Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim schefflera octophylla lour harms

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu quy trình tạo nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla Lour Harms.

• Tác giả: Huỳnh Thị Lũy
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Hổ
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh học nhiệt đới
• Đề tài: Nghiên cứu tạo nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim Schefflera Octophylla
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
• MỞ ĐẦU
• Tính cấp thiết của đề tài
• Mục tiêu của đề tài
• Mục tiêu tổng quát
• Mục tiêu cụ thể
• Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• Ý nghĩa khoa học
• Ý nghĩa thực tiễn
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu
• Phạm vi nghiên cứu
• Tính mới của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)
• 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố
• 1.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái
• 1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng
• 1.1.3.1. Thành phần hóa học
• 1.2. Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
• 1.2.1. Phôi vô tính
• 1.2.2. Rễ bất định
• 1.2.3. Phôi vô tính
• 1.2.4. Rễ bất định
• 1.2.5. Schefflera octophylla (Lour.) Harms
• 1.2.6. Schefflera arboricola (Hayata) Merr.
• 1.2.7. Schefflera leucantha Viguier
• 1.2.8. Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon
• 1.3. Sự phát sinh phôi vô tính
• 1.3.1. Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính
• 1.3.2. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính
• 1.4. Sự hình thành rễ bất định
• 1.4.1. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định
• 1.4.2. Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguồn mẫu – Vật liệu nuôi cấy
• 2.1.1. Tạo vật liệu nuôi cấy ban đầu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Tạo phôi vô tính
• 2.2.2. Nhân phôi vô tính
• 2.2.3. Tạo rễ bất định
• 2.2.4. Nhân rễ bất định
• 2.3. Tạo phôi vô tính
• 2.3.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
• 2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
• 2.3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
• 2.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
• 2.3.1.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
• 2.3.1.5. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính
• 2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất
• 2.3.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá
• 2.3.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm)
• 2.3.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)
• 2.4. Nhân phôi vô tính
• 2.4.1. Nhân phôi trên môi trường đặc
• 2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng
• 2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc
• 2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
• 2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp
• 2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
• 2.4.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
• 2.4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp
• 2.4.3. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc
• 2.4.4. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp
• 2.4.5. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định
• 2.5. Tạo rễ bất định
• 2.5.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 2.5.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 2.5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 2.5.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 2.5.1.4. Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá
• 2.5.2. Tạo rễ bất định từ chồi
• 2.5.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm
• 2.5.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro
• 2.5.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính
• 2.6. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng
• 2.6.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ
• 2.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
• 2.6.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
• 2.6.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian
• 2.7. Điều kiện nuôi cấy in vitro
• 2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo phôi vô tính
• 3.1.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
• 3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
• 3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
• 3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
• 3.1.1.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
• 3.1.1.5. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính
• 3.1.1.6. Trồng cây con ở chậu đất
• 3.1.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp
• 3.1.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm)
• 3.1.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)
• 3.2. Nhân phôi vô tính
• 3.2.1. Nhân phôi trên môi trường đặc
• 3.2.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng
• 3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp
• 3.2.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
• 3.2.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp
• 3.2.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
• 3.2.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
• 3.2.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp
• 3.2.3. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc
• 3.2.4. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp
• 3.3. Tạo rễ bất định
• 3.3.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 3.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 3.3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
• 3.3.1.4. Minh họa sự tái sinh rễ trực tiếp và khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp
• 3.3.2. Tạo rễ bất định từ chồi
• 3.3.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm
• 3.3.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro
• 3.3.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính
• 3.4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng
• 3.4.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ
• 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
• 3.4.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối của rễ
• 3.4.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Nghiên cứu nhân phôi

Phần này tập trung vào nghiên cứu nhân phôi của cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera Octophylla). Mục tiêu chính là tạo và nhân phôi vô tính từ mô lá thông qua các phương pháp nuôi cấy in vitro. Các yếu tố ảnh hưởng như môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng (NAA, BA), nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng được phân tích kỹ lưỡng. Kết quả cho thấy môi trường SH bổ sung 5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose và 10% nước dừa là tối ưu cho sự hình thành phôi vô tính trực tiếp. Phương pháp nuôi lỏng lắc cũng được chứng minh hiệu quả hơn so với môi trường đặc trong việc nhân nhanh phôi vô tính.

1.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp

Quá trình tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá được thực hiện trên môi trường SH với sự kết hợp của NAA và BA. Kết quả cho thấy sự hình thành phôi vô tính đạt hiệu quả cao nhất khi sử dụng 5 mg/L NAA và 0,25 mg/L BA. Điều kiện chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng, với cường độ ánh sáng ~4 là tối ưu. Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy giúp tăng cường sự phát triển của phôi vô tính.

