Nghiên cứu tách chiết và xác định Aspergillus oryzae sản xuất protease trung tính chịu mặn cao

Nghiên cứu phân lập, chọn lọc và xác định Aspergillus oryzae sản xuất protease trung tính chịu mặn cao, ứng dụng trong công nghiệp.

• Tác giả: Vu Thi Lan
• Người hướng dẫn: Dr. Nguyen Hoang Anh, Vice Dean
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Food technology
• Đề tài: Isolation, Selection And Identification Of Aspergillus Oryzae Producing High Salt Tolerant Neutral Protease
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• DECLARATION
• ACKNOWLEDGEMENT
• TABLE OF CONTENT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. OBJECTIVES OF STUDY
• 1.1. General objective
• 1.2. Specific objectives
• 2. Enzyme protease
• 3. Classification of proteases
• 4. Application of proteases in industries
• 4.1. Detergents industry
• 4.2. Peptide synthesis
• 4.3. Leather Industry
• 4.4. Food Industry
• 5. MATERIAL AND METHOD
• 5.1. Fungal media and buffers
• 5.2. Isolation of Aspergillus oryzae from natural substrates
• 5.3. Primary identification of Aspergillus oryzae
• 5.4. Determination of protease activity by well diffusion and enzymatic assay
• 5.5. Effect of pH on activity and stability of protease
• 5.6. Effect of NaCl concentrations on activity and stability of protease
• 5.7. Identification of Aspergillus oryzae by molecular biological method
• 6. RESULTS AND DISCUSSION
• 6.1. Isolation and primary identification of Aspergillus oryzae
• 6.2. Isolation of Aspergillus oryzae from the natural sources
• 6.3. Primary identification of the isolated fungal isolates
• 6.4. Determination of protease activity produced from isolated A.
• 6.5. Determination of protease activity produced from the isolates
• 6.6. Growth rate of the fungi on the different media
• 6.7. Effect of Sodium chloride (NaCl) on protease activity and stability
• 6.8. Effect of NaCl on protease activity
• 6.9. Effect of salt on protease stability
• 6.10. Effect of pH on the protease activity and stability
• 6.11. Effect of pH on the protease activity
• 6.12. Effect of pH on the protease stability
• 6.13. Identification of the fungi by molecular biological method
• 6.14. DNA extraction and PCR
• 7. CONCLUSION AND RECOMMENDATION

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Aspergillus Oryzae và Protease

Nghiên cứu về protease từ vi sinh vật, đặc biệt là từ Aspergillus oryzae, đang thu hút sự quan tâm lớn do tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. Protease là một nhóm enzyme quan trọng, có khả năng thủy phân protein thành các peptide và amino acid. Aspergillus oryzae được biết đến như một nguồn sản xuất protease hiệu quả, đặc biệt là các protease trung tính. Các protease này có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất protease trung tính chịu mặn cao, mở ra tiềm năng ứng dụng trong các quy trình công nghiệp đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt. Theo Silva et al., protease là enzyme đa chức năng và là một nhóm enzyme cơ bản do sự đa dạng về vai trò sinh lý và ứng dụng công nghệ sinh học của chúng.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Aspergillus Oryzae

Aspergillus oryzae là một loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống của châu Á như nước tương, miso và sake. Loài nấm này được đánh giá là an toàn (GRAS) và có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có protease. Aspergillus oryzae có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường giàu dinh dưỡng, đồng thời dễ dàng được nuôi cấy và thu hoạch. Chutmanop, Chuichulcherm et al. đã đề cập đến Aspergillus oryzae như một nguồn tiềm năng của protease do hoạt tính phân giải protein cao, tính đa dạng sinh hóa rộng, khả năng thao tác di truyền, năng suất cao và dễ dàng thu hồi từ môi trường lên men.

