Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Của Loài Dứa Dại (Pandanus tonkinensis)

Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa, sở hữu hệ thực vật phong phú, trong đó cây thuốc chiếm vị trí quan trọng. 128 trang · Đại học Quốc gia Hà Nội · 2023.

• Tác giả: Đinh Thị Huyền Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Hồng Anh
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Tích Thành Phần Hóa Học Từ Loài Dứa Dại (Pandanus tonkinensis)
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặc điểm hình thái chung của chi Pandanus
• 1.2. Chi Pandanus ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố các loài
• 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ quả và rễ loài Pandanus tonkinensis
• 3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
• 3.3. Chất đánh dấu (marker)
• 3.4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hợp chất pinorecinol 4’-O-β-D-glucopyranoside và chất vladinol F trong loài dứa dại Pandanus tonkinensis
• 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 5. CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Dứa Dại Pandanus tonkinensis và Nghiên Cứu

Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa, sở hữu hệ thực vật phong phú, trong đó cây thuốc chiếm vị trí quan trọng. Nghiên cứu về cây thuốc bản địa mang lại những đóng góp lớn cho sức khỏe cộng đồng. Ưu điểm của thuốc từ thực vật là ít tác dụng phụ so với thuốc tổng hợp. Trong bối cảnh bệnh tật gia tăng, nghiên cứu các loài thực vật làm thuốc trở nên cấp thiết. Dứa dại (Pandanus tonkinensis) là một trong số đó, thuộc họ Pandanaceae, phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới. Chi Pandanus có khoảng 600 loài, nhiều loài có giá trị làm thuốc và thực phẩm. Ở Việt Nam, có 23 loài Pandanaceae, trong đó Pandanus tonkinensis được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh về thận, gan và các bệnh ngoài da. Các bài thuốc từ Pandanus tonkinensis được ghi nhận trong kinh nghiệm dân gian, nhưng cần có nghiên cứu khoa học để chứng minh.

1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Pandanus

Pandanus thuộc họ Pandanaceae, bộ Pandanales, lớp Liliopsida, ngành Magnoliophyta, giới Plantae. Pandanus có đặc điểm hình thái là cây gỗ, cây bụi, thân có rễ chống trên không, lá mọc soắn ốc, phiến lá dài hẹp, mép lá có gai. Cây đơn tính, hoa nhỏ không có bao hoa, quả mọng hoặc quả hạch. Chi Pandanus phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, có 20 loài Pandanus, trong đó có 8 loài đặc hữu.

1.2. Pandanus tonkinensis và công dụng theo kinh nghiệm dân gian

Pandanus tonkinensis hay còn gọi là dứa Bắc Bộ, phân bố từ Bắc Bộ đến miền Trung, Tây Nguyên. Theo kinh nghiệm dân gian, đọt non, lá, rễ và quả của Pandanus tonkinensis được dùng làm thuốc. Các bài thuốc từ Pandanus tonkinensis chủ yếu có tác dụng lợi tiểu, chữa sỏi thận, sỏi mật, viêm đường tiết niệu, viêm gan, xơ gan cổ trướng, thanh nhiệt, hạ sốt, bệnh ngoài da. Cần có nghiên cứu khoa học để xác thực các công dụng này.

II. Thách Thức Thiếu Nghiên Cứu Về Thành Phần Hóa Học Dứa Dại

Mặc dù Pandanus tonkinensis được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền, nhưng đến nay, các nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này còn rất hạn chế. Chương trình Khoa học công nghệ phát triển bền vững vùng Tây Bắc đã công bố hiệu quả bảo vệ gan của bài thuốc có chứa dịch chiết Pandanus tonkinensis, nhưng vẫn chưa có nghiên cứu sâu về các hợp chất tự nhiên có trong cây. Việc thiếu thông tin về thành phần hóa học gây khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng dược liệu và phát triển các chế phẩm từ Pandanus tonkinensis. Do đó, việc nghiên cứu phân tích thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của Pandanus tonkinensis là cần thiết.

2.1. Sự cần thiết của nghiên cứu khoa học về Pandanus tonkinensis

Việc sử dụng Pandanus tonkinensis trong y học cổ truyền dựa trên kinh nghiệm, thiếu cơ sở khoa học vững chắc. Nghiên cứu khoa học giúp xác định rõ thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cây, từ đó chứng minh hiệu quả điều trị. Ngoài ra, nghiên cứu giúp chuẩn hóa quy trình sử dụng, đảm bảo an toàn và hiệu quả cho người bệnh. Nghiên cứu còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm dược liệu mới từ Pandanus tonkinensis.

2.2. Khó khăn trong kiểm soát chất lượng dược liệu Pandanus tonkinensis

Thiếu thông tin về thành phần hóa học gây khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng dược liệu Pandanus tonkinensis. Không thể xác định được các chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu. Dẫn đến nguy cơ sử dụng dược liệu kém chất lượng, không đảm bảo hiệu quả điều trị. Việc nghiên cứu thành phần hóa học giúp xác định các chất đánh dấu, từ đó xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu Pandanus tonkinensis.

III. Cách Phân Lập Hợp Chất Từ Dứa Dại Bằng Hóa Lý Hiện Đại

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại để chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên từ Pandanus tonkinensis. Quá trình bắt đầu bằng việc chiết xuất dược liệu bằng các dung môi khác nhau. Tiếp theo, sử dụng các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để phân lập các phân đoạn có chứa các hợp chất. Sau khi phân lập, các hợp chất được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký. Cuối cùng, cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phân tích GC-MS, phân tích LC-MS, phổ NMR.

3.1. Quy trình chiết xuất dược liệu và phân lập hợp chất

Bắt đầu bằng chiết xuất dược liệu từ các bộ phận của cây Pandanus tonkinensis như lá, rễ, quả bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau như ethanol, methanol. Mục đích là thu được tối đa các hợp chất tự nhiên có trong cây. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để phân chia hỗn hợp phức tạp thành các phân đoạn đơn giản hơn.

3.2. Xác định cấu trúc hóa học bằng phổ NMR và MS

Cấu trúc hóa học của các hợp chất sau khi phân lập được xác định bằng các phương pháp phổ NMR (Nuclear Magnetic Resonance), bao gồm 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC. Các phương pháp phổ khối lượng (MS) như HR-ESI-MS (High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry) cũng được sử dụng để xác định khối lượng phân tử và các mảnh ion đặc trưng của các hợp chất.

3.3. Tinh chế hợp chất để đảm bảo độ tinh khiết

Để đảm bảo tính chính xác của các kết quả nghiên cứu, các hợp chất sau khi phân lập cần được tinh chế để đạt độ tinh khiết cao. Các phương pháp tinh chế thường được sử dụng bao gồm kết tinh lại, sắc ký cột với các vật liệu nhồi khác nhau. Độ tinh khiết của các hợp chất được kiểm tra bằng HPLC (High Performance Liquid Chromatography) và NMR.

IV. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Và Ứng Dụng Dược Liệu

Sau khi xác định cấu trúc, hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được đánh giá bằng các thử nghiệm in vitro và in vivo. Các hoạt tính được đánh giá bao gồm khả năng kháng oxy hóa, khả năng kháng viêm, khả năng kháng khuẩn, khả năng chống ung thư. Đặc biệt, hoạt tính bảo vệ gan được ưu tiên đánh giá. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học là cơ sở để xác định tiềm năng ứng dụng dược liệu của Pandanus tonkinensis trong điều trị bệnh. Nghiên cứu cũng xem xét độc tính và an toàn sử dụng của các hợp chất.

4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm và kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng viêm được đánh giá thông qua khả năng ức chế sản sinh các chất trung gian gây viêm như NO (Nitric Oxide), TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) trên các dòng tế bào viêm như RAW 264.7. Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khả năng khử gốc tự do DPPH, ABTS.

4.2. Nghiên cứu độc tính và an toàn sử dụng

Để đảm bảo an toàn khi sử dụng, cần đánh giá độc tính của các hợp chất phân lập được. Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên động vật thí nghiệm. Xác định liều gây độc (LD50) và các tác dụng phụ có thể xảy ra. Đánh giá an toàn sử dụng giúp đưa ra khuyến cáo về liều dùng và cách sử dụng an toàn cho người bệnh.

4.3. Ứng dụng dược liệu và phát triển thuốc mới

Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học là cơ sở để phát triển các sản phẩm dược liệu mới từ Pandanus tonkinensis. Phát triển các loại thuốc, thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, viêm nhiễm, oxy hóa. Cần có các nghiên cứu lâm sàng để chứng minh hiệu quả và độ an toàn của các sản phẩm này.

V. Chất Đánh Dấu Dược Liệu Kiểm Soát Chất Lượng Dứa Dại

Để kiểm soát chất lượng dược liệu Pandanus tonkinensis, cần xác định các chất đánh dấu đặc trưng. Các chất đánh dấu là các hợp chất có hàm lượng tương đối ổn định trong dược liệu và có thể định lượng được. Việc xác định và định lượng chất đánh dấu giúp đảm bảo tính đồng nhất và chất lượng của dược liệu. Các chất đánh dấu được lựa chọn dựa trên hoạt tính sinh học và khả năng phân tích định lượng.

5.1. Lựa chọn và chiết xuất chất đánh dấu từ dược liệu

Lựa chọn các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt, có hàm lượng tương đối cao và ổn định trong dược liệu Pandanus tonkinensis để làm chất đánh dấu. Chiết xuất chất đánh dấu từ dược liệu bằng các phương pháp phù hợp để thu được chất đánh dấu với độ tinh khiết cao.

5.2. Xây dựng quy trình phân tích định lượng chất đánh dấu

Xây dựng quy trình phân tích định lượng chất đánh dấu bằng các phương pháp HPLC, LC-MS. Quy trình cần đảm bảo độ chính xác, độ lặp lại, độ đúng và độ nhạy cao. Quy trình được thẩm định theo các hướng dẫn quốc tế như ICH, USP.

5.3. Ứng dụng quy trình định lượng chất đánh dấu

Ứng dụng quy trình phân tích định lượng để đánh giá hàm lượng chất đánh dấu trong các mẫu dược liệu Pandanus tonkinensis thu hái tại các địa phương khác nhau. Đánh giá sự biến đổi hàm lượng chất đánh dấu theo thời gian, theo điều kiện sinh trưởng. Kết quả giúp đánh giá chất lượng dược liệu và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Về Dứa Dại

Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Pandanus tonkinensis đã mở ra hướng đi mới trong việc khai thác tiềm năng dược liệu của loài cây này. Việc xác định các chất đánh dấu giúp kiểm soát chất lượng dược liệu và phát triển các sản phẩm từ Pandanus tonkinensis. Trong tương lai, cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của các hợp chất, nghiên cứu lâm sàng để chứng minh hiệu quả và độ an toàn của các sản phẩm từ Pandanus tonkinensis.

6.1. Giá trị của nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu của Việt Nam. Mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm dược liệu có giá trị kinh tế cao, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng. Thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghiệp dược liệu Việt Nam.

6.2. Hướng phát triển và nghiên cứu tiềm năng

Nghiên cứu về tác dụng hiệp đồng của các hợp chất trong Pandanus tonkinensis. Nghiên cứu về dược động học, dược lực học của các hợp chất. Nghiên cứu về tổng hợp hóa học, cải tiến hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có hoạt tính sinh học mạnh hơn. Nghiên cứu về bảo tồn nguồn gen, phát triển bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ hóa học: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài Dứa dại (Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại” được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Đinh Thị Huyền Trang, chuyên ngành Hóa phân tích (Mã số: 9 44 01 18), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Dương Hồng Anh và PGS. Ngô Quốc Anh tại Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (bảo vệ năm 2023).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Họ Dứa dại (Pandanaceae) tại Việt Nam có 23 loài thuộc 2 chi (Freycinetia và Pandanus), trong đó có 9 loài thuộc chi Pandanus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh về gan (viêm gan, xơ gan cổ trướng), thận (sỏi thận, sỏi mật, viêm đường tiết niệu) và thanh nhiệt. Loài Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone (tên gọi khác: Dứa Bắc bộ, dứa gai, dứa gỗ) là loài mọc tự nhiên từ các tỉnh miền núi, trung du phía Bắc đến Khánh Hòa, có các bộ phận như đọt non, lá, rễ và quả được dùng làm thuốc.

Chương trình Khoa học công nghệ phát triển bền vững vùng Tây Bắc đã công bố kết quả điều tra bài thuốc dân gian điều trị bệnh gan mật gồm hai vị Trứng quốc (Stixis suaveolens) và Dứa dại (Pandanus tonkinensis), chứng minh dịch chiết nước có hiệu quả bảo vệ gan cao hơn silymarin. Tuy nhiên, trước thời điểm thực hiện luận án, chưa có công bố khoa học nào nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học phân tử của loài Pandanus tonkinensis. Việc thiếu hụt dữ liệu hóa học và chất đánh dấu chuẩn hóa gây khó khăn cho việc kiểm soát chất lượng dược liệu và phát triển các sản phẩm bào chế định hướng bảo vệ gan. Do đó, việc nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hóa học, sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro và xây dựng quy trình phân tích định lượng chất đánh dấu từ loài này là vấn đề có tính cấp thiết khoa học và thực tiễn.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu chính:

1. Phân tích thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học định hướng bảo vệ gan của các hợp chất phân lập từ quả và rễ loài Pandanus tonkinensis.
2. Xác định chất đánh dấu từ loài Pandanus tonkinensis theo hướng bảo vệ gan và xây dựng quy trình phân tích định lượng các chất đánh dấu trong dược liệu phục vụ việc kiểm soát chất lượng và phát triển chế phẩm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Quả và rễ của cây Dứa dại (Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone).
• Phạm vi không gian: Mẫu dược liệu được thu hái tại 4 địa phương: huyện Lương Sơn (Hòa Bình), huyện Mường Lát (Thanh Hóa), huyện Cẩm Thủy (Thanh Hóa) và huyện Định Hóa (Thái Nguyên). Tên khoa học của mẫu được TS. Đỗ Thị Xuyến (Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội) giám định và đối chiếu với mẫu tiêu bản (ký hiệu HNU 024663) lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
• Phạm vi thời gian: Mẫu thực vật thu thập vào tháng 02 năm 2021; các thí nghiệm phân tích, đo phổ, thử nghiệm sinh học và thẩm định quy trình định lượng được hoàn thành trong giai đoạn 2021–2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước về chi Pandanus

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về thực vật học, thành phần hóa học và hoạt tính dược lý của chi Pandanus:

1. Về phân loại và phân bố thực vật: Hệ thống APG IV (2018) xếp họ Pandanaceae gồm 5 chi (Benstonea, Freycinetia, Martellidendron, Pandanus, Sararanga). Chi Pandanus có khoảng 600 loài trên thế giới. Tại Việt Nam có 20 loài thuộc chi này, trong đó 2 loài nhập trồng (P. utilis, P. furcatus) và 18 loài mọc tự nhiên với 8 loài đặc hữu (P. bipollicaris, P. ceratostigma, P. cornifer, P. monodon, P. multidrupaceus, P. tectorius, P. tonkinensis...).
2. Về thành phần hóa học:
   • Hợp chất Alkaloid: Phân lập chủ yếu từ lá và rễ loài Pandanus amaryllifolius với hơn 42 hợp chất như pandanamine, pandamarilactone-1, norpandamarilactonine-A, (6Z)-pandanamine, 2-acetyl-1-pyrrolin, dubiusamines A-C, pandanusine A-B, pandalizin A-E (theo Nonato, Byrne, Takayama và cộng sự).
   • Hợp chất Carotenoid: Phân lập từ quả loài Pandanus tectorius bởi Lois Englberger và cộng sự, bao gồm α-caroten, β-caroten, β-cryptoxanthin, lutein, zeaxanthin.
   • Hợp chất Terpenoid: Phân lập từ P. tectorius (squalene, geraniol, linalool, citral), P. boninensis ((24S)-24-methyl-25,32-cyclo-5α-lacnosta-9(11)-en-3β-ol), P. simplex (loliolide, vomifoliol).
   • Hợp chất dẫn xuất acid carboxylic và phenolic: Phân lập từ P. amaryllifolius, P. odoratissimus, P. kaida, P. tectorius gồm acid vanillic, acid gallic, acid caffeic, acid cinnamic, acid ferulic, acid p-coumaric.
   • Hợp chất Lignan và Neolignan: Phân lập từ rễ P. odoratissimus (pinoresinol, 3,4-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)tetrahydrofuran của Ting Ting Jong); quả P. kaida ((±)-divanillyltetrahydrofuran, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol, (+)-isolariciresinol, (-)-secoisolariciresinol của các tác giả Việt Nam); thân và quả P. tectorius (cuneataside D, tachioside, balanophonin).
3. Về hoạt tính sinh học:
   • Kháng khuẩn: Hợp chất 24,24-dimethyl-5β-tirucall-9,25-dien-3-one từ lá P. tectorius ức chế Mycobacterium tuberculosis H37Rv với MIC 64 µg/mL (Mario A. Tan và cộng sự, 2008); cao methanol rễ non và lá P. tectorius ức chế Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus (IC50 từ 26,0–88,47 µg/mL).
   • Hạ đường huyết: Cao ethanol P. amaryllifolius hạ đường huyết trên chuột gây tiểu đường bởi streptozotocin (Sasidharan S.); 14/16 hợp chất từ quả P. tectorius ức chế enzym alpha-glucosidase mạnh hơn acarbose.
   • Chống ung thư: Dịch chiết nước rễ và lá P. odoratissimus thể hiện hoạt tính độc tế bào (cytotoxic) và chống phân bào (antimitotic) so với podophyllotoxin (Gunti Gowtham Raj).
   • Chống oxy hóa: Hợp chất 3,4-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)tetrahydrofuran từ rễ P. odoratissimus có hoạt tính tương đương BHA (Ting Ting Jong); các lignan từ P. kaida và P. odoratissimus có hoạt tính bắt gốc tự do.
   • Kháng viêm và bảo vệ gan: Dịch chiết methanol lá P. odoratissimus giảm phù chân chuột 64,2% (viêm mạn bằng formalin) và 68% (viêm cấp bằng carrageenan) theo Ramesh Londonkar (2015). Dịch chiết ethanol rễ P. odoratissimus liều 200 và 400 mg/kg làm giảm có ý nghĩa (p < 0,05) SGOT, SGPT, ALP, bilirubin trên chuột bị tổn thương gan do paracetamol (Garima Mishra và cộng sự); dịch chiết nước bài thuốc gồm Stixis suaveolens và Pandanus tonkinensis làm giảm men gan ALT, AST, MDA, TNF-α, IFN-γ trên chuột bị gây độc bởi CCl4 (Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Hóa học).

Nhóm hợp chất	Loài nghiên cứu tiêu biểu	Các hợp chất đại diện	Bộ phận phân lập
Alkaloid	P. amaryllifolius	Pandanamine, Norpandamarilactonine-A, Dubiusamine A-C, Pandalizin A-E	Lá, Rễ, Toàn cây
Carotenoid	P. tectorius	α-Caroten, β-Caroten, Lutein, Zeaxanthin, β-Cryptoxanthin	Quả
Terpenoid	P. tectorius, P. boninensis, P. simplex	Squalene, Geraniol, Linalool, Loliolide, Vomifoliol	Lá, Quả, Toàn cây
Dẫn xuất acid carboxylic	P. amaryllifolius, P. odoratissimus, P. kaida	Acid vanillic, Acid ferulic, Acid gallic, Acid p-coumaric	Lá, Quả, Rễ
Lignan & Neolignan	P. odoratissimus, P. kaida, P. tectorius	Pinoresinol, Syringaresinol, Medioresinol, Isolariciresinol, Secoisolariciresinol	Rễ, Quả, Thân

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Mặc dù chi Pandanus đã có nhiều công bố quốc tế, đối tượng Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone (Dứa Bắc bộ) chưa từng được nghiên cứu bài bản về hóa học và hoạt tính sinh học. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng việc: phân lập và xác định cấu trúc toàn bộ các hợp chất thứ cấp từ quả và rễ; sàng lọc hoạt tính kháng viêm và chống oxy hóa in vitro; chọn lựa các chất đánh dấu đặc trưng; xây dựng và thẩm định quy trình định lượng HPLC-DAD phục vụ chuẩn hóa dược liệu.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung đánh giá hoạt tính

• Cơ sở đánh giá định hướng bảo vệ gan: Tổn thương mô gan liên quan chặt chẽ đến phản ứng viêm và stress oxy hóa. Trong phản ứng viêm, đại thực bào tiết ra nitric oxide (NO) do enzym cảm ứng iNOS xúc tác, cùng các cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-1, IL-6). Trong stress oxy hóa, các gốc oxy phản ứng (ROS) gây peroxy hóa lipid màng tế bào tạo sản phẩm malondialdehyde (MDA). Do đó, luận án sử dụng 2 mô hình thử nghiệm in vitro: (1) Ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS); (2) Ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào mô gan chuột được cảm ứng bởi hệ Fenton ($Fe^{2+}/H_2O_2$).
• Cơ sở lựa chọn chất đánh dấu hóa học (marker): Dựa theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Dược điển Mỹ (USP) và EMA, chất đánh dấu phải là thành phần có hàm lượng đủ lớn, có phổ hấp thụ UV/đặc tính sắc ký rõ ràng, phân tách tốt bằng HPLC, có hoạt tính sinh học tương ứng với hướng điều trị của dược liệu hoặc đặc trưng cho loài.

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc

1. Chuẩn bị mẫu và chiết xuất:
   • Quả (9,6 kg bột khô) và rễ (14,0 kg bột khô) của P. tonkinensis được chiết siêu âm với methanol (tỷ lệ 1:3 w/v, chiết 3 lần x 30 L, 3 giờ/lần, không gia nhiệt).
   • Dịch chiết gom lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cao tổng methanol. Cao chiết được hòa tan vào nước cất và chiết phân bố lỏng-lỏng phân đoạn lần lượt với n-hexane, dichloromethane ($CH_2Cl_2$) và ethyl acetate (EtOAc).
2. Kỹ thuật phân lập sắc ký:
   • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng Silica gel 60 $F_{254}$ và RP-18 $F_{254s}$ (Merck); hiện vết bằng đèn UV bước sóng 254 nm, 365 nm và phun thuốc thử acid sulfuric ($H_2SO_4$) 10% hơ nóng.
   • Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ Silica gel pha thường (0,040–0,063 mm / 230–400 mesh), Silica gel pha đảo RP-18 (30–50 µm / YMC 150 µm), nhựa hấp phụ Diaion HP-20, gel Sephadex LH-20. Pha động rửa giải gradient gồm các hệ dung môi: n-hexane/acetone, $CH_2Cl_2$/MeOH, acetone/nước, MeOH/nước.
   • Sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC): Hệ thống HPLC điều chế với cột J'sphere ODS-H80 ($150 \times 20$ mm), pha động nước/acetonitrile (ACN) ở các tỷ lệ đẳng dung 13%, 15%, 20%, 24%, 28%, 33% ACN, tốc độ dòng 2,5 mL/phút.
3. Kỹ thuật xác định cấu trúc hóa học:
   • Khối phổ phân giải cao: Máy SCIEX X500 Q-TOF LC/MS và HPLC 1290 Infinity - 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (chế độ ion hóa phun mù điện tử ESI dương/âm).
   • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Máy Bruker Avance NEO 600 MHz và Bruker AM500 FT-NMR, chất nội chuẩn Tetramethylsilane (TMS), dung môi pha mẫu $CD_3OD$. Các kỹ thuật đo phổ: phổ 1D ($^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D (HSQC, HMBC, $^1H$-$^1H$ COSY, NOESY).
   • Các phương pháp phổ bổ trợ: Phổ lưỡng sắc tròn (CD) trên máy Chirascan CD spectrometer (đo thực nghiệm kết hợp tính toán hóa học lượng tử ECD để xác định cấu hình tuyệt đối); độ quay cực ($[\alpha]_D$) trên máy phân cực kế JASCO P-2000; phổ hồng ngoại (FT-IR) trên máy Nicolet Impact 410 / Perkin Elmer; phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) trên máy Shimadzu.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa (ức chế peroxy hóa lipid):
   • Mô gan chuột được đồng thể hóa trong đệm phosphate (pH 7,4, tỷ lệ 1:10 w/v).
   • Hỗn hợp phản ứng gồm dịch đồng thể gan, mẫu thử, hệ Fenton ($FeSO_4$ 0,1 mM : $H_2O_2$ 15 mM, tỷ lệ 1:1) ủ ở 37°C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng trichloroacetic acid (TCA) 10%, ly tâm 12000 vòng/phút. Dịch trong phản ứng với thiobarbituric acid (TBA) 0,8% ở 100°C trong 15 phút tạo phức màu hồng MDA-TBA. Đo mật độ quang (OD) tại bước sóng $\lambda = 532$ nm. Chất đối chứng dương: Trolox.
2. Đánh giá hoạt tính kháng viêm (ức chế sản sinh NO):
   • Nuôi cấy tế bào đại thực bào RAW 264.7 trên đĩa 96 giếng ($2 \times 10^5$ tế bào/giếng) trong môi trường DMEM (ở 37°C, 5% $CO_2$) trong 24 giờ.
   • Ủ mẫu thử 2 giờ trước khi kích thích sản sinh NO bằng lipopolysaccharide (LPS, 10 µg/mL) trong 24 giờ. Xác định nồng độ nitrite ($NO_2^-$) trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử Griess (sulfanilamide 1% trong $H_3PO_4$ 5% và N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 0,1%), đo OD tại $\lambda = 540$ nm trên đầu đọc ELISA. Chất đối chứng dương: NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA).
   • Thử nghiệm độc tính tế bào bằng phương pháp so màu MTT (đo OD ở 540 nm) để xác định tỷ lệ tế bào sống sót. Giá trị $IC_{50}$ được tính toán bằng phần mềm TableCurve 2Dv4.

Phương pháp thẩm định quy trình định lượng HPLC-DAD

Quy trình phân tích định lượng chất đánh dấu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD (Shimadzu LC-20AB / Agilent 1100 DAD) được thẩm định theo các hướng dẫn quốc tế của USFDA, AOAC International, USP và ICH:

• Khảo sát dung môi chiết xuất và số lần chiết (so sánh ethanol 50% và methanol 50%).
• Khảo sát tính đặc hiệu (so sánh mẫu chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử, mẫu trắng).
• Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn.
• Đánh giá độ lặp lại và độ tái lặp (RSD%).
• Đánh giá độ đúng (tỷ lệ thu hồi qua phương pháp thêm chuẩn).
• Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày tổng quan về tiềm năng nguồn dược liệu Việt Nam, giá trị của chi Pandanus trong y học cổ truyền chữa các bệnh thận và gan, đặt vấn đề nghiên cứu loài Pandanus tonkinensis chưa có dữ liệu khoa học, xác định 2 mục tiêu và 3 nội dung trọng tâm của luận án.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp có hệ thống các tài liệu về:

• Đặc điểm hình thái học, phân loại học chi Pandanus và loài P. tonkinensis Martelli ex B. Stone. Bảng danh mục chi tiết 20 loài thuộc chi Pandanus ở Việt Nam.
• Dữ liệu hóa học chiết xuất từ các loài Pandanus trên thế giới (128 hợp chất được thống kê thuộc các nhóm alkaloid, carotenoid, terpenoid, dẫn xuất acid carboxylic, lignan, phenylpropanoid).
• Tổng quan các hoạt tính sinh học đã công bố (kháng khuẩn, hạ đường huyết, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ gan trên mô hình in vivo chuột gây độc bằng $CCl_4$ và paracetamol).
• Lý thuyết về các phương pháp hóa lý chiết tách, phân tích sắc ký (TLC, CC, HPLC) và phổ cấu trúc (MS, NMR 1D/2D, CD).
• Cơ chế phản ứng viêm (vai trò của đại thực bào, NO, iNOS, COX-2, TNF-α, các interleukin) và stress oxy hóa (gốc tự do ROS, enzym SOD, quá trình peroxy hóa lipid tạo MDA).
• Khái niệm, nguyên tắc và tiêu chí lựa chọn chất đánh dấu (marker) theo quy chuẩn Dược điển và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Thu hái, xử lý mẫu tại 4 địa phương và giám định thực vật học mẫu P. tonkinensis.
• Danh mục hóa chất, dung môi phân tích, chủng tế bào RAW 264.7, động vật thí nghiệm (chuột) và hệ thống thiết bị đo đạc (Bruker NEO 600 MHz, Q-TOF LC/MS, Chirascan CD, Shimadzu HPLC-DAD).
• Quy trình chiết xuất và phân lập từ 9,6 kg quả khô: chiết siêu âm thu 250 g cao MeOH, phân đoạn thành PTD (210 g), PTE (5,0 g), PTW (25,0 g); kết hợp sắc ký cột Silica gel thường, RP-18 và HPLC điều chế j-sphere H-80 thu được 8 hợp chất ký hiệu PT1 đến PT8.
• Quy trình chiết xuất và phân lập từ 14,0 kg rễ khô: chiết siêu âm thu 40,0 g cao MeOH, phân đoạn thu PTH (2,5 g), PTD (3,7 g), PTE (5,3 g), PTW (27,0 g); kết hợp cột Diaion HP-20, Silica gel, RP-18, Sephadex LH-20, YMC và Prep-HPLC thu được 20 hợp chất ký hiệu PT9 đến PT28.
• Chi tiết quy trình thử nghiệm hoạt tính chống peroxy hóa lipid và ức chế NO.
• Quy trình chiết tách, tinh chế chất đánh dấu và các thông số thẩm định phân tích định lượng HPLC-DAD.

Mẫu dược liệu Pandanus tonkinensis (Quả: 9,6 kg; Rễ: 14,0 kg)
        Cao tổng Methanol
n-Hexane   Dichloromethane Ethyl Acetate   Lớp nước
 (PTH)          (PTD)          (PTE)        (PTW)
           Sắc ký cột Silica gel        Sắc ký cột RP-18 / Sephadex
                      Sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC)
         Phân lập từ Quả                            Phân lập từ Rễ
        (8 hợp chất: PT1 - PT8)                 (20 hợp chất: PT9 - PT28)

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả phân tích thực nghiệm của luận án:

1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất:
   • Từ quả (8 hợp chất): ficusal (PT1, 5,0 mg), syringaresinol (PT2, 23,6 mg), medioresinol (PT3, 6,0 mg), lariciresinol (PT4, 4,8 mg), secoisolariciresinol (PT5, 20,1 mg), vladinol F (PT6, 28,9 mg), luteoliflavan (PT7, 43,9 mg), isorhapontigenin (PT8, 54,7 mg). Cấu trúc gồm 4 lignan, 2 neolignan, 1 flavan và 1 polyphenol.
   • Từ rễ (20 hợp chất: PT9 - PT28): Xác định được nhiều hợp chất lignan/phenylpropanoid glycoside, trong đó có 3 hợp chất mới được công bố cấu trúc lần đầu:
     • Hợp chất mới PT10: (7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-β-D-glucopyranoside (xác định cấu hình bằng phổ thực nghiệm CD và tính toán phổ lý thuyết ECD).
     • Hợp chất mới PT25: cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranoside.
     • Hợp chất mới PT26: [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside].
2. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
   • Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS và hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột của các chất phân lập được trình bày trong các bảng số liệu chuyên biệt của luận án.
3. Lựa chọn, tinh chế và thẩm định chất đánh dấu:
   • Dựa trên hàm lượng chiết tách lớn, độ tinh khiết cao, đặc tính hấp thụ phổ UV và hoạt tính sinh học, luận án đã lựa chọn 2 hợp chất làm chất đánh dấu kiểm soát chất lượng: PT20 (pinoresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside) và PT6 (vladinol F).
   • Tinh chế thu nhận hai chất đánh dấu, xác nhận cấu trúc qua bộ dữ liệu phổ (HR-ESI-MS, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, HSQC, HMBC, UV, IR) và xác định độ tinh khiết đạt yêu cầu bằng HPLC.
   • Xây dựng quy trình định lượng đồng thời PT20 và PT6 bằng HPLC-DAD với chương trình pha động acid formic 0,1% / acetonitrile. Quy trình được thẩm định đầy đủ về tính đặc hiệu, độ tuyến tính ($R^2 > 0,999$), độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi (độ đúng), LOD và LOQ.
   • Ứng dụng quy trình định lượng thành công hàm lượng PT20 và PT6 trong các mẫu dược liệu P. tonkinensis thu hái tại Hòa Bình, Thái Nguyên và Thanh Hóa.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học (Lý luận)

1. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu toàn diện, có hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Dứa dại Bắc bộ (Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone) tại Việt Nam.
2. Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 28 hợp chất tinh khiết từ quả và rễ loài Pandanus tonkinensis, bổ sung vào ngân hàng dữ liệu hợp chất thiên nhiên:
   • 8 hợp chất từ quả: ficusal (PT1), syringaresinol (PT2), medioresinol (PT3), lariciresinol (PT4), secoisolariciresinol (PT5), vladinol F (PT6), luteoliflavan (PT7), isorhapontigenin (PT8).
   • 20 hợp chất từ rễ (PT9 đến PT28), trong đó đã phát hiện và xác định cấu trúc của 3 hợp chất mới chưa từng được công bố trên thế giới: PT10 ((7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-β-D-glucopyranoside), PT25 (cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranoside) và PT26 ([4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside]).
3. Đã cung cấp các bằng chứng khoa học thực nghiệm in vitro chứng minh các hợp chất phân lập từ loài P. tonkinensis có khả năng ức chế phản ứng viêm (thông qua ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7) và ức chế stress oxy hóa (thông qua ức chế peroxy hóa lipid mô gan chuột), làm sáng tỏ cơ sở khoa học cho kinh nghiệm dân gian sử dụng loài cây này để điều trị bệnh gan.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

1. Đã lựa chọn được 2 hợp chất đánh dấu hóa học (marker) đặc trưng cho loài Pandanus tonkinensis là pinoresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6); xây dựng thành công quy trình chiết xuất và tinh chế 2 chất đánh dấu này từ dược liệu.
2. Đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình phân tích định lượng đồng thời 2 chất đánh dấu PT20 và PT6 bằng phương pháp HPLC-DAD đạt các chỉ tiêu thẩm định quốc tế (tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi, LOD, LOQ theo USFDA/ICH/AOAC/USP).
3. Đã áp dụng quy trình để phân tích hàm lượng chất đánh dấu trên các mẫu dược liệu thu hái thực tế tại các địa phương (Hòa Bình, Thanh Hóa, Thái Nguyên), cung cấp công cụ phân tích phục vụ việc tiêu chuẩn hóa, kiểm nghiệm chất lượng nguồn nguyên liệu và phát triển các chế phẩm dược liệu từ loài Dứa Bắc bộ.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Hoạt tính sinh học định hướng bảo vệ gan mới chỉ dừng lại ở các mô hình sàng lọc in vitro (ức chế sản sinh NO trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 và ức chế peroxy hóa lipid mô gan chuột), chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính in vivo chuyên sâu trên mô hình động vật đối với từng đơn chất tinh khiết đã phân lập.
• Địa bàn thu thập mẫu thực vật thực nghiệm chủ yếu tập trung tại một số tỉnh trung du, miền núi phía Bắc và Bắc Trung Bộ (Hòa Bình, Thanh Hóa, Thái Nguyên), chưa mở rộng khảo sát hàm lượng chất đánh dấu trên các mẫu Pandanus tonkinensis phân bố tại khu vực Nam Trung Bộ hoặc Tây Nguyên.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục thử nghiệm đánh giá hoạt tính dược lý in vivo và nghiên cứu sâu cơ chế phân tử bảo vệ gan của 2 chất đánh dấu (PT20, PT6) cùng các hợp chất mới trên các mô hình bệnh lý gan động vật.
• Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết xuất, phân lập chất đánh dấu ở quy mô lớn hơn (pilot) nhằm tạo nguồn chất chuẩn đối chiếu phục vụ công tác kiểm nghiệm.
• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu dược liệu trên các vùng địa lý sinh thái khác nhau trên toàn quốc để đánh giá biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ và vùng thổ nhưỡng, phục vụ quy hoạch vùng trồng và khai thác bền vững.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo về quy trình kết hợp các kỹ thuật sắc ký đa tầng (CC, TLC, Diaion HP-20, RP-18, Prep-HPLC) để phân lập các hợp chất tự nhiên phân cực cao; phương pháp biện giải phổ phức tạp (1D/2D-NMR, HR-MS, phân tích phổ CD tính toán hóa lượng tử ECD để xác định cấu hình tuyệt đối).
• Các viện nghiên cứu, trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng: Cung cấp quy trình phân tích định lượng HPLC-DAD đã được thẩm định đầy đủ theo chuẩn ICH/AOAC, có thể ứng dụng trực tiếp để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm dược liệu Dứa dại (P. tonkinensis) và các chế phẩm liên quan.
• Các nhà phát triển sản phẩm dược liệu và doanh nghiệp dược phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học về hoạt tính kháng viêm, chống oxy hóa và dữ liệu về chất đánh dấu giúp định hướng xây dựng công thức, tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào cho các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gan mật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Đối tượng thực vật và địa bàn thu thập mẫu trong luận án là loài nào?

Trả lời: Đối tượng nghiên cứu là quả và rễ của loài Dứa dại (Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone, hay còn gọi là Dứa Bắc bộ), thuộc chi Pandanus, họ Dứa dại (Pandanaceae). Mẫu thực vật được thu thập vào tháng 02/2021 tại 4 địa bàn: Lương Sơn (Hòa Bình), Mường Lát (Thanh Hóa), Cẩm Thủy (Thanh Hóa) và Định Hóa (Thái Nguyên), được giám định tên khoa học bởi TS. Đỗ Thị Xuyến và lưu tiêu bản HNU 024663 tại Bảo tàng Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.

2. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất và có những hợp chất mới nào?

Trả lời: Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 28 hợp chất tinh khiết:

• 8 hợp chất từ quả (PT1 đến PT8): ficusal, syringaresinol, medioresinol, lariciresinol, secoisolariciresinol, vladinol F, luteoliflavan, isorhapontigenin.
• 20 hợp chất từ rễ (PT9 đến PT28), trong đó có 3 hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện và công bố cấu trúc:
  1. PT10: (7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-β-D-glucopyranoside.
  2. PT25: cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranoside.
  3. PT26: [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside].

3. Hoạt tính sinh học định hướng bảo vệ gan được đánh giá bằng những mô hình nào?

Trả lời: Hoạt tính sinh học được đánh giá qua 2 mô hình in vitro:

1. Mô hình ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO) trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 bị kích thích bởi Lipopolysaccharide (LPS, 10 µg/mL), sử dụng thuốc thử Griess đo quang ở 540 nm (chất đối chứng dương: L-NMMA; kiểm tra độc tính tế bào bằng MTT).
2. Mô hình ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột cảm ứng bởi hệ Fenton ($Fe^{2+}/H_2O_2$), định lượng sản phẩm malondialdehyde (MDA) tạo phức với thiobarbituric acid (TBA) đo quang ở bước sóng 532 nm (chất đối chứng dương: Trolox).

4. Hai chất đánh dấu (marker) được lựa chọn để chuẩn hóa dược liệu là những chất nào?

Trả lời: Hai chất đánh dấu được lựa chọn là pinoresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6). Các chất này được lựa chọn dựa trên tiêu chí: có hàm lượng phân lập lớn trong dược liệu, độ tinh khiết cao, cấu trúc đặc trưng cho chi/loài, hấp thụ quang phổ UV rõ rệt và thể hiện hoạt tính sinh học phù hợp với định hướng tác dụng bảo vệ gan.

5. Quy trình phân tích định lượng chất đánh dấu được xây dựng trên hệ thống nào và thẩm định theo tiêu chuẩn nào?

Trả lời: Quy trình phân tích định lượng đồng thời PT20 và PT6 được xây dựng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diode quang (HPLC-DAD) với cột pha đảo và hệ pha động acid formic 0,1% / acetonitrile. Quy trình được thẩm định theo các tiêu chuẩn quốc tế của USFDA, AOAC International, USP và ICH bao gồm các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính đường chuẩn, độ lặp lại, độ tái lặp, độ đúng (tỷ lệ thu hồi), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS Đinh Thị Huyền Trang là công trình nghiên cứu toàn diện đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Dứa dại Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone tại Việt Nam. Bằng việc kết hợp các phương pháp chiết xuất, sắc ký hiện đại và các kỹ thuật đo phổ phân giải cao, luận án đã phân lập, xác định cấu trúc 28 hợp chất tinh khiết (trong đó có 3 hợp chất mới), đồng thời chứng minh hoạt tính kháng viêm và chống oxy hóa in vitro định hướng bảo vệ gan của các hợp chất này. Luận án đã lựa chọn thành công 2 chất đánh dấu hóa học (PT20 và PT6), xây dựng và thẩm định quy trình định lượng HPLC-DAD đạt tiêu chuẩn quốc tế, ứng dụng phân tích mẫu thực tế tại các địa phương. Kết quả nghiên cứu không chỉ đóng góp các dữ liệu khoa học mới cho chuyên ngành Hóa phân tích và Hóa thực vật mà còn tạo cơ sở thực tiễn quan trọng phục vụ kiểm soát chất lượng và phát triển dược liệu Dứa Bắc bộ trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Là một trong những quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú, cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Nhiều công trình nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt Nam mang lại nhiều đóng góp to lớn cho việc bảo vệ sức khỏe con người. Loài thực vật có tác dụng chữa bệnh cho con người thì để lại ít tác dụng phụ hơn so với thuốc có nguồn gốc tổng hợp. Do đó với tình trạng ngày càng gia tăng về bệnh tật như tim mạch, ung thư, gan…thì việc nghiên cứu về các loài thực vật để làm thuốc có tính ý nghĩa về khoa học và thời sự [1].

Dứa dại (Pandanaceae) là một họ thực vật có hoa có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, phân bố từ Tây Phi đến Thái Bình Dương. Trong đó Pandanus là chi lớn và quan trọng nhất với khoảng 600 loài, có thể dùng làm nguồn thực phẩm và làm thuốc. Ở Việt Nam, họ Dứa dại (Pandanaceae) gồm 23 loài thuộc 2 chi là Freycinetia (3 loài) và Pandanus (20 loài). Theo các tài liệu y học cổ truyền, có 9 loài thuộc chi Pandanus được dùng làm thuốc ở Việt Nam, chủ yếu có tác dụng với các bệnh về thận (lợi tiểu, chữa sỏi thận, sỏi mật, viêm đường tiết niệu,…), các bệnh về gan (viêm gan, xơ gan cổ trướng), thanh nhiệt, hạ sốt, bệnh ngoài da,…[2], [3].

Loài dứa dại Pandanus tonkinensis Mart. Stone còn gọi là dứa Bắc bộ có mặt từ vùng núi trung du Bắc bộ tới miền Trung, Tây Nguyên, Bình Thuận, Long An là một trong 9 loài nói trên mà đọt non, lá, rễ và quả có thể dùng làm thuốc [2]. Trong chương trình Khoa học công nghệ phát triển bền vững vùng Tây bắc, đã công bố kết quả điều tra, nghiên cứu về bài thuốc điều trị bệnh gan mật, trong đó dịch chiết nước của bài thuốc với hai vị Trứng quốc (Stixis suaveolens) và Dứa dại (Pandanus tonkinensis) đã được chứng minh là có hiệu quả bảo vệ gan tốt, cao hơn so với sylimarin [4]. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của loài dứa dại Pandanus tonkinensis [5].

Để có được những bằng chứng khoa học về thành phần, hoạt tính sinh học cũng như kiểm soát chất lượng dược liệu và các sản phẩm bào chế theo hướng bảo vệ gan, luận án với tên đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài Dứa dại (Pandanus tonkinensis Mart.Stone) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại” đã được đề xuất và thực hiện. Mục tiêu của luận án: - Phân tích được thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính định hướng bảo vệ gan của các hợp chất từ loài Pandanus tonkinensis. - Xác định được chất đánh dấu từ loài Pandanus tonkinensis theo hướng bảo vệ gan và xây dựng được quy trình phân tích định lượng các chất đánh dấu trong 2 dược liệu phục vụ việc kiểm soát chất lượng và phát triển chế phẩm từ dược liệu này. Nội dung luận án bao gồm: - Sử dụng các kỹ thuật tách chiết, phân lập, các phương pháp hóa lý sinh hiện đại để phân tích thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập từ loài Pandanus tonkinensis.

- Lựa chọn chất đánh dấu cho loài Pandanus tonkinensis theo hướng bảo vệ gan; chiết xuất, tinh chế, phân tích kiểm tra độ tinh khiết của chất đánh dấu từ dược liệu này. - Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích định lượng các chất đánh dấu trong dược liệu Pandanus tonkinensis. Áp dụng quy trình, phân tích hàm lượng chất đánh dấu trong dược liệu thu hái tại một số địa phương. Giới thiệu sơ lược về chi Pandanus Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa APG IV (2018) [6] được phát triển bởi Angiosperm Phylogeny Group, chi Pandanus có vị trí phân loại như sau: Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class) : Liliopsida Bộ (ordo): Pandanales Họ (familia): Pandanaceae Chi (genus): Pandanus 1.1 Đặc điểm hình thái chung của chi Pandanus Dứa dại (Pandanaceae) là một họ thực vật có hoa có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Cổ thế giới, từ Tây Phi đến Thái Bình Dương.

Theo các nghiên cứu hiện nay đã thống kê được họ này có 5 chi, 982 loài trong đó Pandanus là chi lớn và quan trọng nhất, với khoảng 600 loài, gồm các loài được sử dụng làm nguồn thực phẩm quan trọng như dứa thơm (Pandanus amaryllifolius) và dứa julian (Pandanus julianettii); và nhiều loài khác được sử dụng làm thuốc. Đây là một họ cổ có niên đại từ đầu đến giữa kỷ Phấn trắng và đây cũng là một họ chưa được nghiên cứu kỹ đầy đủ [7,8,9,10,11]. Họ Pandanaceae bao gồm cây gỗ, cây bụi, bụi trườn, dây leo, cây thảo, sống lâu năm. Thân có thể là thân đơn hoặc phân nhánh thành các bụi lớn và có thể có rễ chống trên không.

Thân có các vết sẹo nổi rõ do các lá rụng để lại. Lá đơn mọc cách theo hình xoắn ốc, phiến lá rất dài và hẹp, có bẹ, không cuống, không chia thùy, có các gân song song; mép lá và gân chính giữa thường có gai. Cây thuộc loại đơn tính. Cụm hoa dạng chùm đơn hoặc kép, mọc ở đỉnh thân hoặc nách lá, hoa thường màu trắng hoặc có thể có màu sắc rực rỡ.

Hoa nhỏ và không có bao hoa. Hoa đực chứa nhiều nhị hoa với các chỉ nhị rời hoặc hợp nhất. Hoa cái có một hoa, không có vòi nhụy, thường gồm nhiều lá noãn xếp thành vòng, nhưng có thể giảm thành một hàng lá noãn hoặc một lá noãn. Quả mọng hoặc quả hạch, thường gồm nhiều quả xếp sít với nhau [7,8,9].

Trên thế giới, họ Pandanaceae bao gồm năm chi: Benstonea, Freycinetia, Martellidendron, Pandanus và Sararanga. Chi Pandanus ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố các loài Ở Việt Nam, họ Dứa dại (Pandanaceae) gồm 23 loài thuộc 2 chi là Freycinetia (3 loài) và Pandanus (20 loài) [10,11,12]. Có 2 loài thuộc chi Pandanus ở Việt Nam được nhập trồng làm cảnh là Pandanus utilis và Pandanus furcatus; 18 loài là cây mọc tự nhiên, trong đó có tới 8 loài là đặc hữu ở Việt Nam như Dứa chót chẻ - P. bipollicaris (mới thấy ở núi Bạch Mã – Thừa Thiên Huế); Dứa nha trang - P.

ceratostigma (Nha Trang – Khánh Hòa); Dứa sừng - P. cornifer (Phú Yên, Khánh Hòa); Dứa nhẵn - P. monodon (Đà Nẵng); Dứa nhiều chân - P. multidrupaceus (Lâm Đồng và Đồng Nai); Dứa gỗ - P.

tectorius (ven biển nhiều tỉnh ở Việt Nam) và Dứa Bắc bộ - P. tonkinensis (mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc tới Khánh Hòa.1 trình bày về phân bố và đặc điểm sinh thái của chi Pandanus ở Việt Nam hiện nay. Tóm tắt các thông tin cơ bản các loài thuộc chi Pandanus ở Việt Nam hiện nay Tên Việt Nam TT / Tên khoa Phân bố Đặc điểm sinh thái học Dứa cam - P. Mọc thành bụi ở affinis Kurz (P.

Ở miền Trung, còn có ở Malaysia, vùng trung du, đồng 1 aurantiacus Indonesia và Philippin bằng, trong đầm lầy, Ridl.) trảng cỏ Dứa thơm - Được trồng nhiều nơi ở Việt Nam Pandanus Mọc thành bụi ở để lấy lá làm hương liệu, còn có ở 2 amaryllifolius vùng núi, trung du Xri Lanca, Thái Lan, Malaysia, Roxb. và đồng bằng Indonesia và Philippin odorus Ridl.) Mọc thành bụi ở Dứa chót chẻ - vùng núi, trung du, 3 P. bipollicaris Thừa Thiên Huế (Bạch Mã) trong rừng, ven suối, St.400m Bình Dương (Thủ Dầu Một, Thị Mọc thành bụi ở Dứa nhiếm - P. Tính, Lái Thiêu), Tây Ninh, thành vùng núi, trung du, 4 capusii Mart.

phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai (Biên trong rừng, trảng cỏ, Hòa), còn có ở Thái Lan, ven bờ sông suối. Có 5 Campuchia quả tháng 5-6. Dứa Nha Mọc thành bụi ở Trang - P. Loài đặc hữu của Việt Nam, gặp ở trung du, đồng bằng 5 ceratostigma Khánh Hòa (Nha Trang) và ven biển, trong Mart.

trảng cỏ, đầm lầy Dứa sừng - P. Mọc thành bụi ở Phú Yên, Khánh Hòa (Nha Trang, 6 cornifer St. vùng núi, trong rừng, Hòn Tre) John trảng cỏ Dứa nước - P. Phú Yên, Khánh Hòa (Nha Trang, Mọc thành bụi ở 7 fibrosus Phú Hữu), còn có ở Thái Lan, Trung vùng trung du, đồng Gagnep.

Quốc, Lào bằng và ven biển Dứa dạng nĩa - Cây bụi, mọc thành 8 P. furcatus Tp Hồ Chí Minh còn có ở Ấn Độ bụi rải rác Roxb. Dứa nuốm Mọc thành bụi ở ngang - P. Kiên Giang (Phú Quốc, Hòn Thơm), vùng đồng bằng, ven 9 horizonatalis còn có ở Malaysia.

biển, trong rừng, St. John trảng cỏ Hà Nam, Ninh Bình, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam (Hội Mít), Mọc thành bụi ở Khánh Hòa (Nha Trang, Phước Dứa núi - P. vùng núi đá, trong 10 Thành), Lâm Đồng (Bảo Lộc), Tây humilis Lour. rừng, ở độ cao Ninh, Đồng Nai (Biên Hòa, Bảo 1.500m Chánh, Trảng Bom), Bà Rịa Vũng Tàu (Bà Rịa).

Còn có ở Lào, Thái Lan, Campuchia và Malaisia Tp Hồ Chí Minh, Hà Nội (Bất Bạt), Mọc thành bụi ở Dứa kaida - P. 11 vùng núi, trung du, kaida Kurz Còn có ở Campuchia và Hải Nam trong rừng, trảng cỏ (Trung Quốc) Dứa nhẵn - P. Mọc thành bụi ở 12 Nam bộ Việt Nam laevis Rumph. miền núi, trong rừng.

monodon Mọc thành bụi ở 13 Đà Nẵng (Gaudich.) miền núi, trong rừng Balf. Mọc thành bụi ở Dứa nhiều vùng núi, trung du, chân - P. Lâm Đồng (Đà Lạt), Đồng Nai 14 trong rừng, trảng cỏ, multidrupaceus (Long Thành) ven sông suối, ở độ St.500 m Mọc thành bụi ở Dứa bụi nhỏ - Hà Nội (Ba Vì: Làng Cốc), còn có ở vùng núi, trong rừng, 15 P. trảng cỏ, ở độ cao tới B.000m Quảng Ninh (Uông Bí), Hà Nam (Kim Bảng, Kiện Khê, Võ Xá), Ninh Bình, Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa (Nha Trang, Cam Ranh, Hòn Mọc thành bụi, ở Dứa dại - P.

Miếu), Bình Thuận (Phan Thiết: đồng bằng, ven biển, 16 odoratissimus Mũi Né), Đồng Nai (Biên Hòa), Bà vùng nước mặn, đất L. Rịa – Vũng Tàu (Phước Tuy), Kiên cát Giang (PhúQuốc). Còn có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Thái Lan, Xri Lanca, Malaixia và Philippin Mọc thành bụi ở Dứa gỗ - P. Mọc nhiều ở các vùng ven biển Việt vùng đồng bằng, ven 17 tectorius Nam biển.

Ra hoa tháng 6 Parkins - 9, hoa đực rất thơm Mọc thành bụi ở Hà Nội (Ba Vì), Quảng Bình, Dứa Bắc bộ - vùng núi, trong rừng, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà 18 P.200 Nẵng, Quảng Nam, Đắc Lắc, Khánh Mart. Mùa hoa quả Hòa (Nha Trang, Hòn Hèo) tháng 2 - 5 7 Hà Nam (Kim Bảng, Kiện Khê), Nghệ An (Cô Ba), Hà Tĩnh, Quảng Bụi cao 1 – 2 m, Dứa đuôi - P.