1.2. Nhân phôi vô tính

Nhân phôi vô tính được thực hiện trên cả môi trường đặc và lỏng. Môi trường lỏng SH bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose và 10% nước dừa cho kết quả tốt nhất. Khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), và kích thước phôi ~10 mm là tối ưu. Phương pháp nuôi lỏng lắc giúp tăng sinh khối phôi vô tính một cách hiệu quả.

II. Nghiên cứu rễ bất định

Phần này tập trung vào việc tạo và nhân rễ bất định từ mô lá và chồi của cây Ngũ gia bì chân chim. Mục tiêu là xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định và tối ưu hóa quá trình nhân rễ trong môi trường lỏng. Kết quả cho thấy môi trường ½MS bổ sung 3 mg/L NAA và 30 g/L sucrose là tối ưu cho sự hình thành rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Phương pháp nuôi lỏng lắc cũng được áp dụng để nhân nhanh sinh khối rễ.

2.1. Tạo rễ bất định trực tiếp

Quá trình tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá được thực hiện trên môi trường ½MS với sự bổ sung của NAA. Kết quả cho thấy nồng độ 3 mg/L NAA và 30 g/L sucrose là tối ưu. Điều kiện chiếu sáng cũng ảnh hưởng đáng kể, với cường độ ánh sáng ~4 là tối ưu. Sự hình thành rễ bất định được quan sát và ghi nhận thông qua các kỹ thuật giải phẫu.

2.2. Nhân rễ bất định

Nhân rễ bất định được thực hiện trong môi trường lỏng ½MS bổ sung 2 mg/L NAA và 30 g/L sucrose. Khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v). Sinh khối rễ phát triển nhanh chóng trong giai đoạn 21–35 ngày và đạt mức cao nhất ở ngày thứ 42 sau cấy. Phương pháp nuôi lỏng lắc giúp tăng sinh khối rễ một cách hiệu quả.

III. Ứng dụng công nghệ sinh học

Phần này đánh giá giá trị và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học và thực vật học. Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo và nhân phôi vô tính và rễ bất định của cây Ngũ gia bì chân chim, mở ra tiềm năng ứng dụng trong nhân giống cây trồng và bảo tồn đa dạng sinh học. Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro và nuôi lỏng lắc được chứng minh là hiệu quả và có thể áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về cây trồng khác.

3.1. Giá trị khoa học

Nghiên cứu đóng góp vào việc hiểu biết sâu hơn về cơ chế hình thành phôi vô tính và rễ bất định ở cây Ngũ gia bì chân chim. Các kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các phương pháp nhân giống hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh bảo tồn các loài cây quý hiếm.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng cao trong ngành nông nghiệp và dược liệu. Việc nhân giống thành công phôi vô tính và rễ bất định giúp tăng năng suất và chất lượng cây trồng, đồng thời hỗ trợ việc bảo tồn các loài cây có giá trị kinh tế và dược liệu cao.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Huỳnh Thị Lũy, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Hổ và PGS. Bùi Văn Lệ. Luận án thuộc chuyên ngành Sinh lý học thực vật / Công nghệ sinh học, hoàn thành tại Viện Sinh học nhiệt đới trực thuộc Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong thời gian từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 9 năm 2019 và bảo vệ năm 2022.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms) là loài cây gỗ thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), phân bố ở khu vực Đông Á và Đông Nam Á. Tại Việt Nam, cây phân bố tại nhiều vùng rừng núi và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền cũng như y học hiện đại với các bộ phận lá, vỏ thân, rễ nhỏ dùng làm thuốc. Các nghiên cứu hóa thực vật đã xác định cây chứa hàm lượng phong phú các hợp chất triterpenoid, saponin, tinh dầu có hoạt tính kháng virus (đặc biệt là virus hợp bào hô hấp RSV), ức chế một số dòng tế bào ung thư, giảm đau, kháng viêm và kích thích đông máu.

Trước thời điểm thực hiện đề tài, việc nhân giống loài cây này chủ yếu dừng lại ở phương pháp giâm cành truyền thống hoặc vi nhân giống qua nuôi cấy chồi ngọn, đốt thân in vitro; nghiên cứu rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cũng đã được thử nghiệm (Đặng Thị Thanh Tâm, 2012). Tuy nhiên, trên thế giới và tại Việt Nam chưa ghi nhận công bố nào về quy trình phát sinh hình thái tạo phôi vô tính và tạo rễ bất định cũng như việc nhân sinh khối phôi và rễ trong môi trường lỏng lắc ở loài Schefflera octophylla. Đây là khoảng trống nghiên cứu thực nghiệm cần được giải quyết nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác vi nhân giống quy mô lớn và sản xuất sinh khối thu nhận hoạt chất sinh học.

Mục tiêu nghiên cứu

• Mục tiêu tổng quát: Tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc; tạo được rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc ở cây Ngũ gia bì chân chim.
• Mục tiêu cụ thể:
  1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa, điều kiện chiếu sáng) đến sự tái sinh trực tiếp và gián tiếp phôi vô tính cũng như rễ bất định từ mô lá nuôi cấy in vitro.
  2. Xác định các điều kiện tối ưu (chất điều hòa sinh trưởng, khối lượng cấy, kích thước mẫu, nồng độ đường, cường độ ánh sáng, tỷ lệ nước dừa) để nhân phôi vô tính và nhân sinh khối rễ bất định trong môi trường đặc và môi trường lỏng lắc.
  3. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính và đánh giá khả năng chuyển tiếp ra trồng ở chậu đất ex vitro.
  4. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc đốt thân (cây vườn ươm, cây in vitro) và chồi có nguồn gốc từ phôi vô tính.
  5. Xác định đặc điểm hình thái giải phẫu của phôi vô tính ở các giai đoạn phát triển và nguồn gốc tế bào phát sinh phôi vô tính, rễ bất định thông qua kỹ thuật nhuộm hai màu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Phôi vô tính phát sinh từ nuôi cấy mảnh lá; rễ bất định tái sinh từ mảnh lá và từ các loại chồi có nguồn gốc đốt thân, phôi vô tính của cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla).
• Phạm vi nghiên cứu: Luận án giới hạn trong phạm vi thực nghiệm in vitro tại phòng thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khoáng (MS, ½MS, B5, SH), chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin (NAA, IBA, 2,4-D) và cytokinin (BA), đường sucrose, nước dừa và ánh sáng đến quá trình tạo/nhân phôi và rễ; khảo sát cấu trúc giải phẫu bằng phương pháp nhuộm hai màu. Luận án chưa thực hiện nhân rễ từ chồi bằng nuôi lỏng lắc, chưa nuôi cấy phôi/rễ trong hệ thống bioreactor quy mô lớn và không thu thập số liệu sinh trưởng chi tiết của cây ngoài tự nhiên sau giai đoạn vườn ươm.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trong nước và quốc tế

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu về cây Ngũ gia bì chân chim và các loài liên quan trong họ Araliaceae:

• Thành phần hóa học và dược lý của Schefflera octophylla: Các công bố của Chen và cs. (2015), Sung và cs. (1991, 1992) đã phân lập hơn 40 loại triterpenoid (oleanane, ursane, lupane), asiatic acid và các saponin. Li và cs. (2005, 2007) xác định các dẫn xuất caffeoylquinic acid và triterpenoid sulfate có khả năng ức chế mạnh virus hợp bào hô hấp (RSV). Li và cs. (2009) chiết xuất 27 hợp chất tinh dầu từ lá có hoạt tính ức chế tế bào ung thư MCF-7, A375, Hep G2. Liu và cs. (2019) phát hiện các triterpene nhóm lupane thúc đẩy đông máu. Wu Chun và cs. (2013, 2014) phân lập các saponin heptursosides và heptoleosides có tác dụng kháng viêm. Tại Việt Nam, Trung tâm Sâm Việt Nam phối hợp với Đại học Hiroshima và Viện Poznan xác định 12 glycozid triterpenoid và chứng minh tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, nội tiết tố và kháng viêm.
• Nghiên cứu phôi vô tính ở họ Araliaceae: Trên chi Panax, các nghiên cứu của Arya và cs. (1993), Choi và cs. (2003), Kim và cs. (2012) trên Panax ginseng; Zhou và Brown (2006) trên Panax quinquefolius; Vũ Thị Hiền và cs. (2015), Mai Trường và cs. (2014), Đỗ Mạnh Cường và cs. (2020) trên Panax vietnamensis; Nguyễn Thị Ngọc Hương và cs. (2018) trên Panax stipuleanatus đã thiết lập quy trình tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp qua mô sẹo và nuôi lỏng lắc. Trên chi Acanthopanax (Eleutherococcus), các công bố của Park và cs. (2005), Shohael và cs. (2007) chứng minh khả năng tái sinh phôi từ huyền phù và rễ. Trên chi Polyscias, Sliwinska và cs. (2008) và Tô Thị Nhã Trầm và cs. (2020) nghiên cứu tạo phôi ở đinh lăng lá to và đinh lăng lá nhỏ.
• Nghiên cứu rễ bất định ở họ Araliaceae: Gao và cs. (2005) nuôi cấy rễ bất định Panax notoginseng; Seo và cs. (2003), Lee và Paek (2012) nhân sinh khối rễ Eleutherococcus koreanum trong bioreactor; các nghiên cứu trên sâm Ngọc Linh của Nguyễn Thị Ngọc Hương và cs. (2016) khảo sát phát sinh rễ từ mô sẹo thân rễ.
• Nghiên cứu nuôi cấy mô trên chi Schefflera: Li và cs. (2004) nhân giống in vitro S. octophylla qua chồi ngủ đốt thân và tạo rễ trên môi trường ½MS + 0,2 mg/L NAA + 0,3% than hoạt tính. Các nghiên cứu trên Schefflera arboricola (Misra, 2001), Schefflera leucantha (Chirakiattikun và Prakaisrithongkham, 2004) và Didymopanax morototoni (Franco và cs., 2006) khảo sát vi nhân giống chồi và tạo mô sẹo nhưng chưa ghi nhận tạo phôi vô tính hoàn chỉnh.

Khoảng trống luận án giải quyết

Luận án là công trình đầu tiên xây dựng hoàn chỉnh hai con đường phát sinh hình thái: phát sinh phôi vô tính (trực tiếp từ lá, gián tiếp qua mô sẹo, nhân phôi thứ cấp trong môi trường lỏng lắc) và phát sinh rễ bất định (trực tiếp từ lá, từ chồi và nhân rễ thứ cấp trong môi trường lỏng lắc) trên đối tượng Schefflera octophylla.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency), học thuyết về tế bào tiền xác định sinh phôi PEDC (Pre-Embryogenic Determined Cell) trong con đường trực tiếp và tế bào cảm ứng sinh phôi IEDC (Induced Embryogenic Determined Cell) trong con đường gián tiếp. Khung phân tích quá trình tạo phôi gián tiếp áp dụng mô hình 5 giai đoạn của Von Arnold và cs. (2002). Lý thuyết về sự tích tụ và vận chuyển phân cực auxin (Ahkami và cs., 2013; Guan và cs., 2019, 2020) cùng tỷ lệ tương tác giữa auxin và cytokinin (Michalczuk và cs., 1992; Ribnicky và cs., 1996; Ayil-Gutiérrez và cs., 2013; Gaoyin và cs., 2020) được sử dụng để giải thích sự phản biệt hóa, tái biệt hóa tế bào và cơ chế hình thành rễ, phôi lưỡng cực độc lập hệ mạch.

Mô lá ban đầu (Schefflera octophylla)

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Nguồn mẫu và vật liệu: Mảnh lá cây Ngũ gia bì chân chim in vitro cắt kích thước 10 x 10 mm và 3 x 10 mm; chồi in vitro từ đốt thân vườn ươm, chồi in vitro từ cây con in vitro và chồi tái sinh từ phôi vô tính.
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường khoáng cơ bản MS, ½MS, B5, SH bổ sung đường sucrose (20, 30, 50 g/L), agar (8 g/L đối với môi trường đặc), nước dừa (5%, 10%, 15%, 20% v/v). Các chất điều hòa sinh trưởng gồm auxin (NAA, IBA, 2,4-D) và cytokinin (BA).
• Hệ thống nuôi cấy: Nuôi cấy tĩnh trên môi trường đặc và nuôi cấy lỏng lắc (tốc độ lắc 100–110 vòng/phút). Điều kiện phòng nuôi: nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 60–70%, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ sáng / 8 giờ tối với cường độ ánh sáng 4.000 lux hoặc điều kiện tối hoàn toàn.
• Kỹ thuật hình thái giải phẫu: Mẫu phôi và rễ ở các giai đoạn được cố định trong dung dịch FAA, cắt lát mỏng mô học bằng máy microtome, tiến hành nhuộm kép hai màu Carmine alum (nhuộm nhân/tế bào chất) và Iodine green (nhuộm vách hóa gỗ), quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi soi nổi.
• Xử lý số liệu: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, lặp lại 3–5 lần. Số liệu được thu thập tại các mốc thời gian (21, 30, 45, 60 ngày sau cấy - NSC) và xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng (phân tích ANOVA, kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa p ≤ 0,05).

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày bối cảnh nghiên cứu, tính cấp thiết, mục tiêu tổng quát, 5 mục tiêu cụ thể, đối tượng nghiên cứu, phạm vi thực nghiệm và ý nghĩa khoa học – thực tiễn của đề tài trong việc làm sáng tỏ cơ chế phát sinh hình thái in vitro và tiềm năng cung ứng nguồn vật liệu cho công nghệ sinh học dược liệu.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết đặc điểm sinh học, sinh thái, phân bố học của cây Ngũ gia bì chân chim; chi tiết hóa các thành phần hóa thực vật nhóm triterpenoid, saponin và hoạt tính sinh học từ rễ, thân, lá. Phân tích thực trạng nghiên cứu phát sinh phôi vô tính và rễ bất định trên các chi thực vật thuộc họ Araliaceae (Panax, Acanthopanax, Polyscias, Schefflera, Didymopanax). Đồng thời, chương 1 trình bày cơ sở lý luận sinh lý thực vật về cảm ứng sinh phôi trực tiếp/gián tiếp, sự tích tụ và phân cực auxin, cũng như vai trò của các yếu tố ngoại sinh (khoáng, đường, ánh sáng, chất điều hòa sinh trưởng) lên sự tái phân hóa tế bào.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu lá và đốt thân; quy trình khử trùng mẫu; công thức môi trường khoáng (MS, ½MS, B5, SH); nồng độ và tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng (NAA, IBA, 2,4-D, BA); quy trình bố trí thí nghiệm tạo phôi vô tính trực tiếp, tạo mô sẹo sinh phôi, nhân phôi thứ cấp trên môi trường đặc và lỏng lắc; quy trình tạo rễ trực tiếp từ lá, từ chồi và nhân rễ lỏng lắc. Mô tả chi tiết kỹ thuật vi phẫu, nhuộm hai màu Carmine alum – Iodine green và các công thức toán học tính toán sinh khối tươi/khô, hệ số tăng sinh, tỷ lệ phát sinh phôi/rễ.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

1. Tạo phôi vô tính trực tiếp và gián tiếp từ mô lá

• Tạo phôi trực tiếp: Môi trường SH vượt trội so với MS, ½MS và B5 trong cảm ứng phôi trực tiếp từ mảnh lá. Nồng độ NAA 5 mg/L kết hợp với 0,25 mg/L BA trên nền môi trường SH có 50 g/L sucrose và 10% (v/v) nước dừa, nuôi dưới ánh sáng 4.000 lux cho tỷ lệ phát sinh phôi trực tiếp cao nhất tại thời điểm 60 NSC. Mảnh lá kích thước 10 x 10 mm cho số lượng phôi nhiều hơn mảnh lá 3 x 10 mm.
• Tạo phôi gián tiếp qua mô sẹo: Môi trường SH bổ sung 2 mg/L 2,4-D thích hợp nhất để cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi (MSSP) từ mảnh lá sau 30 NSC. Khối mô sẹo này khi chuyển sang môi trường SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA và 30 g/L sucrose tái sinh phôi vô tính hiệu quả ở 30 NSC.
• Tạo cây con hoàn chỉnh: Phôi vô tính đạt giai đoạn hình lá mầm được cấy chuyển sang môi trường MS hoặc ½MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng, phát triển thành cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ trụ. Cây con in vitro chuyển ra vườn ươm sinh trưởng bình thường trong chậu đất.

2. Nhân phôi vô tính trong môi trường lỏng lắc và đặc điểm giải phẫu

• Nhân phôi trong môi trường lỏng lắc cho hệ số tăng sinh và chất lượng phôi cao hơn môi trường đặc.
• Môi trường tối ưu cho nhân phôi thứ cấp theo cơ chế bất định: nền khoáng SH bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa, cường độ ánh sáng 4.000 lux, chu kỳ cấy chuyền 21–30 NSC. Khối lượng phôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), kích thước cụm phôi cấy thích hợp khoảng 10 mm.
• Giải phẫu mô học nhuộm hai màu khẳng định phôi vô tính sơ cấp và thứ cấp đều trải qua các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm, có cấu trúc lưỡng cực độc lập hoàn toàn với hệ mạch của mô mẹ.

Giai đoạn nuôi cấy	Môi trường khoáng	Chất ĐHST (mg/L)	Sucrose (g/L)	Phụ gia & Điều kiện	Thời gian (NSC)
Cảm ứng phôi trực tiếp	SH	5 NAA + 0,25 BA	50	10% nước dừa, Sáng 4.000 lux	60
Cảm ứng mô sẹo sinh phôi	SH	2 2,4-D	30	Tối hoàn toàn	30
Tái sinh phôi gián tiếp	SH	2 NAA + 0,25 BA	30	Sáng 4.000 lux	30
Nhân phôi lỏng lắc	SH (lỏng)	2 NAA + 0,25 BA	50	10% nước dừa, 2% w/v phôi, 4.000 lux	21–30
Tạo cây con hoàn chỉnh	MS hoặc ½MS	Không bổ sung	30	Sáng 4.000 lux	30–45

3. Cảm ứng tạo rễ bất định từ mô lá và chồi

• Tạo rễ trực tiếp từ lá: Môi trường ½MS đặc bổ sung 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, nuôi dưới điều kiện chiếu sáng 4.000 lux cho tỷ lệ tái sinh rễ trực tiếp từ mảnh lá cao nhất ở 30 NSC. Mảnh lá 10 x 10 mm và 3 x 10 mm đều có khả năng tạo rễ, trong đó rễ phát sinh trực tiếp từ vùng gân lá và mép cắt.
• Tạo rễ bất định từ chồi: Các chồi có nguồn gốc từ đốt thân vườn ươm, chồi cây in vitro và chồi tái sinh từ phôi vô tính (đã cắt bỏ rễ trụ) đều cảm ứng tạo rễ bất định tốt trên môi trường ½MS bổ sung NAA hoặc IBA ở nồng độ 1–3 mg/L tại 30–60 NSC.
• Khảo sát giải phẫu xác định sơ khởi rễ bất định hình thành từ các tế bào nhu mô gần bó mạch dẫn của mô lá, sau đó phát triển mô phân sinh đỉnh rễ và đâm xuyên qua lớp biểu bì ra ngoài.

4. Nhân sinh khối rễ bất định trong môi trường lỏng lắc

• Nhân sinh khối rễ đạt hiệu quả tối ưu trong môi trường lỏng ½MS bổ sung 2 mg/L NAA và 30 g/L sucrose.
• Khối lượng mẫu rễ ban đầu thích hợp là 2% (w/v). Rễ tăng sinh khối thông qua cơ chế phân nhánh hình thành các rễ thứ cấp từ rễ sơ cấp.
• Động học tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian (từ 7 đến 49 NSC): sinh khối rễ tăng trưởng chậm ở 7–14 ngày đầu, tăng trưởng mạnh mẽ trong giai đoạn 21–35 NSC và đạt giá trị sinh khối tươi/khô cực đại tại thời điểm 42 NSC trước khi bước vào pha suy thoái ở 49 NSC.

Chỉ tiêu / Giai đoạn	Môi trường khoáng	Chất ĐHST (mg/L)	Sucrose (g/L)	Mật độ / Kích thước ban đầu	Đặc điểm tăng trưởng / Mốc cực đại
Tạo rễ trực tiếp từ lá	½MS (đặc)	3 NAA	30	Mảnh lá 10x10 mm / 3x10 mm	Hình thành rễ ở 12–20 NSC, đánh giá ở 30 NSC
Tạo rễ từ chồi (đốt thân/phôi)	½MS (đặc)	1–3 NAA / IBA	30	Chồi in vitro / chồi phôi	Tạo rễ hoàn chỉnh ở 30–60 NSC
Nhân sinh khối rễ lỏng lắc	½MS (lỏng)	2 NAA	30	2% (w/v) rễ sơ cấp	Tăng sinh nhánh rễ; đạt sinh khối cực đại tại 42 NSC

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận khoa học

1. Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm đầu tiên về hai con đường phát sinh hình thái: tạo phôi vô tính (trực tiếp, gián tiếp) và tạo rễ bất định (từ mô lá, từ chồi) ở loài Schefflera octophylla.
2. Làm sáng tỏ cơ chế nhân sinh khối phôi và rễ thông qua sự phát sinh phôi thứ cấp và rễ nhánh thứ cấp theo cơ chế bất định trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc.
3. Xác định rõ nguồn gốc tế bào học và đặc điểm cấu tạo giải phẫu của phôi vô tính ở các pha phát triển và sơ khởi rễ bất định từ mô lá thông qua kỹ thuật nhuộm kép hai màu Carmine alum và Iodine green.

Đóng góp về mặt thực tiễn

1. Thiết lập quy trình công nghệ nhân giống vô tính in vitro cây Ngũ gia bì chân chim thông qua hệ thống phôi vô tính, tạo cây con in vitro hoàn chỉnh có khả năng thích nghi và sinh trưởng tốt ở điều kiện vườn ươm ex vitro.
2. Xây dựng quy trình nuôi cấy nhân nhanh sinh khối rễ bất định trong môi trường lỏng lắc, cung cấp nguồn nguyên liệu sinh khối ổn định, độc lập với điều kiện tự nhiên phục vụ công tác chiết xuất các hợp chất thứ cấp nhóm triterpenoid và saponin cho ngành y dược.

