mở đầu cho các kĩ thuật lai và dung hợp tế bào vào những năm 1970 [20]. Bên cạnh đó, khả năng biến nạp của tế bào thực vật được đề xuất vào năm 1965 cho dù chúng gây ra nhiều tranh cãi về khả năng xâm nhập và biểu hiện cũng như tồn tại lâu dài của ADN ngoại lai. Nhờ các plasmid, hàng loạt gene ngoại lai được chuyển vào nhiều họ thực vật. Các phương pháp để đưa gene ngoại lai vào tế bào thực vật cũng trở nên đa dạng với những kĩ thuật hiện đại như sử dụng điện (electroporation), kĩ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới ứng dụng và phát triển bên cạnh kĩ thuật chuyển gen truyền thốngbằng vi khuẩn Agrobacterium [16].
Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống cây trồng và phục tráng cây trồng với thí nghiệm của Morel (1960) trên các loài địa lan (Cymbidium). Với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậc cao.
Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được chuẩn bị trong giai đoạn trước. Ở Việt Nam, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại. Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lí luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp. Nguyên lý và ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.
Cơ sở lí thuyết Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô-tế bào là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt (1902), tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [42].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực chất là kết quả của các quá trình biệt hóa và phản biệt hóa. Tất cả tế bào trong cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Ngược lại với quá trình biệt hóa, phản biệt hóa là quá trình tế bào đã phân hóa chuyển ngược về dạng phôi sinh và tái phân chia.Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen.
Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một quá trình định sẵn [9].
Trong môi trường nuôi cấy phù hợp, có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, tế bào soma được kích thích giải biệt hóa thành tế bào toàn năng và phân chia tế bào tạo thành cụm mô sẹo. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa. Sự phát sinh mô sẹo phụ thuộc chủ yếu vào tình trạng sinh lí của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sau khi tế bào phân chia và tăng sinh khối, quá trình biệt hóa bắt đầu và có sự xuất hiện các con đường trao đổi chất 14 z dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [17].
Sự biệt hóa tế bào hình thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ [29]. Khả năng hình thành chồi phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng, trong đó, tỷ lệ cytokinin/auxin từ 10–100 đóng vai trò quyết định. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi, tuy nhiên sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng hoặc có cytokinin và không có auxin. Ngược lại, quá trình tạo rễ cần auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng.
Để tạo ra rễ thường dùng phlorolgucinol + IBA có hiệu quả hơn chỉ dùng auxin [6]. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào có những ưu điểm đáng lưu ý như (1) Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao; (2) tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc; (3) Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao; (4) Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội); (5) Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen; (6) Có khả năng sản xuất quanh năm; (7) Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém và (8) Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36-1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà.Trong công tác giống cây trồng, vấn đề chất lượng và số lượng giống được quan tâm hàng đầu. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus bởi (1) Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập; (2) Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus và (3) Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus[16], [17]. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô – tế bào cũng có những nhược điểm nhất định, trong đó yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao, nên thường chỉ được áp dụng đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác.
Hơn nữa, cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm 15 z sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm cũng là một trở ngại lớn. Bên cạnh đó, khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền mô sẹo hay huyền phù tế bào nhiều lần và cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt trong quá trình chuyển cây ra thực địa. Phương pháp nuôi cấy mô-tế bàođang được sử dụng để phục vụ cho những mục đích nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo, các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh và nhiều giống cây kinh tế khác. Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ.
Qua đó, cũng có hai phương pháp tương ứng để tái sinh cây con, bao gồm tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng và tái sinh gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. Trong tái sinh trực tiếp, cây con được tạo thành bởi quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ.
Ngược lại, tái sinh gián tiếp không tạo thành cây ngay mà thông qua quá trình phát triển thành khối mô sẹo. Hệ số nhân của hướng này vô cùng lớn bởi từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kĩ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Tuy nhiên, nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền do quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo thường xuất hiện đột biến gen, gây ra bởi hiện tượng nội nguyên phân, là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống.
Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lí tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen.