Đặt vấn đề Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lƣơng thực quan trọng ở vùng nhiệt đới và một số khu vực ôn đới bao gồm các vùng phía nam của châu Âu và châu Mỹ. Củ khoai lang tích lũy lƣợng tinh bột khá cao. Khoai lang giàu năng lƣợng, vitamin, cũng nhƣ hàm lƣợng protein từ 2% đến 10% khối lƣợng chất khô [73]. Bên cạnh đó khoai lang tím có polyphenol chứa anthocyamin có tác dụng kháng ôxy hoá rất mạnh, có khả năng kiềm chế đột biến các tế bào ung thƣ, hạ huyết áp, phòng ngừa bệnh tim mạch, có công năng làm đẹp, giàu chất xơ thực phẩm có tác dụng thông tiện, tác dụng tốt đối với những ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng.
Cây khoai lang có sắc tố có thể bào chế chất nhuộm màu thực phẩm thiên nhiên thay sắc tố tổng hợp nhân tạo. Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc đã đánh giá khoai lang là thực phẩm bổ dƣỡng tốt của thế kỷ 21, đang đƣợc thị trƣờng thế giới rất ƣa chuộng. Ở nƣớc ta, khoai lang là cây trồng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất lƣơng thực, đứng thứ 3 sau lúa và ngô. Với ƣu thế tạo ra sinh khối lớn trong thời gian ngắn và các bộ phận của cây đều đƣợc sử dụng, cây khoai lang đã và đang đƣợc chú ý thâm canh.
Tổng diện tích trồng khoai lang cả nƣớc là 150 800 ha, đạt sản lƣợng 1 317 200 tấn (Tổng cục thống kê, 2010). Năng suất khoai lang bình quân ở nƣớc ta là 8,73 tấn/ha, thấp hơn so với năng suất bình quân của các quốc gia ở châu Mỹ và một số nƣớc châu Á. Năng suất thấp ngoài các nguyên nhân về giống khoai lang địa phƣơng đã thoái hóa, việc canh tác khoai lang chƣa thực hiện đúng quy trình kỹ thuật. thì nguyên nhân chủ yếu là do tổn thất vì sâu bệnh , đă ̣c biê ̣t là do bọ hà hại khoai.
Ở Việt Nam, các vùng khô hạn miền núi phía Bắc, các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên củ khoai lang bị bọ hà gây hại rất nặng, nhất là trong các vụ hè thu tỷ lệ củ bị hại có thể lên đến 30 – 50%, thậm chí lên đến 100% [18]. Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đƣờng đục làm cho củ khoai xuất hiện những vết thâm, mùi hắc và vị đắng khi ăn. Hiện nay, đã có nhiều biện pháp để phòng trừ bọ hà khoai lang nhƣ sƣ̉ du ̣ng các biện pháp trừ sâu hóa học ; Biện pháp sƣ̉ du ̣ng chấ t dẫn du ̣ sinh học ; Biện pháp 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com canh tác; Sử dụng kẻ thù tự nhiên; Hoặc sử dụng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau trong phòng trừ bọ hà… Tuy nhiên các phƣơng pháp trên đang gặp phải một số vấn đề nhƣ an toàn sinh học, thủ công nên mất nhiều thời gian và nhân công, khó đáp ứng cho nhu cầu sản xuất trên quy mô lớn ở các vùng chuyên canh và cơ giới hóa trong sản xuất. Ngày nay cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học, đặc biệt là Công nghệ chuyển gen đã mở ra nhiều hƣớng đi mới đầy tiềm năng trong phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng nói chung và phòng trừ bọ hà cho khoai lang nói riêng.
Phƣơng pháp này sẽ giải quyết triệt để các hạn chế của các phƣơng pháp truyền thố ng. Việc chuyển gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoai lang thông qua hệ thống chuyển gen ở thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium đang là hƣớng đi mới. Tuy nhiên, cho tới nay, tạo cây khoai lang chuyển gen gặp nhiều khó khăn. Do vậy tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium, cũng nhƣ thử nghiệm hoạt động của cấu trúc gen biến nạp thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ là rất cần thiết.
Với mục đích làm cơ sở cho việc nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phƣơng pháp khả thi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ―Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)‖ 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang thông qua vi khuẩn Agrobacterium. - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang gen cry3 thông qua Agrobacterium rhizogens sử dụng làm mô hình đánh giá hoạt động cấu trúc của gen chuyển. Nội dung của đề tài - Tối ƣu một số yếu tố trong quy trình chuyển gen vào khoai lang KB1 nhờ vi khuẩn A.rhizogens thông qua biểu hiện của gen gus.
- Chuyển gen cry3 vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens và kiểm tra biểu hiện của cấu trúc gen chuyển trong các dòng rễ tơ. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Vai trò và giá trị của cây khoai lang 1. Sơ lược về cây khoai lang Khoai lang (Ipomoea batatas), là cây hai lá mầm, thuộc chi khoai lang (Ipomoea), họ bìm bìm (Convolvulaceae), bộ cà (Solanales). Khoai lang trồng ở vùng nhiệt đới cây thân thảo sống lâu năm, trồng ở vùng ôn đới, thƣờng có dạng bụi. Lá hình tim, nguyên hay có khía.
Hoa trắng, vàng hay tím, hình phễu. Củ hình thoi do rễ phồng lên, chứa tinh bột và đƣờng, vỏ củ màu trắng, vàng hay đỏ tím, thịt củ trắng, vàng hay tím nhạt tùy theo giống. Chúng là cây giao phấn, ngày ngắn, không ra hoa khi ngày dài quá 13 giờ 30 phút, do đó ít khi ra hoa ở những vùng có vĩ độ ôn đới trên 30 độ Bắc hay Nam. Ở vùng nhiệt đới, dễ ra hoa, có hạt, có sức sống, nhƣng thƣờng chỉ trồng bằng các đoạn dây gọi là hom, trong trƣờng hợp gây giống có thể trồng bằng mầm nẩy từ củ.
Khoai lang là cây lục bội thể (hexaploid 2n = 6x = 90), nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, đƣợc con ngƣời trồng cách đây trên 5000 năm, lan truyền rất sớm sang các quần đảo Thái Bình Dƣơng và từ đó sang các nƣớc Châu Á, đƣợc C.Colombo đƣa về Châu Âu và ngƣời Bồ Đào Nha đƣa sang Châu Phi. Hiện nay, khoai lang đƣợc trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và một số vùng cận nhiệt đới, ôn đới [16]. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cây khoai lang Về giá trị dinh dƣỡng, trong 100g củ khoai lang tƣơi trung bình có 68g nƣớc; 0,8g protein; 0,2g lipid; 28,5g glucid (24,5g tinh bột, 4g glucoza) và 1,3g cellulose, có thể cung cấp cho cơ thể khoảng 122 calo. Ngoài ra trong khoai lang tƣơi còn có nhiều vitamin và muối khoáng (34mg canxi, 49,4mg photpho, 1mg sắt, 0,3mg caroten, 0,05mg vitamin B1, 0,05mg vitamin B2, 0,6mg vitamin PP, 23mg vitamin C.
Tuy nhiên hàm lƣợng nƣớc và chất khô phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ giống, nơi trồng, khí hậu, độ dài ngày, loại đất, kỹ thuật trồng trọt. Khi phơi khô rút gần hết nƣớc, giá trị dinh dƣỡng của khoai còn cao hơn. Trong 100g khoai lang khô có 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 11g nƣớc, 2,2g protein, 0,5g lipid, 80g glucid, 3,6g cellulose, nhiều loại vitamin và muối khoáng. Trong 100g rau khoai lang có 91,9g nƣớc, 2,6g protein, 2,8g glucid, 1,4g cellulose canxi, 54mg PP, 11mg vitamin C.
Khoai lang đƣợc xem nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng là chủ yếu, nó cho năng lƣợng 113Cal/100g cao hơn ở khoai tây là 75Cal/100g [12]. Ở các nƣớc trồng khoai lang trên thế giới, khoai lang đƣợc sử dụng rộng rãi với mục đích làm lƣơng thực, thực phẩm, cung cấp rau cho ngƣời, chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau. Tinh bột khoai lang đƣợc sử dụng chế biến thành sản phẩm tinh bột biến tính, các sản phẩm lên men thuỷ phần đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, dệt, giấy, vật liệu xây dựng, cao su nhân tạo. là nguyên liệu lý tƣởng để sản xuất thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học có giá thành cạnh tranh, thân thiện với môi trƣờng, góp phần phát triển năng lƣợng tái tạo thay thế năng lƣợng hoá thạch.
Ngoài ra, khoai lang còn là vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì vị [9]. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lƣơng Thực và Nông Nghiệp của Liên Hợp Quốc, trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm lƣơng thực, 13% làm thức ăn gia súc, 3% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau [9], [12]. Phần loại bỏ đi rất ít chiếm 6%, phần thân lá ngọn vừa đƣợc sử dụng làm rau xanh cho con ngƣời đồng thời là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên việc sử dụng khoai lang nhiều vào mục đích nào phụ thuộc vào trình độ phát triển của các nƣớc trồng.
Ở các nƣớc phát triển lƣợng khoai lang củ đƣợc sử dụng làm lƣơng thực chiếm 55%, trong khi đó sử dụng làm nguyên liệu chế biến tăng đến 25% [87]. Ở Việt Nam từ xƣa nông dân đã có truyền thống sử dụng khoai lang làm lƣơng thực thực phẩm và thức ăn gia súc. Tuy nhiên 90% sản phẩm khoai lang sử dụng chủ yếu ở vùng nông thôn, trong đó 60% sản lƣợng khoai lang đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc dƣới dạng củ tƣơi. Do giá trị dinh dƣỡng cao, thuận tiện trong chế biến với nhiều mục đích khác nhau, ngày nay cây khoai lang ngày càng khẳng định giá trị của mình trong nền kinh tế.
Cho đến nay khoai lang đƣợc trồng phổ biến trên cả nƣớc (Bảng 1. Tuy nhiên do có những hạn 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chế về năng suất, bảo quản chế biến sau thu hoạch nên những năm gần đây diện tích trồng giảm, năng suất thấp và chƣa ổn định. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.