CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá 1. Phân loại học Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana.sp thuộc ngành hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotyledones, chi Nicotiana. Trong chi Nicotiana có 50 – 70 loài, đa số dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là dạng dại phụ.
Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta chia thành 4 loại chính [13]: - Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tươi. Đây là loại phổ biến nhất, chiếm 90% diện tích trồng thuốc lá trên thế giới [13]. - Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích thuốc lá trên thế giới [13]. - Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím, thường chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dự trữ gen cho lai tạo, ít được dùng trong sản xuất [13].
- Loài Nicotiana polideiede L.: có hoa màu trắng. Loài này cũng ít được dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số quốc gia [13]. Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị kinh tế vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng nhờ khả năng dễ dàng tiến hành nuôi cấy mô và tiến hành chuyển gen. Vì vậy, thuốc lá là một trong những đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là đối tượng chuyển gen.
Các đặc điểm thực vật học của cây thuốc lá 1. Rễ Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát mặt đất. Rễ trụ được hình thành từ phôi rễ.
Rễ nhánh được phát sinh từ trục của rễ cái, thường có độ xiên 30 – 40o. Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và chất dinh dưỡng cho cây. Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 – 30cm, phát triển theo các hướng.
Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá [13]. Thân Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân cứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể đạt từ 1 – 3m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá. Đường kính thân đạt 2 -4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách.
Có hai loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ [13]. Lá Thể thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay đổi tùy giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu: hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác.
Độ dày, màu sắc lá thay đổi. Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá bắt đầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc lá quyết định độ dày, mỏng, độ đàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có nhiều tuyến lông đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau.
Các tuyến này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích lũy nhiều khi lá chín kỹ thuật. Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ [13]. Hoa Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn, được hình thành do sự phân hóa của đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa [14].
Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối, còn lại có thể do thụ phấn chéo do gió, côn trùng,. Quả và hạt Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100- 150 quả trên mỗi chùm hoa có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa. Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là khoảng 0,07 – 0,1gam.
Trong mỗi gam hạt có từ 10. Giới thiệu về gen CBF1 Đặc điểm: Gen CBF1 hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa DRE/CRT và gây ra sự biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả năng chịu lạnh của cây trồng. Nó mã hóa một thành viên của phân họ DREB A-1 của họ hệ số phiên mã ERF/AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền AP2.
Có bốn thành viên của họ CBF, đáp ứng với stress phi sinh học của cây. Ba gen đầu tiên là CBF1 CBF2 và CBF3, rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi có khô hạn xảy ra. Gen CBF1 này liên quan đến phản ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [48]. Các nghiên cứu về gene CBF1: Để khai thác tốt chức năng khác nhau giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây trồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây hoang dại Commerson, nhóm nghiên cứu của Jian Li thuộc Đại học Nông 6 nghiệp Sơn Đông đã cho thể hiện thành công hai gen này trong cây Arabidopsis với hai dòng khác nhau.
Tất cả cây chuyển gen ấy đều thể hiện kiểu hình lùn, trổ bông muộn, lá dầy hơn và điểm những chấm hồng. Tuy nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 thể hiện sự chống chịu đáng kể đối với lạnh giá và khô hạn hơn dòng chuyển gen StCBF1. Mức độ thể hiện của nhiều gen liên quan đến chịu lạnh và phát triển, bao gồm các gen ức chế cây tăng trưởng và trổ bông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các cây chuyển gen. Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng của cây đối với stress phi sinh học, tăng trưởng và phát triển.
Tuy nhiên, ScCBF1 có chức năng rõ hơn StCBF1 [40]. + Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc trường đại học khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc Kinh, Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu: “Hoạt động đặc biệt của gen CBF1 cây dương trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp”. Các yếu tố liên kết C-repeat (CBFs), cũng được gọi là thành viên nhóm protein yếu tố phản ứng mất nước (DREB1), đóng vai trò quan trọng trong việc thu nhận khả năng chịu stress, nhưng trong cây, các cơ chế cơ bản của khả năng chịu stress vẫn còn khó nắm bắt. Để hiểu rõ hơn về các cơ chế này, nhóm nghiên cứu đã phân lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây dương (Populus spp).
Và đánh giá biểu hiện của chúng trong điều kiện hạn hán, lạnh, nhiệt và muối. Biểu hiện trên toàn phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý một mối tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính và việc thu nhận khả năng chịu lạnh. Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu ứng suất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối với sự phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây dương. Sau đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng chiến lược tìm kiếm toàn bộ bộ gen trong Populus trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả 7 định; các gen được xác định tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh học.
Hầu như tất cả các gen mục tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động cis mà trung gian phản ứng với các tín hiệu môi trường và nội sinh khác nhau, phù hợp với vai trò quan trọng của CBF1 trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp. Cuối cùng, phân tích 528 cá thể của Populus simonii đã xác định sáu đa hình đơn nucleotide (tỷ lệ phát hiện sai Q <0,10) đáng kể (P <0,005) kết hợp với sản xuất malondialdehyde và rò điện phân, cho thấy tầm quan trọng tiềm năng của PsCBF1 trong quy định một số chức năng liên quan đến màng tế bào. Phát hiện của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu biết mới về chức năng của PsCBF1 và làm sáng tỏ mạng lưới quy định trung gian CBF trong cây dương [28]. + Nghiên cứu: “Biểu hiện cảm ứng ectopic của At-CBF1 trong cà chua chuyển gen không có marker làm tăng khả năng chịu lạnh “Trong một nỗ lực để cải thiện khả năng chịu đựng lạnh của stress, một gen yếu tố liên kết C-lặp lại Arabidopsis C (At-CBF1) được thúc đẩy bởi promoter cảm ứng RD29A được đồng chuyển vào cà chua var.
Marker (NPTII) - chuyển gen miễn phí thu được trong thế hệ T (1) vì sự tích hợp không liên kết của các gen CBF1 và NPTII. Phản ứng chuỗi sao chép ngược polymerase đã khẳng định sự biểu hiện của CBF1 trong các dòng chuyển gen T (1). Nghiên cứu mô hình biểu hiện trong T (1) dòng biến đổi gen cho thấy sự gia tăng dần dần với thời gian làm lạnh kéo dài và cũng khẳng định sự đảo ngược của biểu hiện về loại bỏ stress. Cây chuyển gen không có sự khác biệt về hình thái và nông học so với cây không biến đổi.
Khi cây chuyển gen non bị phơi nhiễm với stress lạnh (4°C) trong 3 ngày, tăng tỷ lệ sống (50%) ở các dòng chuyển gen so với cây không biến đổi (10%). Cây chuyển gen chịu áp lực làm lạnh cho thấy sự giảm đáng kể chỉ số tổn thương màng và peroxid hóa lipid và cũng làm tăng hàm lượng proline tự do đáng kể trong các mô lá so với cây không biến đổi. Vì 8 vậy, những phát hiện này chỉ ra rằng cây cà chua chuyển gen không có marker không biểu hiện gen Arabidopsis CBF1 cung cấp khả năng bảo vệ và có khả năng chịu lạnh đối với cà chua biến đổi gen mà không có bất kỳ biến đổi kiểu hình nào [40]. Tính chống chịu của thực vật 1.Tính chịu hạn Hạn đối với thực vật là khái niệm đựợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển. Hạn là một trong nhiều yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và năng suất cây trồng. Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau.