Nghiên Cứu Tái Sinh Giống Cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) Chất Lượng Cao Bằng Kỹ Thuật In Vitro

Nghiên cứu tái sinh cây đinh lăng polyscias fruticosa l harms chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro, mở ra hướng đi mới trong nông nghiệp.

• Tác giả: Ma Kiên Chương
• Người hướng dẫn: ThS. Vi Đại Lâm
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tái Sinh Giống Cây Đinh Lăng Chất Lượng Cao Bằng Kỹ Thuật In Vitro
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về cây Đinh lăng
• 2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng
• 2.3. Nguồn gốc và phân bố
• 2.4. Giá trị của cây Đinh lăng
• 2.5. Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nước
• 2.6. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.6.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật
• 3. PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5. Xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Kết quả ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu Đinh lăng
• 4.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu
• 4.3. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy
• 4.4. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl2 (0,1%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy
• 4.5. Kết quả của một số chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng
• 4.6. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi
• 4.7. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi
• 4.8. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi
• 4.9. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Tái Sinh Giống Đinh Lăng In Vitro

Nghiên cứu tái sinh giống đinh lăng in vitro mở ra hướng đi mới cho việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý. Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) từ lâu đã được biết đến với nhiều công dụng trong y học cổ truyền. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống truyền thống gặp nhiều hạn chế về số lượng, chất lượng và nguy cơ sâu bệnh. Kỹ thuật nhân giống đinh lăng in vitro khắc phục những nhược điểm này, tạo ra cây đinh lăng giống sạch bệnh, đồng đều và có năng suất cao. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô đinh lăng, từ khâu chọn lọc vật liệu đến giai đoạn ra rễ và thuần hóa cây con. Mục tiêu là xây dựng quy trình nhân giống vô tính đinh lăng hiệu quả, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.

1.1. Giới thiệu về cây Đinh Lăng dược liệu Polyscias fruticosa

Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) thuộc họ Ngũ gia bì, là cây dược liệu quý có nguồn gốc từ vùng Thái Bình Dương. Đinh lăng lá nhỏ là loài phổ biến nhất, được sử dụng rộng rãi trong y học. Rễ và lá cây chứa nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là saponin. Ứng dụng của cây đinh lăng rất đa dạng, từ tăng cường sức khỏe đến hỗ trợ điều trị bệnh. Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy chiết xuất đinh lăng chứa nhiều acid amin và vitamin quan trọng.

1.2. Tầm quan trọng của việc tái sinh giống cây trồng chất lượng

Tái sinh cây trồng chất lượng cao đóng vai trò then chốt trong việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Việc sử dụng cây giống chất lượng cao giúp giảm thiểu rủi ro sâu bệnh, tăng khả năng thích ứng với điều kiện môi trường. Nhân giống đinh lăng số lượng lớn bằng phương pháp in vitro đảm bảo nguồn cung ổn định cho thị trường. Ưu điểm nhân giống in vitro so với phương pháp truyền thống là tạo ra cây giống đồng đều, sạch bệnh và giữ nguyên đặc tính di truyền của cây mẹ. Tiêu chuẩn giống đinh lăng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

II. Thách Thức Trong Nhân Giống Đinh Lăng Truyền Thống

Phương pháp nhân giống đinh lăng truyền thống, chủ yếu bằng giâm cành, đối mặt với nhiều thách thức. Tỷ lệ sống của cành giâm không cao, thời gian sinh trưởng kéo dài và chất lượng cây giống không đồng đều. Nguy cơ lây nhiễm bệnh từ cây mẹ sang cây con là rất lớn, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng dược liệu. Hệ số nhân giống thấp khiến cho việc đáp ứng nhu cầu thị trường trở nên khó khăn. Do đó, việc tìm kiếm giải pháp nhân giống vô tính đinh lăng hiệu quả hơn là vô cùng cần thiết. Kỹ thuật nhân giống vô tính như nuôi cấy mô tế bào hứa hẹn giải quyết những vấn đề này, mang lại nguồn cây đinh lăng giống F1 chất lượng cao.

2.1. Hạn chế về số lượng và chất lượng cây giống đinh lăng

Phương pháp giâm cành thường cho tỷ lệ thành công thấp, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết và kỹ thuật chăm sóc. Chất lượng giống cây đinh lăng không đồng đều, ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng dược chất. Bệnh hại trên cây đinh lăng dễ dàng lây lan qua cành giâm, gây thiệt hại kinh tế cho người trồng. Nhân giống đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào giúp khắc phục những hạn chế này, tạo ra giống đinh lăng sạch bệnh và đồng đều.

2.2. Nguy cơ lây nhiễm bệnh và thoái hóa giống cây trồng

Cây giống từ cành giâm dễ bị nhiễm các bệnh do nấm, vi khuẩn và virus gây ra. Việc sử dụng cành giâm từ cây mẹ bị thoái hóa dẫn đến chất lượng cây con kém. Nhân giống đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào giúp loại bỏ hoàn toàn nguy cơ lây nhiễm bệnh, đảm bảo chất lượng giống cây đinh lăng cao nhất. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô cần được trang bị đầy đủ thiết bị và tuân thủ nghiêm ngặt quy trình vô trùng.