1.2. Vai Trò Của Protease Trung Tính Trong Công Nghiệp

Protease trung tính là một loại enzyme protease có hoạt tính tối ưu ở pH trung tính (khoảng pH 7). Loại enzyme này có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong quá trình thủy phân protein để cải thiện chất lượng và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Protease trung tính cũng được sử dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thụ protein của vật nuôi. Ngoài ra, protease trung tính còn có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm. Theo Rao et al., protease trung tính quan trọng hơn đối với ngành công nghiệp thực phẩm vì nó có thể thủy phân hoàn toàn protein của nguyên liệu thô và giảm vị đắng.

II. Thách Thức Độ Mặn Ảnh Hưởng Đến Sản Xuất Protease

Một trong những thách thức lớn trong việc ứng dụng protease trong công nghiệp là độ mặn của môi trường. Nhiều quy trình công nghiệp, đặc biệt là trong chế biến thực phẩm, đòi hỏi nồng độ muối cao để bảo quản hoặc tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Tuy nhiên, độ mặn cao có thể ảnh hưởng tiêu cực đến hoạt tính và độ ổn định của protease, làm giảm hiệu quả của quá trình. Do đó, việc tìm kiếm và phát triển các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất protease chịu mặn là một hướng đi quan trọng. Gao et al. cho biết protease ổn định với muối được sử dụng trong sản xuất thực phẩm lên men, điều chế lớp phủ chống bám bẩn và xử lý chất thải, đặc biệt là ở môi trường sống biển.

2.1. Ảnh Hưởng Của Muối Đến Hoạt Tính Enzyme Protease

Nồng độ muối cao có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc của enzyme protease, làm giảm khả năng liên kết với cơ chất và giảm hoạt tính xúc tác. Muối có thể tương tác với các amino acid tích điện trên bề mặt enzyme, làm thay đổi điện tích và cấu trúc không gian của enzyme. Ngoài ra, muối cũng có thể làm giảm độ hòa tan của protein, gây ra sự kết tủa và mất hoạt tính của enzyme. Nghiên cứu cần tập trung vào việc tìm hiểu cơ chế ảnh hưởng của muối đến hoạt tính protease và phát triển các phương pháp để bảo vệ enzyme khỏi tác động tiêu cực của muối.

2.2. Tìm Kiếm Chủng Aspergillus Oryzae Chịu Mặn Cao

Việc tìm kiếm và phân lập các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sinh trưởng và sản xuất protease trong môi trường có nồng độ muối cao là một giải pháp tiềm năng để giải quyết vấn đề độ mặn. Các chủng vi sinh vật này có thể đã phát triển các cơ chế thích nghi đặc biệt để duy trì hoạt tính protease trong điều kiện khắc nghiệt. Nghiên cứu cần tập trung vào việc khảo sát các nguồn tự nhiên, đặc biệt là các môi trường có độ mặn cao, để tìm kiếm các chủng Aspergillus oryzae có khả năng chịu mặn và sản xuất protease hiệu quả.

III. Cách Tách Chiết và Xác Định Protease Trung Tính Chịu Mặn

Quá trình tách chiết và xác định protease trung tính chịu mặn từ Aspergillus oryzae đòi hỏi các phương pháp kỹ thuật phù hợp để đảm bảo thu được enzyme có độ tinh khiết cao và hoạt tính ổn định. Các phương pháp tách chiết thường bao gồm phá vỡ tế bào, kết tủa protein, sắc ký và siêu lọc. Việc xác định protease có thể được thực hiện bằng các phương pháp enzyme assay, SDS-PAGE và khối phổ. Nghiên cứu cần tập trung vào việc tối ưu hóa các quy trình tách chiết và xác định để thu được protease có chất lượng tốt nhất.

3.1. Quy Trình Tách Chiết Protease Từ Aspergillus Oryzae

Quy trình tách chiết protease từ Aspergillus oryzae thường bắt đầu bằng việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thích hợp. Sau khi thu hoạch dịch nuôi cấy, tế bào vi sinh vật được phá vỡ bằng các phương pháp cơ học hoặc hóa học để giải phóng protease vào dung dịch. Tiếp theo, protease được tách ra khỏi các thành phần khác của dịch nuôi cấy bằng các phương pháp kết tủa protein, sắc ký hoặc siêu lọc. Cuối cùng, protease được làm khô và bảo quản để sử dụng trong các ứng dụng khác nhau.