Kiến nghị và đề xuất

• Ứng dụng quy trình nhân phôi và nhân rễ bất định trên hệ thống bioreactor sục khí quy mô lớn (pilot) nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận sinh khối.
• Tiến hành phân tích, định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học (đặc biệt là các triterpenoid glycoside và saponin) từ sinh khối rễ và phôi in vitro bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Tiếp tục theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, nông sinh học của cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính ở giai đoạn trồng ngoài đồng ruộng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Chưa thực hiện nghiên cứu nhân sinh khối rễ bất định từ nguồn chồi đốt thân/phôi vô tính trong môi trường lỏng lắc.
• Chưa mở rộng quy mô nuôi cấy phôi vô tính và rễ bất định trên hệ thống khí sinh hoặc ngập chìm tạm thời (bioreactor).
• Chưa tiến hành phân tích định lượng thành phần hoạt chất hóa thực vật tích lũy trong phôi và rễ in vitro so sánh với cây tự nhiên.
• Chưa thu thập dữ liệu sinh trưởng định lượng dài hạn của cây chuyển từ phôi vô tính ngoài đất vườn ươm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Thiết lập thông số vận hành bioreactor (dung tích 5–20 lít) để sản xuất sinh khối rễ bất định và phôi vô tính quy mô bán công nghiệp.
• Ứng dụng các tác nhân kích kháng (elicititor) như methyl jasmonate, acid salicylic hoặc hạt nano nhằm tăng cường sinh tổng hợp saponin và triterpenoid trong nuôi cấy lỏng lắc.
• Đánh giá độ ổn định di truyền của cây tái sinh từ phôi vô tính bằng chỉ thị phân tử (RAPD, ISSR, SSR).

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho các nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên thuộc chuyên ngành Sinh lý học thực vật, Công nghệ sinh học thực vật, Nông nghiệp và Dược liệu học; đồng thời cung cấp cơ sở kỹ thuật cho các viện nghiên cứu, trung tâm ứng dụng công nghệ sinh học và các doanh nghiệp sản xuất giống dược liệu.
• Nội dung giá trị: Các quy trình cảm ứng phát sinh phôi trực tiếp trên môi trường SH, quy trình nuôi cấy lỏng lắc nhân phôi và rễ bất định, cùng bộ ảnh tiêu bản giải phẫu mô học nhuộm hai màu là những tư liệu thực nghiệm có giá trị đối chiếu và ứng dụng trực tiếp trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường và điều kiện tối ưu để cảm ứng phôi vô tính trực tiếp từ mô lá cây Ngũ gia bì chân chim là gì?

Môi trường tối ưu là môi trường khoáng SH bổ sung 5 mg/L NAA kết hợp với 0,25 mg/L BA, 50 g/L đường sucrose và 10% (v/v) nước dừa, nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux (16 giờ sáng/ngày), nhiệt độ 25 ± 2°C; kết quả phát sinh phôi trực tiếp rõ rệt ở 60 ngày sau cấy.

2. Quy trình tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo được thiết lập như thế nào?

Quy trình gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo sinh phôi (MSSP) từ mảnh lá trên môi trường khoáng SH bổ sung 2 mg/L 2,4-D trong điều kiện tối sau 30 ngày; Giai đoạn tái sinh phôi vô tính từ mô sẹo được thực hiện bằng cách chuyển mô sẹo sang môi trường SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA và 30 g/L sucrose dưới ánh sáng 4.000 lux sau 30 ngày nuôi cấy.

3. Các thông số kỹ thuật tối ưu để nhân phôi vô tính trong môi trường lỏng lắc là gì?

Phôi được nhân trong môi trường lỏng SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose và 10% (v/v) nước dừa. Các thông số gồm mật độ cấy ban đầu 2% (w/v), kích thước cụm phôi khoảng 10 mm, tốc độ lắc 100–110 vòng/phút, chiếu sáng 4.000 lux, chu kỳ nuôi cấy tối ưu từ 21 đến 30 ngày sau cấy.

4. Điều kiện cảm ứng và nhân sinh khối rễ bất định từ mô lá được xác định ra sao?

Cảm ứng tạo rễ trực tiếp từ mô lá đạt hiệu quả cao nhất trên môi trường đặc ½MS bổ sung 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, chiếu sáng 4.000 lux ở 30 ngày sau cấy. Nhân sinh khối rễ đạt hiệu quả tối ưu trong môi trường lỏng lắc ½MS có 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, mật độ rễ cấy 2% (w/v); sinh khối tăng trưởng mạnh trong khoảng 21–35 ngày và đạt đỉnh cực đại tại 42 ngày sau cấy.

5. Phương pháp nào được sử dụng để xác định nguồn gốc tế bào và cấu trúc giải phẫu của phôi và rễ?

Luận án sử dụng kỹ thuật vi phẫu cắt lát mỏng mô học và phương pháp nhuộm hai màu Carmine alum (nhuộm tế bào chất và nhân tế bào) kết hợp với Iodine green (nhuộm thành tế bào hóa gỗ), sau đó quan sát và ghi nhận cấu trúc lưỡng cực của phôi và sơ khởi rễ dưới kính hiển vi quang học.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Huỳnh Thị Lũy đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu về phát sinh hình thái in vitro ở cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms). Công trình đã xây dựng thành công quy trình tạo phôi vô tính trực tiếp, gián tiếp, quy trình nhân phôi và nhân sinh khối rễ bất định bằng phương pháp nuôi cấy lỏng lắc với các thông số môi trường, chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng cụ thể. Kết quả nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học về mặt hình thái giải phẫu tế bào học, đồng thời đóng góp cơ sở thực tiễn phục vụ nhân giống vô tính và định hướng sản xuất sinh khối dược liệu quy mô lớn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Mục tiêu tổng quát.

Mục tiêu cụ thể. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Tính mới của đề tài.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Nguồn gốc và phân bố. Đặc điểm sinh học – sinh thái.

Thành phần hóa học và công dụng. Thành phần hóa học. Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Phôi vô tính.

Rễ bất định. Phôi vô tính. Rễ bất định. Schefflera octophylla (Lour.

Schefflera arboricola (Hayata) Merr. Schefflera leucantha Viguier. Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon. Sự phát sinh phôi vô tính.

Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính. Sự hình thành rễ bất định. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định.

Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Nguồn mẫu – Vật liệu nuôi cấy. Tạo vật liệu nuôi cấy ban đầu.

Nội dung nghiên cứu. Tạo phôi vô tính. Nhân phôi vô tính. Tạo rễ bất định.

Nhân rễ bất định. Tạo phôi vô tính. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá.

Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính.

Trồng cây con ở chậu đất. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm). Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm).

Nhân phôi vô tính. Nhân phôi trên môi trường đặc. Nhân phôi trong môi trường lỏng. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc.

Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi.

Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định.

Tạo rễ bất định. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá.

Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá. Tạo rễ bất định từ chồi. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm.

Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ.

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian. Điều kiện nuôi cấy in vitro.

Phương pháp thống kê và xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Tạo phôi vô tính. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá.

Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá.

Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính. Trồng cây con ở chậu đất. Tạo phôi vô tính gián tiếp. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm).

Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm). Nhân phôi vô tính. Nhân phôi trên môi trường đặc. Nhân phôi trong môi trường lỏng.

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi.

Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp.

Tạo rễ bất định. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá.

Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá. Minh họa sự tái sinh rễ trực tiếp và khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp. Tạo rễ bất định từ chồi. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm.

Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ.

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối của rễ. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian. 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.128 TÀI LIỆU THAM KHẢO .130 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AUX Auxin 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2-iP 6-dimethylallylamino purine ABA Abscisic acid BA Benzyl adenine CK Cytokinin ĐC Đối chứng ĐHST Điều hòa sinh trưởng GA3 Gibberellic acid HPLC High-Performance Liquid Chromatography IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid IEDC Induced Embryogenic Determined Cell KNSP Khả năng sinh phôi KLP Khối lượng phôi KLTP Khối lượng tươi phôi LMTB Lát mỏng tế bào MS Murashige và Skoog MSSP Mô sẹo sinh phôi NAA α-Naphthaleneacetic acid NGBCC Ngũ gia bì chân chim NSC Ngày sau cấy PEDC Pre-Embryogenic Determined Cell RSV Respiratory Syncytial Virus RN Rễ nhánh RSC Rễ sơ cấp SCV Settled Cell Volume SEM Scanning Electron Microscope SH Schenk và Hildebrandt T_TCL transverse_Thin Cell layer viii TDZ Thidiazuron TEM Transmission Electron Microscope TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid VDC Vein-Derived Cell WPM Woody Plant Medium ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.

Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ở 60 NSC. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá, ở môi trường SH, 60 NSC. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường SH, 60 NSC.

Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năng sinh phôi, ở môi trường SH, 30NSC. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC. Ảnh hưởng của NAA và BA đến tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trên môi trường đặc SH, 30 NSC.

Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự hình thành phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi trong môi trường lỏng SH, 30 NSC. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 21 NSC. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường ½MS, 30 NSC. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm, ở môi trường ½MS, 60 NSC .