III. Phương Pháp In Vitro Giải Pháp Tái Sinh Đinh Lăng Ưu Việt

Phương pháp in vitro, hay nuôi cấy mô tế bào, là giải pháp hiệu quả để tái sinh giống đinh lăng chất lượng cao. Kỹ thuật này cho phép nhân giống đinh lăng với số lượng lớn trong thời gian ngắn, tạo ra cây đinh lăng giống sạch bệnh và đồng đều. Quy trình nhân giống đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào bao gồm nhiều giai đoạn, từ khử trùng mẫu cấy đến ra rễ và thuần hóa cây con. Việc tối ưu hóa các yếu tố như môi trường dinh dưỡng, hormone sinh trưởng và điều kiện ánh sáng là rất quan trọng để đạt được hiệu quả cao nhất. Giá thể nhân giống đinh lăng in vitro cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây con.

3.1. Quy trình nhân giống đinh lăng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Quy trình bắt đầu bằng việc chọn lọc và khử trùng mẫu cấy, thường là chồi ngọn hoặc đoạn thân. Mẫu cấy được đưa vào môi trường dinh dưỡng đặc biệt, chứa các chất điều hòa sinh trưởng để kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Hormone sinh trưởng trong nhân giống in vitro đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển quá trình phát sinh hình thái của cây. Cây con sau khi ra rễ được chuyển sang giai đoạn thuần hóa trước khi trồng ra ngoài đồng ruộng. Quy trình nhân giống đinh lăng cần được thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh nhiễm bệnh.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy mô đinh lăng

Môi trường dinh dưỡng, bao gồm các chất khoáng, vitamin và đường, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây. Hormone sinh trưởng như auxin và cytokinin ảnh hưởng đến quá trình tạo chồi và rễ. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm cũng là những yếu tố cần được kiểm soát chặt chẽ. Giá thể nhân giống đinh lăng in vitro cần đảm bảo độ thoáng khí và khả năng giữ ẩm tốt. Việc tối ưu hóa các yếu tố này giúp tăng hiệu quả nhân giống đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

3.3. Khử trùng mẫu cấy và phòng ngừa ô nhiễm trong in vitro

Khử trùng mẫu cấy là bước quan trọng để loại bỏ các vi sinh vật gây ô nhiễm. Các chất khử trùng thường được sử dụng bao gồm cồn, thuốc tím và HgCl2. Thời gian và nồng độ khử trùng cần được điều chỉnh phù hợp để không gây hại cho mẫu cấy. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô cần được vệ sinh thường xuyên và trang bị hệ thống lọc không khí để đảm bảo điều kiện vô trùng. Việc tuân thủ nghiêm ngặt quy trình vô trùng là yếu tố then chốt để thành công trong nhân giống đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

IV. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Chất Điều Tiết Sinh Trưởng Đinh Lăng

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi của cây đinh lăng trong điều kiện in vitro. Các chất điều tiết sinh trưởng như Kinetin, BAP, IAA và IBA được sử dụng với các nồng độ khác nhau để xác định công thức tối ưu cho việc nhân giống đinh lăng. Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa BAP và IBA mang lại hiệu quả tái sinh chồi cao nhất. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô đinh lăng, góp phần nâng cao hiệu quả nhân giống vô tính đinh lăng.

4.1. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi

Kinetin là một loại cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và phát triển chồi. Nghiên cứu cho thấy Kinetin có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi của cây đinh lăng trong điều kiện in vitro. Tuy nhiên, hiệu quả của Kinetin phụ thuộc vào nồng độ sử dụng và sự kết hợp với các chất điều tiết sinh trưởng khác. Việc xác định nồng độ Kinetin tối ưu là rất quan trọng để đạt được hiệu quả tái sinh chồi cao nhất.

4.2. Tác động của BAP đến quá trình hình thành chồi đinh lăng

BAP (Benzylaminopurine) là một loại cytokinin phổ biến được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào. BAP có tác dụng kích thích sự phát triển chồi và tăng số lượng chồi trên một mẫu cấy. Nghiên cứu cho thấy BAP có tác động tích cực đến quá trình hình thành chồi của cây đinh lăng trong điều kiện in vitro. Việc kết hợp BAP với các auxin như IAA hoặc IBA có thể tăng cường hiệu quả tái sinh chồi.

4.3. Sự kết hợp giữa BAP và IAA IBA trong tái sinh chồi

Sự kết hợp giữa BAP và IAA (Indole-3-acetic acid) hoặc IBA (Indole-3-butyric acid) thường được sử dụng để cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy mô. IAA và IBA là các auxin có tác dụng kích thích sự phát triển rễ và kéo dài chồi. Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa BAP và IBA mang lại hiệu quả tái sinh chồi cao nhất cho cây đinh lăng trong điều kiện in vitro. Việc tối ưu hóa tỷ lệ BAP/IBA là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Triển Vọng Của Giống Đinh Lăng

Việc tái sinh giống đinh lăng chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro mở ra nhiều cơ hội ứng dụng thực tiễn. Cây đinh lăng giống sạch bệnh, đồng đều và có năng suất cao có thể được cung cấp cho người trồng, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế. Nhân giống đinh lăng số lượng lớn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường dược liệu. Trong tương lai, kỹ thuật in vitro có thể được sử dụng để tạo ra các giống đinh lăng mới có năng suất và chất lượng cao hơn.

5.1. Cung cấp cây giống đinh lăng chất lượng cao cho thị trường

Cơ sở sản xuất giống đinh lăng uy tín có thể sử dụng kỹ thuật in vitro để sản xuất cây đinh lăng giống chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu của thị trường. Giống đinh lăng sạch bệnh giúp giảm thiểu rủi ro cho người trồng và đảm bảo năng suất cao. Nhân giống đinh lăng số lượng lớn giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường dược liệu.

5.2. Nâng cao hiệu quả kinh tế cho người trồng đinh lăng

Việc sử dụng cây đinh lăng giống chất lượng cao giúp tăng năng suất và chất lượng dược liệu, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế cho người trồng. Kỹ thuật trồng và chăm sóc đinh lăng cần được áp dụng đúng cách để đạt được kết quả tốt nhất. Phân bón cho cây đinh lăng cần được sử dụng hợp lý để đảm bảo sự phát triển khỏe mạnh của cây.

5.3. Nghiên cứu và phát triển các giống đinh lăng mới

Kỹ thuật in vitro có thể được sử dụng để tạo ra các giống đinh lăng mới có năng suất và chất lượng cao hơn. Nghiên cứu tái sinh cây trồng cần được tiếp tục để cải thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và tạo ra các giống đinh lăng kháng bệnh tốt hơn. Ứng dụng của cây đinh lăng trong y học và công nghiệp cần được tiếp tục nghiên cứu và phát triển.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Đinh Lăng

Nghiên cứu tái sinh giống đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro đã đạt được những kết quả khả quan. Việc xác định được công thức môi trường và chất điều tiết sinh trưởng tối ưu cho phép nhân giống đinh lăng với hiệu quả cao. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô tế bào, giảm chi phí sản xuất và tạo ra các giống đinh lăng có chất lượng vượt trội. Nghiên cứu này góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý của Việt Nam.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và đánh giá tiềm năng

Nghiên cứu đã xác định được công thức môi trường và chất điều tiết sinh trưởng tối ưu cho việc nhân giống đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro. Kết quả cho thấy tiềm năng lớn của kỹ thuật này trong việc cung cấp cây đinh lăng giống chất lượng cao cho thị trường. Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện quy trình và giảm chi phí sản xuất.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về nhân giống đinh lăng

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình thuần hóa cây con sau khi ra rễ. Cần nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của cây đinh lăng trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu về bệnh hại trên cây đinh lăng và các biện pháp phòng ngừa cũng rất quan trọng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias fruticosa (L.) Harms, thuộc chi Polyscias, họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Đây là loài cây bụi có nguồn gốc từ vùng quần đảo Polynesia (Thái Bình Dương), phân bố tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tại Việt Nam, loài Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và dược liệu học hiện đại nhờ chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao. Các nghiên cứu hóa học thực vật cho thấy rễ và lá Đinh lăng chứa các saponin triterpen (có khung aglycon và acid oleanolic tương tự saponin trong Nhân sâm), polyacetylen (panaxynol, panaxydol, heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,4-diol...), 20 loại acid amin (trong đó có lysine, methionine, tryptophan, cysteine), các alkaloid, glycosid, phytosterol cùng các vitamin tan trong nước như B1, B2, B6 và C. Về mặt dược lý, Đinh lăng có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng trọng lượng, tăng lực, cải thiện trí nhớ, tăng sức dẻo dai, chống stress, kháng viêm, hạ cholesterol và lipid toàn phần trong huyết thanh, đồng thời kháng các chủng vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus.

Trong thực tiễn sản xuất, nguồn cây giống Đinh lăng hiện nay chủ yếu được nhân bằng phương pháp giâm hom truyền thống. Phương pháp này bộc lộ nhiều hạn chế: hệ số nhân giống thấp, cây con không có độ đồng đều cao, dễ tích tụ và truyền mầm bệnh qua các thế hệ, không đáp ứng đủ nhu cầu giống chất lượng cao cho thị trường và vùng trồng dược liệu quy mô lớn. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) là giải pháp công nghệ sinh học cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch bệnh, duy trì ổn định các đặc tính di truyền ưu việt từ cây mẹ trong thời gian ngắn và không bị phụ thuộc vào điều kiện thời tiết tự nhiên.

Nhằm giải quyết các yêu cầu thực tiễn đó, đề tài khóa luận "Nghiên cứu tái sinh giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro" được thực hiện với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu:
  1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro.
  2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng.
• Yêu cầu/Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Xác định ảnh hưởng của các loại hóa chất khử trùng (H2O2, viên khử trùng Johnson, HgCl2) ở các mốc thời gian xử lý khác nhau đến tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm và mẫu chết do hóa chất.
  2. Xác định ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đơn lẻ thuộc nhóm Cytokinin (Kinetin, BAP) và sự phối hợp giữa Cytokinin với Auxin (BAP kết hợp IAA, BAP kết hợp IBA) đến tỷ lệ bật chồi, hệ số bật chồi và chất lượng chồi tái sinh.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: Đỉnh sinh trưởng và đoạn chồi bánh tẻ mang mầm ngủ của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) đang sinh trưởng phát triển tốt.
  • Phạm vi không gian: Mẫu vật liệu thu thập tại tỉnh Thái Nguyên; các thí nghiệm nuôi cấy mô được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô, Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự Sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ ngày 01/12/2014 đến ngày 31/05/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và cơ sở khoa học

Khóa luận xây dựng trên các nguyên lý sinh học thực nghiệm và công nghệ tế bào thực vật:

• Tính toàn năng của tế bào thực vật (Totipotency): Dựa trên luận điểm khởi xướng của Haberlandt (1902) và sinh học hiện đại (Nguyễn Đức Thành, 2002), mỗi tế bào thực vật đã phân hóa vẫn mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể và có tiềm năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được cung cấp điều kiện dinh dưỡng và ngoại cảnh thích hợp.
• Quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào: Theo Nguyễn Quang Thạch (2015), tế bào chuyên hóa có khả năng phản phân hóa trở lại trạng thái phôi sinh dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng, từ đó phân hóa thành các cơ quan mới (tạo chồi, tạo rễ). Nuôi cấy mô tế bào thực chất là quá trình điều khiển có định hướng sự phát sinh hình thái thông qua cân bằng hormone nội sinh và ngoại sinh.
• Quy trình kỹ thuật 5 giai đoạn nhân giống in vitro (Ngô Xuân Bình, 2003): Bao gồm (1) Chuẩn bị mẫu và khử trùng tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu, (2) Tái sinh mẫu nuôi cấy, (3) Nhân nhanh chồi, (4) Tạo cây hoàn chỉnh ra rễ, và (5) Huấn luyện chuyển cây con ra môi trường đất vườn ươm. Trọng tâm của đề tài tập trung vào giai đoạn 1 và giai đoạn 2.
• Môi trường dinh dưỡng cơ bản: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) được sử dụng làm nền, bổ sung muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin nhóm B (B1, B3, B6), Myo-inositol, nguồn carbon (đường saccharose 30 g/l), chất tạo gel làm đông môi trường (agar 6,5 g/l), duy trì pH trong khoảng 5,6 - 5,8.
• Chất điều hòa sinh trưởng: Nhóm Cytokinin (Kinetin, 6-Benzylaminopurine - BAP) có vai trò kích thích phân bào, giải phóng chồi nách khỏi ưu thế đỉnh ngọn; nhóm Auxin (Indole-3-acetic acid - IAA, Indole-3-butyric acid - IBA) có vai trò phối hợp kích thích phân chia mô và định hướng hình thái.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Đề tài sử dụng phương pháp bố trí thí nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm (in vitro):

• Quy trình khử trùng mẫu cấy: Cành Đinh lăng non được cắt bỏ lá, rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy, phun cồn và đưa vào tủ cấy vô trùng. Mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn mang mắt ngủ, nhúng cồn 70° trong 30 giây đến 1 phút, tráng 1 - 2 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó ngâm lắc trong các dung dịch hóa chất khử trùng theo các mức thời gian thí nghiệm, cuối cùng tráng sạch bằng nước cất vô trùng 4 - 5 lần trước khi cấy vào môi trường.
• Bố trí thí nghiệm vô trùng mẫu: Thiết kế ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), nhắc lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu (tổng 60 mẫu/công thức). Các chất khử trùng thử nghiệm gồm: H2O2 (5%), viên khử trùng Johnson (2,5 ppm), và HgCl2 (0,1%) với các khoảng thời gian 5, 10, 15, 20 phút (đối chứng không xử lý hóa chất). Theo dõi và thu thập số liệu sau 20 ngày nuôi cấy: tỷ lệ mẫu sạch (%), tỷ lệ mẫu nhiễm (%), tỷ lệ mẫu chết do độc tính hóa chất (%).
• Bố trí thí nghiệm tái sinh chồi: Cấy mắt ngủ vào môi trường MS cơ bản (bổ sung 30 g/l saccharose, 6,5 g/l agar, 0,1 g/l myo-inositol, pH = 5,6 - 5,8). Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), nhắc lại 3 lần, 30 mẫu/lần nhắc lại.
  • Thí nghiệm đơn yếu tố: Kinetin ở các nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l; BAP ở các nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l.
  • Thí nghiệm kết hợp: Sử dụng nồng độ Cytokinin tối ưu nhất làm nền, bổ sung kết hợp IAA hoặc IBA ở các nồng độ 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 mg/l.
  • Chỉ tiêu theo dõi sau 30 - 35 ngày: Tỷ lệ mẫu bật chồi (%), hệ số bật chồi (số chồi thu được/số chồi đưa vào), đánh giá phẩm chất chồi theo thang định tính (+: xấu, ++: trung bình, +++: tốt).
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thu thập, tính toán giá trị trung bình trên phần mềm Microsoft Excel và phân tích phương sai, kiểm định sai khác trung bình bằng phép thử LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ cùng hệ số biến động CV(%) trên phần mềm chuyên dụng IRISTAT.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần 1 trình bày tính cấp thiết của việc nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) phục vụ nhu cầu làm thuốc bồi bổ và dược liệu điều trị trong y học cổ truyền và hiện đại. Tác giả chỉ ra nhược điểm của nhân giống bằng hom truyền thống (hệ số nhân thấp, không sạch bệnh, chất lượng giống không đồng đều) và đặt ra yêu cầu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro. Mục tiêu cụ thể là xác định hóa chất, thời gian khử trùng tối ưu để tạo mẫu sạch và tìm ra môi trường bổ sung chất điều tiết sinh trưởng phù hợp nhằm đạt tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất. Khóa luận nêu rõ ý nghĩa khoa học trong việc bổ sung dẫn liệu công nghệ tế bào cho cây dược liệu và ý nghĩa thực tiễn trong việc cung cấp quy trình sản xuất giống Đinh lăng thương mại số lượng lớn.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Phần này tổng hợp các công trình nghiên cứu về cây Đinh lăng và cơ sở lý luận công nghệ tế bào thực vật:

• Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học: Phân loại khoa học của Polyscias fruticosa, hình thái cây bụi, lá kép 3 lần lông chim, rễ củ. Tổng hợp các dẫn liệu về 11 saponin triterpen (polysioside A-H), 5 hợp chất polyacetylen (panaxydol, panaxynol...), 20 acid amin và các nhóm vitamin. Dẫn chứng các thử nghiệm dược lý của Viện Y học Quân sự Việt Nam (1961, 1964) chứng minh tác dụng tăng dẻo dai cơ thể của Đinh lăng ở liều 0,23 - 0,50 g/ngày.
• Tình hình nghiên cứu in vitro cây Đinh lăng trong nước: Trích dẫn công trình của Nguyễn Ngọc Dung (1998) tạo chồi từ mô phân sinh trên môi trường MS bổ sung BAP 2,0 mg/l; nghiên cứu của Trần Thị Liên và cs (2005) tái sinh qua tạo phôi soma trên môi trường MS bổ sung vitamin Morel và 10% nước dừa; nghiên cứu của Lê Thiên Thư và cs (2005) về tạo mô sẹo trên môi trường MS có 2,0 mg/l 2,4-D.
• Cơ sở khoa học và các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy in vitro: Lịch sử phát triển ngành nuôi cấy mô (Haberlandt, White, Gautheret, Skoog...), bản chất tính toàn năng, phân hóa và phản phân hóa tế bào, vai trò của điều kiện vật lý (nhiệt độ 25 - 28°C, chiếu sáng 12 - 18 giờ/ngày với cường độ 1000 - 2500 lux, độ ẩm 100%), thành phần môi trường MS, vai trò của khoáng đa - vi lượng, vitamin, nguồn carbon, agar, pH và đặc tính sinh lý của các nhóm Auxin, Cytokinin, Gibberellin.

Phần 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Phần 3 quy định chi tiết địa điểm, thời gian nghiên cứu (12/2014 - 05/2015 tại Viện Khoa học Sự Sống - ĐH Nông Lâm Thái Nguyên), thiết bị thí nghiệm (nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, cân phân tích) và hóa chất sử dụng. Trình bày chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu chồi bánh tẻ, các công thức thí nghiệm khử trùng bề mặt (H2O2 5%, Johnson 2,5 ppm, HgCl2 0,1%) với 4 mức thời gian (5, 10, 15, 20 phút) và các công thức nuôi cấy tái sinh chồi bổ sung Kinetin (0 - 2,0 mg/l), BAP (0 - 2,0 mg/l), BAP phối hợp IAA (0 - 0,4 mg/l), BAP phối hợp IBA (0 - 0,4 mg/l). Nêu rõ công thức tính toán tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ bật chồi, hệ số bật chồi và phương pháp xử lý thống kê bằng IRISTAT.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được qua các bảng số liệu, biểu đồ và hình ảnh hình thái chồi:

1. Hiệu quả vô trùng mẫu cấy Đinh lăng

Thí nghiệm so sánh ba loại hóa chất khử trùng bề mặt ở các thời gian xử lý từ 5 đến 20 phút:

Hóa chất khử trùng	Nồng độ	Thời gian (phút)	Tổng mẫu (chồi)	Tỷ lệ mẫu sạch (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu chết do hóa chất (%)	Chỉ số thống kê
Đối chứng (CT1)	0	5	60	0,00	100,00	0,00	-
H2O2 (CT2)	5%	5	60	26,67*	65,00	8,33	LSD0,05 = 5,43
H2O2 (CT3)	5%	10	60	33,33*	51,67	15,00	CV% = 9,6
H2O2 (CT4)	5%	15	60	48,33*	33,33	18,33	(Tối ưu nhóm H2O2)
H2O2 (CT5)	5%	20	60	41,67*	31,67	26,67
Johnson (CT2)	2,5 ppm	5	60	18,33*	68,33	13,33	LSD0,05 = 3,44
Johnson (CT3)	2,5 ppm	10	60	21,67*	58,33	20,00	CV% = 9,8
Johnson (CT4)	2,5 ppm	15	60	25,00*	51,67	23,33
Johnson (CT5)	2,5 ppm	20	60	28,33*	45,00	26,67	(Tối ưu nhóm Johnson)
HgCl2 (CT2)	0,1%	5	60	53,33*	40,00	6,67	LSD0,05 = 4,55
HgCl2 (CT3)	0,1%	10	60	66,67*	25,00	8,33	CV% = 4,7
HgCl2 (CT4)	0,1%	15	60	73,33*	16,67	10,00	(Tối ưu toàn diện)
HgCl2 (CT5)	0,1%	20	60	65,00*	15,00	20,00

Ghi chú: (*) Sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng ở mức $p < 0,05$.

Tác giả phân tích cơ chế: H2O2 diệt khuẩn bằng cách phá vỡ màng tế bào gây mất nước đột ngột; ion $Hg^{2+}$ trong HgCl2 can thiệp mạnh vào protein và enzyme của tế bào chất vi sinh vật gây nhiễm. HgCl2 (0,1%) trong thời gian 15 phút là công thức khử trùng tối ưu nhất, cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất (73,33%) và tỷ lệ chết thấp (10,00%). Khi nâng thời gian lên 20 phút, hóa chất ngấm sâu vào mô gây ngộ độc làm tỷ lệ chết tăng vọt lên 20,00%. Viên khử trùng Johnson cho hiệu quả khử trùng kém nhất (tỷ lệ sạch tối đa chỉ đạt 28,33%).

2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tái sinh chồi

Kết quả khảo sát Kinetin và BAP đơn lẻ sau 35 ngày nuôi cấy:

Chất điều hòa	Công thức	Nồng độ (mg/l)	Tổng mẫu cấy	Tỷ lệ bật chồi (%)	Hệ số bật chồi (lần)	Phẩm chất chồi
Đối chứng	CT1	0,0	30	46,67	0,47	++ (Trung bình)
Kinetin	CT2	0,5	30	73,33*	1,20*	+++ (Tốt, chồi xanh, thân gầy)
	CT3	1,0	30	70,00*	1,13*	++ (Trung bình)
	CT4	1,5	30	66,67*	1,03*	++ (Trung bình)
	CT5	2,0	30	60,00*	0,87*	+ (Xấu, kém xanh, gầy)
Thống kê Kinetin				LSD0,05 = 8,06; CV% = 6,8	LSD0,05 = 0,10; CV% = 5,7
BAP	CT2	0,5	30	73,33*	1,17*	++ (Trung bình)
	CT3	1,0	30	80,00*	1,43*	+++ (Tốt)
	CT4	1,5	30	80,00*	1,77*	+++ (Tốt, xanh, thân mập)
	CT5	2,0	30	70,00*	1,60*	++ (Trung bình)
Thống kê BAP				LSD0,05 = 6,43; CV% = 4,9	LSD0,05 = 0,11; CV% = 4,7

BAP thể hiện khả năng cảm ứng tái sinh chồi vượt trội hơn Kinetin. Môi trường bổ sung BAP 1,5 mg/l cho hệ số bật chồi đạt 1,77 lần và tỷ lệ bật chồi đạt 80,00% với chồi to mập, sinh trưởng khỏe. Nồng độ này được chọn làm công thức nền (CT*) để tiến hành thí nghiệm kết hợp với Auxin.

3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP và IAA đến tái sinh chồi

Kết quả khảo sát phối hợp giữa BAP (1,5 mg/l) và IAA ở các nồng độ từ 0,1 đến 0,4 mg/l:

Công thức	Nồng độ BAP (mg/l)	Nồng độ IAA (mg/l)	Số mẫu cấy	Tỷ lệ bật chồi (%)	Hệ số bật chồi (lần)	Phẩm chất chồi
CT1 (ĐC)	1,5	0,0	30	76,67	1,70	+++ (Tốt)
CT2	1,5	0,1	30	80,00ns	1,80ns	+++ (Tốt)
CT3	1,5	0,2	30	90,00*	1,87*	+++ (Tốt)
CT4	1,5	0,3	30	96,67*	1,97*	+++ (Tốt, mập, xanh đậm)
CT5	1,5	0,4	30	73,33ns	1,73ns	++ (Trung bình)
Thống kê				LSD0,05 = 9,09; CV% = 5,8	LSD0,05 = 0,16; CV% = 4,7

Ghi chú: ns: Sai khác không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng CT1; (*): Sai khác có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$).

Sự kết hợp giữa 1,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l IAA mang lại hiệu quả tái sinh chồi cao nhất trong toàn bộ nghiên cứu, đạt tỷ lệ bật chồi 96,67% và hệ số bật chồi 1,97 lần. Việc tăng nồng độ IAA lên 0,4 mg/l làm giảm tỷ lệ bật chồi xuống 73,33% do tỷ lệ Auxin cao làm mất cân bằng cảm ứng chồi nách.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số kỹ thuật tối ưu đã chứng minh bằng thực nghiệm và nêu các kiến nghị tiếp tục hoàn thiện chu trình nuôi cấy in vitro ở các công đoạn nhân nhanh, tạo rễ và đưa cây ra đất.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính của đề tài

• Xác định chất và thời gian khử trùng bề mặt tối ưu: Dung dịch HgCl2 0,1% xử lý trong 15 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với đoạn thân mang mắt ngủ cây Đinh lăng, đạt tỷ lệ mẫu sạch 73,33%, tỷ lệ nhiễm 16,67% và tỷ lệ chết 10,00%. Xử lý bằng H2O2 5% chỉ đạt tỷ lệ sạch tối đa 48,33% (ở 15 phút), trong khi viên khử trùng Johnson 2,5 ppm chỉ đạt 28,33% (ở 20 phút).
• Xác định hiệu lực của Cytokinin đơn lẻ: BAP cho hiệu quả tái sinh chồi tốt hơn Kinetin. Nồng độ BAP 1,5 mg/l cho tỷ lệ bật chồi 80,00%, hệ số bật chồi 1,77 lần, chồi to mập và xanh tốt; trong khi Kinetin đạt tối ưu ở nồng độ 0,5 mg/l với tỷ lệ bật chồi 73,33% nhưng hệ số bật chồi thấp hơn (1,20 lần) và thân chồi gầy.
• Xác định môi trường tái sinh chồi tối ưu: Môi trường dinh dưỡng khoáng MS bổ sung 30 g/l saccharose, 6,5 g/l agar, 0,1 g/l myo-inositol kết hợp với 1,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l IAA (pH 5,6 - 5,8) cho tỷ lệ mẫu bật chồi đạt đỉnh 96,67% và hệ số bật chồi đạt 1,97 lần với chất lượng chồi đồng đều, xanh đậm và phát triển khỏe mạnh.

Giải pháp và quy trình đề xuất

Khóa luận thiết lập được quy trình kỹ thuật từng phần cho hai giai đoạn đầu của nhân giống in vitro cây Đinh lăng:

1. Giai đoạn vô trùng mẫu khởi đầu: Chọn đoạn cành bánh tẻ chứa mắt ngủ $\rightarrow$ rửa xà phòng $\rightarrow$ nhúng cồn 70° (30 - 60 giây) $\rightarrow$ tráng nước cất vô trùng $\rightarrow$ khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút $\rightarrow$ tráng lại 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng.
2. Giai đoạn tái sinh chồi: Cấy mẫu vô trùng vào môi trường MS + 30 g/l saccharose + 6,5 g/l agar + 0,1 g/l myo-inositol + 1,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l IAA (pH 5,6 - 5,8), nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 28°C, thời gian chiếu sáng 12 - 18 giờ/ngày, cường độ sáng 1000 - 2500 lux.

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Về mặt khoa học: Cung cấp các dẫn liệu thực nghiệm chính xác, có kiểm định thống kê (LSD, CV) về phản ứng sinh lý và phát sinh hình thái của mô phân sinh cây Đinh lăng lá nhỏ dưới tác động của các chất diệt khuẩn và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhóm Auxin và Cytokinin.
• Về mặt thực tiễn: Đặt nền móng kỹ thuật quan trọng giúp hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính cây Đinh lăng chất lượng cao quy mô công nghiệp, hỗ trợ giải quyết tình trạng khan hiếm cây giống đồng đều và sạch bệnh phục vụ sản xuất dược liệu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của đề tài:
  • Nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở hai giai đoạn đầu của quy trình vi nhân giống: khử trùng tạo mẫu sạch ban đầu và kích thích tái sinh chồi từ mắt ngủ. Chưa tiến hành thực nghiệm các giai đoạn tiếp theo trong chu trình nhân giống hoàn chỉnh gồm: giai đoạn nhân nhanh cụm chồi (giai đoạn 3), giai đoạn kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (giai đoạn 4) và giai đoạn thuần hóa chuyển cây con ra môi trường đất vườn ươm (giai đoạn 5).
  • Báo cáo khóa luận đã thiết kế nội dung thí nghiệm kết hợp BAP với IBA nhưng phần trình bày số liệu thực nghiệm và thảo luận chuyên sâu chỉ mới tập trung phản ánh kết quả của tổ hợp BAP và IAA.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:
  • Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nhân nhanh cụm chồi nhằm nâng cao hệ số nhân giống qua nhiều chu kỳ cấy chuyền.
  • Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng nhóm Auxin (IBA, NAA, IAA ở các nồng độ khác nhau) đến khả năng ra rễ in vitro, tạo cây hoàn chỉnh có hệ rễ phát triển tốt.
  • Nghiên cứu thử nghiệm thành phần giá thể, chế độ ẩm, ánh sáng và phân bón trong giai đoạn huấn luyện (ra ngôi) để nâng cao tỷ lệ sống của cây giống Đinh lăng khi đưa ra vườn ươm và đồng ruộng.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng và mục đích nghiên cứu sau:

• Sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Dược học và Lâm sinh: Có thể sử dụng khóa luận làm tài liệu tham khảo về phương pháp bố trí thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, cách thu thập và xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm IRISTAT, cũng như kỹ thuật theo dõi các chỉ tiêu phát sinh hình thái in vitro.
• Cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên phòng nuôi cấy mô: Tham khảo trực tiếp quy trình xử lý vô trùng mẫu cành bánh tẻ khó khử trùng và công thức môi trường dinh dưỡng MS kết hợp BAP và IAA để phục tráng hoặc nhân nhanh giống cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa).
• Các cơ sở sản xuất và doanh nghiệp dược liệu: Tiếp cận các thông số kỹ thuật thực nghiệm để xây dựng quy trình công nghệ nhân giống Đinh lăng sạch bệnh quy mô lớn, thay thế phương pháp giâm hom truyền thống nhằm nâng cao năng suất và chất lượng hoạt chất.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hóa chất khử trùng nào và thời gian xử lý bao nhiêu cho hiệu quả tạo mẫu vô trùng Đinh lăng tốt nhất?

Hóa chất khử trùng hiệu quả nhất là dung dịch Thủy ngân clorua (HgCl2) nồng độ 0,1% với thời gian xử lý 15 phút. Công thức này đạt tỷ lệ mẫu sạch cao nhất là 73,33%, tỷ lệ mẫu chết do ngộ độc hóa chất ở mức thấp (10,00%) và tỷ lệ mẫu nhiễm là 16,67% (sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$ so với đối chứng).

2. Vì sao viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) không đạt hiệu quả cao trong thí nghiệm vô trùng mẫu Đinh lăng?

Viên khử trùng Johnson ở nồng độ 2,5 ppm cho tỷ lệ mẫu sạch rất thấp (chỉ đạt từ 18,33% đến tối đa 28,33% khi tăng thời gian từ 5 đến 20 phút), trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức cao (45,00% - 68,33%) và tỷ lệ mẫu chết lên tới 26,67% ở mốc 20 phút. Khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn ngoại sinh của viên Johnson trên mô vỏ dày của cành Đinh lăng không triệt để.

3. Giữa hai loại Cytokinin là Kinetin và BAP, chất nào kích thích tái sinh chồi Đinh lăng tốt hơn?

BAP cho hiệu quả tái sinh chồi vượt trội hơn Kinetin cả về tỷ lệ bật chồi lẫn hệ số bật chồi. Ở nồng độ tối ưu 1,5 mg/l BAP, tỷ lệ bật chồi đạt 80,00%, hệ số bật chồi đạt 1,77 lần, chồi mập và xanh tốt. Trong khi đó, Kinetin đạt kết quả tốt nhất ở nồng độ 0,5 mg/l chỉ cho tỷ lệ bật chồi 73,33%, hệ số bật chồi 1,20 lần và chồi có xu hướng thân gầy.

4. Tác động của việc phối hợp Auxin (IAA) vào môi trường chứa 1,5 mg/l BAP diễn ra như thế nào?

Bổ sung IAA ở nồng độ thấp (0,1 - 0,3 mg/l) làm tăng tỷ lệ bật chồi và hệ số bật chồi, đạt đỉnh tại nồng độ 0,3 mg/l IAA với tỷ lệ bật chồi đạt 96,67%, hệ số bật chồi đạt 1,97 lần, chồi phát triển rất khỏe. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ IAA lên 0,4 mg/l, tỷ lệ bật chồi bị ức chế giảm xuống còn 73,33% và hệ số bật chồi giảm về 1,73 lần do mất cân bằng tỷ lệ Cytokinin/Auxin cần thiết cho sự phân hóa chồi.

5. Môi trường dinh dưỡng cơ bản và các thông số vật lý nuôi cấy tái sinh chồi Đinh lăng được thiết lập ra sao?

Môi trường dinh dưỡng gồm khoáng cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962), bổ sung 30 g/l saccharose, 6,5 g/l agar, 0,1 g/l myo-inositol, duy trì độ pH trong khoảng 5,6 - 5,8. Điều kiện phòng nuôi cấy duy trì nhiệt độ ổn định 25 - 28°C, thời gian chiếu sáng 12 - 18 giờ/ngày, cường độ ánh sáng đạt 1000 - 2500 lux và độ ẩm không khí trong bình nuôi cấy đạt 100%.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ma Kiên Chương đã nghiên cứu thực nghiệm thành công các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vô trùng mẫu và tái sinh chồi cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) in vitro. Kết quả thực nghiệm đã xác định được công thức khử trùng tối ưu bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút (đạt tỷ lệ mẫu sạch 73,33%) và công thức môi trường tái sinh chồi tối ưu trên nền MS bổ sung 1,5 mg/l BAP kết hợp 0,3 mg/l IAA (đạt tỷ lệ bật chồi 96,67%, hệ số bật chồi 1,97 lần). Công trình cung cấp cơ sở khoa học và các thông số kỹ thuật quan trọng cho việc hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính cây dược liệu Đinh lăng sạch bệnh chất lượng cao phục vụ nghiên cứu và sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA KIÊN CHƢƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA KIÊN CHƢƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn: 1. Vi Đại Lâm Khoa CNSH & CNTP- Trƣờng ĐHNL Thái Nguyên 2. Đào Duy Hƣng Viện Khoa học Sự Sống - Trƣờng ĐHNL Thái Nguyên Thái Nguyên, 2015 i LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Viện khoa học sự sống em đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro” tại Phòng thí nhiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công Nghệ Tế Bào thuộc Viện Khoa học Sự Sống thuộc trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Hiện nay, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp Đại Học.

Được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô Bộ môn Công nghệ Tế bào cùng các thầy cô trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian qua. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: ThS. Vi Đại Lâm và ThS. Đào Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạ điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 26 tháng 5 năm 2015 Sinh viên thực hiện Ma Kiên Chƣơng ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.

Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bốn loại vitamin thường dùng. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy.

Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl2 (0,1%). 34 đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi.

Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi. 42 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4. Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy……………….2 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy .