Chương 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Đại cương về nuôi cấy mô – tế bào 1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô – tế bào thực vật Tính toàn năng cùng với sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào là cơ sở lý luận của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào.Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.
Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [2], [12]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau.
Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 Về bản chất thì quá trình phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh.
Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân hóa sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn. Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1. Trên thế giới - Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930) Haberlandt (1902) – nhà sinh lý thực vật học người Đức là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [12].
Tuy nhiên ông đã không thành công trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào khí khổng. - Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950) Giai đoạn này bắt đầu năm 1934 với công trình của White (Mỹ). Ông đã nuôi cấy thành công rễ cà chua (Lycopersicum esculanum) trên môi trưởng lỏng chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men. Năm 1935, Thimann đã phát hiện ra Auxin (IAA) trong mô thực vật.
Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các Vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy và thu được kết quả tốt. Cũng trong thời gian này, Gautheret (Pháp) đã nghiên cứu nuôi cấy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 mô tượng tầng một số cây thân gỗ. Trong những năm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin (NAA, 2,4D) được tổng hợp thành công và được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô cùng với nước dừa. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, thúc đẩy tế bào phân chia rõ rệt [2].
- Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 - 1960) Năm 1954 – 1955, Skoog và Miller (Mỹ) trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã xác định được vai trò của Kinetin trong sự kích thích phát triển của mô. Năm 1956, Skoog và Miller đã tìm hiểu ảnh hưởng của tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ mô cây thuốc lá nuôi cấy. Năm 1956, Nickell đã nuôi thành công tế bào đơn của đậu (Phaseolus vulgaris) trong dịch lỏng. Năm 1960, Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng (còn gọi là kỹ thuật gieo tế bào) [2], [14].
- Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật (từ 1960 đến nay) Năm 1960, Cooking (Anh) đã dùng enzym Cellulase để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào không vỏ, còn gọi là tế bào trần (protoplast). Nitsh (1967), Nakata và Tanaka (1968) tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn. Nakata và Tanaka (1970 - 1971) cho các protoplast thuốc lá tái tạo vỏ Cellulose, tế bào mới phân chia tạo nên quần lạc tế bào trong môi trường lỏng và sau đó tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1977, Melchers dung hợp protoplast giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai khoai tây – cà chua “Pomate”.
Từ năm 1965, Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở tế bào, thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai, ADN LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 ngoại lai sau khi vào trong tế bào sẽ gắn với ADN nội bào. ADN ngoại lai vào trong tế bào thực vật, đặc biệt là trong tế bào trần, chúng không bị các nuclease của tế bào chủ phân hủy. Từ năm 1980, hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học (công nghệ gen) đã được công bố. Ngày nay nuôi cấy mô – tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại, là công cụ quan trọng trong chọn tạo và nhân giống hiện đại mà còn đóng góp những cơ sở lý luận mới cho sinh học hiện đại.
Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô – tế bào thực vật ở Việt Nam Nuôi cấy mô – tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do PGS. Lê Thị Muội đứng đầu. Phòng đã nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast.
Thành công đầu tiên về nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và cs, 1978; Lê Thị Xuân và cs. Tiếp đó là thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981). Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây.
Đến nay, nước ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào ở các viện nghiên cứu (viện Di truyền Nông nghiệp, viện Rau quả Trung ương, .); các trường đại học (Đại học Nông nghiệp I, Đại học Lâm nghiệp, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,.); một số tỉnh và cơ sở sản xuất LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 cây giống nông – lâm nghiệp (Yên Bái, Hưng Yên, Bình Định, Đà Lạt, Quảng Ninh, Hòa Bình, Phú Thọ,.) Đối tượng cây giống sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật cũng được mở rộng như: bạch đàn, keo, dó trầm, lan, cúc,.Thành tựu nuôi cấy mô – tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật đã thành công với hàng loạt các cây trồng như: cây ăn quả, cây lương thực, cây công nghiệp, cây thuốc, hoa. và các loại cây quý hiếm có giá trị cao. Ở nước ta, các hướng nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật được phát triển mạnh từ những năm 1980 và đã đạt được những kết quả đáng khích lệ trong lĩnh vực nhân giống in vitro: nhân giống khoai tây, dứa, chuối, mía; một số loài hoa như: phong lan, đồng tiền, cúc, cẩm chướng; một số cây lâm nghiệp như: bạch đàn, keo.; các cây dược liệu như: thông đỏ, thanh hao [12]. Với cây công nghiệp, chúng ta đã ứng dụng thành công phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần giải quyết nhu cầu nguyên liệu đối với một số cây trồng trọng điểm như: dứa Cayen, mía.theo phương pháp nhân cụm chồi của Mapes (1974).
Với cây lương thực, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) tạo được cây khoai tây sạch virus, lập được ngân hàng giống khoai tây hay nuôi cấy bao phấn lúa tạo cây đơn bội [2], [12], [15]. Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng kháng bệnh, chọn dòng chịu muối, chịu mất nước. Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang được phát triển. Nuôi cấy mô – tế bào còn được ứng dụng để nhân các cây chuyển gen nhằm tạo ra nhiều cây trồng chuyển gen với những đặc tính mong muốn như: tính kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng côn trùng, kháng thuốc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 diệt cỏ, kháng kim loại nặng và chống băng giá, chống hạn.
đã thành công trên nhiều đối tượng như lúa, bông. Đến nay, nuôi cấy mô – tế bào thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của công nghệ sinh học hiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp thực vật, công nghệ tạo giống và nhân nhanh giống hiện đại. Nhân giống vô tính in vitro 1.