng dung môi
• 2.4.9. Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết
• 2.4.10. Làm sạch dịch chiết cô đặc
• 2.4.11. Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kiềm
• 2.4.12. Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na2SO4 khan
• 2.4.13. Đánh giá cảm quan
• 2.4.14. Phân tích định lượng γ-decalactone bằng sắc ký khí
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc
• 3.2. Lựa chọn tốc độ lắc
• 3.3. Lựa chọn pH môi trường lên men
• 3.4. Lựa chọn thời gian nhân giống
• 3.5. Lựa chọn tỷ lệ cấy giống
• 3.6. Lựa chọn thời gian lên men
• 3.7. Ứng dụng phương pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed-culture)
• 3.8. Nghiên cứu các phương thức lên men ở quy mô 5L và 50L
• 3.8.1. Lên men ở quy mô 5L
• 3.8.2. Lên men ở quy mô pilot trên nồi dung tích 50 lít
• 3.8.3. So sánh tóm tắt các phương thức lên men ở quy mô 5L và 50L
• 3.9. Lựa chọn điều kiện chiết rút và thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men
• 3.9.1. Lựa chọn điều kiện chiết rút γ-decalactone
• 3.9.2. Lựa chọn điều kiện thu nhận và làm sạch γ-decalactone từ dịch lên men
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thu nhận γ decalactone từ dầu thầu dầu

Nghiên cứu thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. γ-decalactone là một hợp chất có giá trị cao trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Việc sử dụng dầu thầu dầu, một nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền, để sản xuất γ-decalactone không chỉ giúp giảm chi phí mà còn tận dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm mà còn góp phần vào việc phát triển công nghệ sinh học trong sản xuất hợp chất tự nhiên.

1.1. Đặc điểm của γ decalactone và ứng dụng trong công nghiệp

γ-decalactone là một lactone có hương thơm đặc trưng, thường được sử dụng trong sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm. Hợp chất này có khả năng tạo hương vị và mùi thơm tự nhiên, làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy γ-decalactone có thể được chiết xuất từ dầu thầu dầu thông qua quá trình chuyển hóa sinh học, mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm.

1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ decalactone hiện nay

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sản xuất γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica là khả thi. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng nấm men này có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic thành γ-decalactone thông qua quá trình sinh học. Tuy nhiên, việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và quy trình sản xuất vẫn còn nhiều thách thức.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu thu nhận γ decalactone

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu vẫn gặp phải một số thách thức. Một trong những vấn đề chính là hiệu suất chuyển hóa thấp của nấm men Yarrowia lipolytica trong điều kiện nuôi cấy khác nhau. Ngoài ra, việc tối ưu hóa các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ oxy cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản xuất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa

Nghiên cứu cho thấy rằng pH, nhiệt độ và nồng độ oxy trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển hóa axit ricinoleic thành γ-decalactone. Việc điều chỉnh các yếu tố này có thể giúp tăng cường khả năng chuyển hóa của nấm men, từ đó nâng cao sản lượng γ-decalactone.

2.2. Thách thức trong quy trình chiết xuất và làm sạch γ decalactone

Quy trình chiết xuất và làm sạch γ-decalactone từ dịch lên men cũng gặp nhiều khó khăn. Việc lựa chọn dung môi và phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu suất thu hồi của sản phẩm cuối cùng.

III. Phương pháp nghiên cứu thu nhận γ decalactone hiệu quả

Để thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu, nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau. Một trong những phương pháp chính là sử dụng nấm men Yarrowia lipolytica trong điều kiện nuôi cấy tối ưu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng phương pháp lên men liên tục có thể giúp tăng cường hiệu suất sản xuất γ-decalactone.

3.1. Quy trình nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica

Quy trình nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica bao gồm các bước như chuẩn bị môi trường nuôi cấy, cấy giống và theo dõi các yếu tố môi trường. Việc tối ưu hóa các điều kiện này sẽ giúp nâng cao khả năng chuyển hóa axit ricinoleic thành γ-decalactone.

3.2. Phương pháp chiết xuất γ decalactone từ dịch lên men

Phương pháp chiết xuất γ-decalactone từ dịch lên men có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau, bao gồm chiết xuất bằng dung môi và chưng cất. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của γ decalactone

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica là khả thi và có thể đạt được hiệu suất cao. Các ứng dụng thực tiễn của γ-decalactone trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm đang mở ra nhiều cơ hội mới cho việc phát triển sản phẩm.

4.1. Hiệu suất thu nhận γ decalactone trong nghiên cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hiệu suất thu nhận γ-decalactone có thể đạt tới 80% trong điều kiện tối ưu. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của dầu thầu dầu như một nguồn nguyên liệu cho sản xuất hợp chất này.

4.2. Ứng dụng của γ decalactone trong ngành công nghiệp

γ-decalactone được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Hợp chất này không chỉ tạo hương vị tự nhiên mà còn có khả năng cải thiện chất lượng sản phẩm, từ đó nâng cao giá trị thương mại.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và chiết xuất sẽ giúp nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành công nghiệp và môi trường.

5.1. Triển vọng phát triển công nghệ sinh học trong sản xuất γ decalactone

Công nghệ sinh học đang ngày càng phát triển, mở ra nhiều cơ hội mới cho việc sản xuất γ-decalactone từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Việc áp dụng các công nghệ mới sẽ giúp nâng cao hiệu suất và giảm chi phí sản xuất.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và chiết xuất γ-decalactone. Ngoài ra, việc nghiên cứu các chủng nấm men khác có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic cũng là một hướng đi tiềm năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Con người biết đến chất thơm và sử dụng chúng từ hàng nghìn năm nay. Nó làm tăng chất lượng của nhiều sản phẩm, đặc biệt là thực phẩm. Khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và phong phú về cả số lượng lẫn chất lượng. Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu rất lớn về các chất phụ gia tạo hương.

Hương tạo nên giá trị cảm quan và hương vi đặc trưng cho thực phẩm. Trong quá trình chế biến thực phẩm, cấu tử hương trong nguyên liệu ban đầu sẽ dần mất đi, điều đó bắt buộc các nhà công nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia tạo hương. Mặt khác, trong các sản phẩm thực phẩm pha chế (nước ngọt, rượu mùi, sữa chua .) luôn cần sự có mặt của các chất tạo hương. Ngoài công nghiệp thực phẩm ra, những ngành khác cũng có nhu cầu sử dụng các chất phụ gia tạo hương, đó là: công nghiệp mỹ phẩm, chất phụ gia để sản xuất nước hoa, phấn son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm các chất tạo hương vào thuốc, đặc biệt là các loại thuốc cho trẻ em để làm át đi hương vị khó chịu của thuốc và làm cho thuốc dễ uống hơn; việc sản xuất các hàng tiêu dùng như kem đánh răng, xà phòng thơm, nước gội đầu, vv.

cũng cần bổ xung chất phụ gia tạo hương. Trong số các cấu tử tạo hương như este, andehyde, lactone, alcohol. thì lactone là hợp chất khá phổ biến và là cấu tử hương thơm chính trong một số loại hoa quả, thảo mộc như đào, mận, dừa, dâu tây. Trong các lactone thì γ-decalactone (C10H18O2) là có giá trị nhất, được nghiên cứu nhiều nhất.

Chất này tồn tại trong tự nhiên ở mức độ vi lượng, song là thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều loại quả. γ- decalacton có thể được tổng hợp bằng con đường sinh tổng hợp từ dầu thực vật nhờ quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), là một loại nguyên liệu phù hợp cho quá trình tổng hợp γ-decalactone. Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu sẽ tạo ra axit ricinoleic, đây là “cơ chất” để một số nấm men chuyển hóa thành chất thơm, nhờ quá trình β-oxi hóa.

Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Một số nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeasts) như Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp. có khả năng sử dụng, chuyển hóa axít béo và các hợp chất kị nước. Trong số đó nấm men Yarrowia lipolytica là loài được nghiên cứu nhiều nhất. Vấn đề nâng cao sự chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất.

Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta sẵn có, rẻ tiền nhưng việc sử dụng nó cho việc nghiên cứu sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì những lẽ trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica”. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Mục tiêu của đề tài Chứng minh dầu thầu dầu Việt Nam như một nguyên liệu tiềm năng trong việc sản xuất chất thơm –decalactone nhờ nấm men, cũng như nấm men Yarrowia lipolytica VTP5 như một chủng tiềm năng cho việc sản xuất này. Nội dung nghiên cứu 1.

Lựa chọn điều kiện thích hợp để lên men chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành chất thơm –decalactone bằng nấm men Yarrowia lipolytica VTP5, quy mô trên máy lắc. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình lên men đó trong các nồi lên men dung tích 5L và 50L. Tìm các điều kiện tách chiết và thu nhận chất thơm –decalactone từ dịch lên men. Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt CHƢƠNG I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm men Yarrowia lipolytica Nấm men Yarrowia lipolytica thuộc về nhóm các loài nấm men có khả năng chuyển hóa chất béo, hay còn gọi là nấm men ưa béo (oleaginous yeasts). Trong đó còn có các loài khác như Rhodotorula sp. Chúng có khả năng chuyển hóa chất béo, dầu và các hợp chất hydrocacbon kị nước [11].

Yarrowia là chi nấm men duy nhất thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), chi này cũng chỉ có một loài. Nấm men này được phân lập lần đầu tiên từ bơ thực vật ở Hà Lan năm 1928, lúc đầu có tên gọi là Torula lipolytica, sau đó được đổi thành Candida lipolytica và đến nay là Yarrowia lipolytica. Nó thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, có khả tạo rất nhiều sản phẩm khác nhau, và đã được đánh giá là nhóm nấm men không có khả năng gây bệnh. Nhiều quy trình sản xuất cơ bản nhờ nấm men này được cấp phép ứng dụng bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA).

Hơn nữa, Yarrowia lipolytica cũng được sử dụng làm công cụ trong các nghiên cứu về sự bài tiết protein, sự hình thành của peroxisome, về tính lưỡng hình của nấm men, về sự phân hủy các hợp chất kỵ nước, cũng như trong nhiều các lĩnh vực khác [16][18]. Đặc điểm hình thái, di truyền Yarrowia lipolytica là loại nấm men lưỡng hình chuyển hóa chất béo, thường được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau, từ môi trường tự nhiên như nước thải của nhà máy ép dầu, xưởng sản xuất thực phẩm có dầu, hay từ môi trường ô nhiễm dầu. Hầu hết các tế bào phân lập được ở trạng thái đơn bội, nhưng một số ít ở trạng thái lưỡng bội để hình thành bào tử túi chứa bốn bào tử. Các tế bào có thể biệt hóa thành dạng đơn bào, dạng hệ sợi giả, hay dạng sợi, tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng.

Bộ gen trong nhân của Y. lipolytica có sáu nhiễm sắc thể, với kích thước khoảng 20Mb. Nhiều trong số các gen xuất hiện tương tự như gen của nấm sợi hơn là của nấm men truyền thống Saccharomyces cerevisiae. Việc giải mã trình tự bộ gen của Y.

lipolytica gần đây đã cho biết nhiều thông tin quan trọng về tích lũy và Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt phân giải lipit, về sự tương tác của cơ chất kỵ nước với các tế bào nấm men, sự hấp phụ và vận chuyển của chúng, các quá trình oxy hóa các cơ chất này và các enzyme khác nhau tham gia vào những quá trình đó. Một số enzyme liên quan đến sử dụng cơ chất kỵ nước thuộc các loại multigene (đa gen). Ví dụ: lipases/esterase (LIP genes), cytochromes P450 (ALK genes) và peroxisomal acyl-CoA oxidases (POX genes) được mã hóa bởi một họ 5 gen có tên POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, những gen này mã hóa tổng hợp năm enzyme acyl-coenzyme A oxidases (Aox) là Aox1, Aox2, Aox3, Aox4, Aox5. Các enzyme ở thể peroxi có vai trò quan trọng trong sản xuất - decalactone từ methyl ricinoleate, một phần chuỗi ngắn riêng Aox (Aox3) có liên quan đến quá trình tái tiêu thụ - decalactone.

Khi những gen này bị đột biến, tế bào không chết nhưng sự phân giải, sử dụng các cơ chất kỵ nước của Yarrowia lipolytica bị ức chế [21][25][27]. Đặc điểm sinh lý học Về nguồn cacbon Ngoài việc sử dụng các cơ chất thông thường như các đường hexose, pentose, thì Yarrowia lipolytica còn có thể sử dụng hiệu quả các cơ chất kỵ nước như ankan, hydrocacbon thơm, chất béo… Việc sử dụng các cơ chất đặc biệt này có liên quan đến cơ chế bám dính của cơ chất kỵ nước vào màng tế bào và cơ chế vận chuyển các chất qua màng tế bào bằng các chất mang. Khi đó, những giọt nhỏ cơ chất kỵ nước bám dính lên bề mặt tế bào (hình 1.1), tế bào tự thay đổi bề mặt như tạo bề mặt gồ gề lồi lõm, và giảm độ dày thành tế bào. Sau đó chúng được vận chuyển chủ động thông qua các kênh vận chuyển điện tử dày đặc trên màng tế bào [16].

Dưới đây (hình 1.1) là ảnh hiển vi của tế bào Yarrowia lipolytica trong môi trường methy ricinoleate, minh họa cho hiện tượng vừa trình bày. Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng trong môi trường chứa methy ricinoleate [16]. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, nếu là chất béo, trước hết chúng sẽ chịu tác động của enzyme lipotic (lipase) để bị thủy phân thành glycerol và axít béo; tiếp đó các cơ chất kỵ nước này sẽ được hydroxy hóa nhờ hệ ezyme có tên là cytochrome P450 monoxidase khu trú trong lưới nội chất, rồi tiếp tục chịu tác động của hệ enzyme oxidase chuyển thành andehyde béo; tiếp đó là quá trình oxi hóa andehyde béo được xúc tác bởi aldehyde dehydrogenase [10]. Ngoài nguồn cacbon kể trên, Yarrowia lipolytica cũng có thể sử dụng ancol (ankan, glycerin…), axit hữu cơ (axit axetic, axit xitric, axit succinic…) hay các muối của các axit hữu cơ đó như những nguồn cacbon duy nhất để sinh trưởng, và chuyển hóa các chất theo những hướng khác nhau [16].

Nhu cầu oxy Nấm men Yarrowia lipolytica sống hiếu khí bắt buộc, sự sinh trưởng và trao đổi chất của nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, đặc biệt là lượng oxy trong môi trường nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, nhu cầu oxy cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men này phụ thuộc vào nồng độ ion sắt có trong môi trường [12]. Ngoài việc khuấy lắc, có nhiều phương pháp được áp dụng nhằm tăng hàm lượng Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt oxy trong môi trường nuôi cấy như sục khí nén, đặc biệt là bổ sung chất mang perfluorocarbons (PFC) đã hòa tan oxy vào bình lên men trong giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy khi mà lượng oxy ban đầu đã được sử dụng đáng kể. Theo các nghiên cứu, khi tăng nồng độ oxy trong môi trường lên men từ 10 đến 20% thì sản lượng chất đã chuyển hóa tăng rõ rệt (từ 10-80%); việc tăng nồng độ oxy lên trên 20% không làm tăng thêm lượng sản phẩm [12].

Chất thơm từ lipit 1.