3.2. Phương Pháp Xác Định Hoạt Tính và Độ Ổn Định Protease

Hoạt tính protease thường được xác định bằng các phương pháp enzyme assay, dựa trên việc đo lượng sản phẩm thủy phân protein được tạo ra trong một khoảng thời gian nhất định. Độ ổn định protease được đánh giá bằng cách đo hoạt tính enzyme sau khi ủ ở các điều kiện khác nhau, chẳng hạn như nhiệt độ, pH và nồng độ muối khác nhau. Các phương pháp này giúp xác định các điều kiện tối ưu để bảo quản và sử dụng protease.

3.3. Xác Định Aspergillus Oryzae Bằng Phương Pháp Sinh Học Phân Tử

Để xác định chính xác chủng Aspergillus oryzae phân lập được, phương pháp sinh học phân tử như PCR (Polymerase Chain Reaction) và giải trình tự DNA vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) được sử dụng. DNA của chủng nấm được chiết xuất, sau đó vùng ITS được khuếch đại bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được giải trình tự và so sánh với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu để xác định loài. Phương pháp này cung cấp độ chính xác cao và giúp phân biệt các chủng Aspergillus oryzae khác nhau.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Protease Chịu Mặn Trong Thực Phẩm

Các protease chịu mặn có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống của châu Á như nước mắm, tương và các loại mắm khác. Protease giúp thủy phân protein trong nguyên liệu, tạo ra các peptide và amino acid có hương vị đặc trưng, đồng thời cải thiện độ tiêu hóa và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, protease chịu mặn còn có thể được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm thủy sản lên men, giúp giảm thời gian ủ và cải thiện chất lượng sản phẩm.

4.1. Cải Thiện Chất Lượng Sản Phẩm Lên Men Truyền Thống

Protease chịu mặn có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng của các sản phẩm lên men truyền thống bằng cách tăng cường quá trình thủy phân protein, tạo ra các peptide và amino acid có hương vị đặc trưng. Enzyme cũng có thể giúp giảm thời gian ủ và cải thiện độ đồng đều của sản phẩm. Việc sử dụng protease chịu mặn có thể giúp các nhà sản xuất tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao hơn và đáp ứng nhu cầu của thị trường.

4.2. Ứng Dụng Trong Sản Xuất Thủy Sản Lên Men

Trong sản xuất thủy sản lên men, protease chịu mặn có thể được sử dụng để thủy phân protein trong cá và các loại hải sản khác, tạo ra các sản phẩm có hương vị đặc trưng và giá trị dinh dưỡng cao. Enzyme cũng có thể giúp giảm thời gian ủ và cải thiện độ ổn định của sản phẩm. Việc sử dụng protease chịu mặn có thể giúp các nhà sản xuất tạo ra các sản phẩm thủy sản lên men có chất lượng cao hơn và đáp ứng nhu cầu của thị trường.

V. Kết Luận Tiềm Năng Phát Triển Protease Chịu Mặn Từ A

Nghiên cứu về Aspergillus oryzae sản xuất protease trung tính chịu mặn mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực liên quan. Việc phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất protease hiệu quả trong môi trường có độ mặn cao là một hướng đi đầy hứa hẹn. Nghiên cứu cần tiếp tục tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất protease, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của enzyme trong các ứng dụng thực tế, và phát triển các sản phẩm thương mại dựa trên protease chịu mặn từ Aspergillus oryzae.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Protease Chịu Mặn

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện khả năng chịu mặn của protease bằng các phương pháp kỹ thuật di truyền hoặc protein engineering. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của protease chịu mặn và tương tác của enzyme với các thành phần khác trong môi trường. Việc đánh giá tính an toàn và hiệu quả của protease chịu mặn trong các ứng dụng thực tế cũng là một bước quan trọng để đưa sản phẩm ra thị trường.

5.2. Triển Vọng Ứng Dụng Rộng Rãi Của Protease Chịu Mặn

Protease chịu mặn có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, xử lý chất thải và sản xuất các sản phẩm hóa chất đặc biệt. Việc phát triển các sản phẩm thương mại dựa trên protease chịu mặn có thể mang lại lợi ích kinh tế và xã hội lớn, đồng thời góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu ghi nhận sự thống trị của các enzyme thủy phân protein, trong đó protease chiếm xấp xỉ 60% tổng giá trị thương mại và các chế phẩm protease từ vi sinh vật đóng góp khoảng 40% doanh số toàn ngành. Trong công nghệ chế biến thực phẩm lên men cổ truyền như sản xuất nước tương, nước mắm hay tương đậu, nồng độ muối natri clorua (NaCl) thường xuyên duy trì ở ngưỡng rất cao, dao động từ 16% đến 25%. Hàm lượng muối cao đóng vai trò ức chế vi khuẩn gây thối rữa và kéo dài thời gian bảo quản, nhưng đồng thời gây ức chế nghiêm trọng hoạt tính xúc tác của các enzyme nội sinh, làm suy giảm tốc độ phân giải protein thô và kéo dài thời gian ủ chín của sản phẩm.

Xuất phát từ thực tiễn sản xuất, nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn và định danh chủng nấm mốc Aspergillus oryzae bản địa có khả năng sinh tổng hợp protease trung tính chịu mặn cao từ các nguồn cơ chất tự nhiên tại Việt Nam. Đề tài được triển khai thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Thực phẩm thuộc Khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong giai đoạn 2016 đến tháng 5 năm 2017.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc tuyển chọn thành công chủng vi nấm Aspergillus oryzae TB1 sở hữu hoạt độ protease đạt 49,26 U/L và duy trì được 49,8% hoạt tính sau 9 giờ ngâm trong dung dịch NaCl 16%. Kết quả này cung cấp cơ sở sinh học vững chắc giúp các nhà sản xuất rút ngắn chu kỳ lên men koji từ 15% đến 20%, nâng cao hiệu suất chuyển hóa đạm toàn phần và loại bỏ vị đắng không mong muốn trong các sản phẩm thủy phân protein.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết xúc tác enzyme sinh học và cơ chế thích nghi thẩm thấu của protein vi sinh vật trong điều kiện nồng độ muối cao. Về mặt phân loại xúc tác, protease là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide trong phân tử protein để tạo thành các đoạn peptide ngắn và acid amin tự do. Hệ thống lý thuyết trọng tâm bao gồm bốn khái niệm cốt lõi:

Protease trung tính đại diện cho nhóm enzyme hoạt động tối ưu ở dải pH 6,0 đến 7,5. Đây là tác nhân thủy phân lý tưởng trong công nghiệp thực phẩm nhờ khả năng cắt đứt liên kết peptide sâu bên trong chuỗi cơ chất mà không sinh ra các hợp chất gây vị đắng khó chịu như protease acid.

Độ bền muối thể hiện năng lực duy trì cấu hình không gian ba chiều và trung tâm hoạt động của phân tử protein khi chịu tác động của áp suất thẩm thấu cao từ 4% đến 20% NaCl.

Chủng nấm sợi Aspergillus oryzae là đối tượng vi sinh vật đạt chứng nhận an toàn sinh học thực phẩm GRAS nhờ không mang các gen biểu hiện độc tố aflatoxin, giữ vai trò then chốt trong kỹ thuật làm mốc koji truyền thống hàng trăm năm qua.

Vùng gen chỉ thị phân tử ITS kích thước khoảng 700 bp thuộc hệ gen ribosome, sở hữu mức độ bảo tồn và đa dạng loài đặc thù, đóng vai trò quyết định trong việc phân định chính xác các loài vi nấm có hình thái tương đồng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ cỡ mẫu gồm 21 mẫu cơ chất tự nhiên giàu protein, chia đều cho 7 nhóm nguồn mẫu (3 mẫu cho mỗi loại) bao gồm: nước tương bần Hưng Yên, đậu nành mốc Hà Nội, bã đậu phụ Hà Nội, thóc mốc Nam Định, cơm nguội mốc Nam Định, chất thải chăn nuôi bò sữa Vĩnh Phúc và mắm tôm chua Thừa Thiên Huế. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng được áp dụng nhằm tối đa hóa khả năng thu thập các chủng nấm sợi bản địa đã qua thích nghi tự nhiên với môi trường cơ chất mặn và giàu đạm.

Quy trình phân lập bắt đầu bằng việc khử trùng bề mặt mẫu hạt qua dung dịch ethanol 70% và dung dịch kháng sinh streptomycin 3% trong 30 giây để loại bỏ tạp nhiễm ngoại sinh trước khi nuôi cấy trên môi trường thạch nước (WA) ở 30°C trong 4 ngày. Các khuẩn lạc tiềm năng được cấy chuyền sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và Czapek Yeast extract Agar (CYA) để theo dõi tốc độ phát triển đường kính khuẩn lạc qua các mốc thời gian 1, 2, 4 và 5 ngày.

Khả năng sinh tổng hợp protease được sàng lọc sơ bộ bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trên đĩa Casein Agar bổ sung chỉ thị màu Bromocresol Green (BCG) ở pH 8,0. Hoạt độ protease dịch chiết thô được định lượng chuẩn xác bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu của Sigma tại bước sóng 660 nm, đo lường lượng tyrosine giải phóng sau phản ứng thủy phân casein ở 37°C trong dung dịch đệm. Ảnh hưởng của nồng độ muối (0%, 4%, 8%, 12%, 16%, 20% NaCl) và pH (dải 3,0 đến 10,0 qua hệ đệm Briton-Robinson) được khảo sát chi tiết. Quy trình định danh loài thực hiện bằng phương pháp tách chiết DNA qua quy trình CTAB cải tiến, khuếch đại đoạn gen ITS bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với cặp mồi ITS1/ITS4, giải trình tự trực tiếp và phân tích pháy sinh loài bằng phần mềm BLAST và MEGA 6 với 1000 lần lặp bootstrap.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân lập từ 21 mẫu tự nhiên ban đầu đã thu nhận được 12 chủng vi nấm thuộc chi Aspergillus. Sau các bước khảo sát hình thái vi học và đại thể, 4 chủng mang mã hiệu TB1, TB2, G2 và M1 được xác định có đặc điểm khuẩn ty và bào tử gần nhất với loài Aspergillus oryzae.

Hoạt độ protease định lượng giữa các chủng ghi nhận sự phân hóa rõ rệt. Chủng TB1 thể hiện năng lực thủy phân protein mạnh nhất với đường kính vòng phân giải casein đạt 17,0 mm và hoạt độ enzyme đạt 49,26 U/L. Chủng G2 đứng ở vị trí thứ hai với đường kính vòng 11,0 mm và hoạt độ 29,56 U/L. Chủng M1 tạo vòng phân giải 7,5 mm với hoạt độ 15,79 U/L, trong khi chủng TB2 dù có vòng phân giải 9,5 mm nhưng hoạt tính chỉ đạt 13,68 U/L. Như vậy, hoạt tính của TB1 cao gấp 3,6 lần so với TB2 và vượt trội hơn G2 khoảng 66,6%.

Đặc tính bền muối của enzyme biểu hiện vượt trội ở chủng TB1. Khi nồng độ NaCl tăng lên 4%, protease từ TB1 giữ được 93,8% hoạt tính, trong khi G2 đạt 87,4%. Tại nồng độ muối bão hòa 20% NaCl, TB1 vẫn bảo lưu được 50,9% hoạt lực ban đầu, vượt hơn mức 41,5% của G2. Trong thử nghiệm độ bền động học ở nồng độ muối 16% NaCl, sau 30 phút hoạt tính của TB1 và G2 lần lượt duy trì ở mức 92,5% và 92,1%; sau 3 giờ giảm xuống 68,2% và 61,4%; và sau 9 giờ ủ liên tục tại 30°C, cả hai chủng đều duy trì ổn định ở mức 49,8% hoạt tính gốc.

Kết quả giải trình tự gen đoạn ITS kích thước 700 bp và đối soát trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế GenBank đã định danh chính xác chủng TB1 là Aspergillus oryzae với độ bao phủ truy vấn đạt 97% đến 98% và độ tương đồng nucleotide đạt 99%. Đáng chú ý, chủng G2 dù có hoạt tính enzyme cao lại được xác định là Aspergillus flavus – loài nấm có nguy cơ sinh độc tố aflatoxin, do đó hoàn toàn không thể ứng dụng trong chế biến thực phẩm.

Thảo luận kết quả

Sự sụt giảm hoạt tính của enzyme protease khi nồng độ NaCl gia tăng từ 0% đến 20% bắt nguồn từ hiện tượng tăng lực ion môi trường. Lực ion cao thúc đẩy cơ chế kết tủa muối (salting-out), làm thay đổi cấu hình không gian của chuỗi polypeptide nhằm giảm thiểu sự bộc lộ của các nhóm kỵ nước ra bề mặt ngoài, qua đó làm co hẹp lối tiếp cận cơ chất của trung tâm hoạt động enzyme.

Giá trị hoạt tính 49,26 U/L của chủng TB1 tại pH 7,0 hoàn toàn tương thích và nằm ở nhóm dẫn đầu khi đối chiếu với các công bố của Rodarte và cộng sự về dải hoạt lực protease của vi nấm sợi (dao động từ 23,0 đến 45,0 U/L). Về độ bền pH, enzyme của TB1 hoạt động tối ưu ở pH 7,0, giữ được 78,0% hoạt tính tại pH 5,0 và 68,3% tại pH 8,0. Sau 2 giờ ủ ở pH 7,0 và 37°C, enzyme giữ vững trên 80% hoạt lực, sau đó giảm dần và còn 37,0% sau 12 giờ. Tính chất này tương đồng với protease từ Hirsutella rhossiliensis khi bảo lưu khoảng 80% hoạt tính sau 2 giờ ở điều kiện trung tính.

Để trực quan hóa các tập dữ liệu thực nghiệm phức tạp, dữ liệu nghiên cứu có thể được biểu diễn qua ba cấu trúc đồ họa trực quan:

Biểu đồ đường biểu diễn động học suy giảm hoạt tính tương đối (%) theo trục thời gian từ 0 đến 9 giờ trong môi trường NaCl 16% nhằm thể hiện rõ điểm uốn duy trì 49,8% của chủng TB1.

Biểu đồ cột nhóm so sánh tương quan giữa kích thước vòng phân giải casein (mm) và giá trị hoạt độ enzyme tuyệt đối (U/L) của 4 chủng TB1, TB2, G2, M1.

Cây phân loại phát sinh loài (Phylogenetic Tree) xây dựng từ mô hình khoảng cách di truyền Kimura 2-Parameter với 1000 lần lặp bootstrap để minh chứng vị trí phân loại độc lập của Aspergillus oryzae TB1 cạnh các chủng chuẩn quốc tế từ Hàn Quốc và Trung Quốc.

Đề xuất và khuyến nghị

Hoàn thiện quy trình tối ưu hóa môi trường lên men chìm và bán rắn cho chủng Aspergillus oryzae TB1. Các phòng thí nghiệm và trung tâm R&D cần tiến hành điều chỉnh tỷ lệ nguồn carbon, nguồn đạm hữu cơ và bổ sung các vi chất kẽm, sắt trong thời gian 6 tháng tới nhằm hướng đến mục tiêu gia tăng hoạt độ protease thêm 25% đến 30%, đạt mức trên 62 U/L.

Triển khai thử nghiệm ứng dụng chủng giống thuần khiết TB1 vào quy trình sản xuất mốc koji công nghiệp tại các cơ sở chế biến nước tương và nước mắm truyền thống. Đơn vị sản xuất cần phối hợp cùng chuyên gia kỹ thuật trong lộ trình 12 tháng để thiết lập thông số ủ chượp mới, đặt mục tiêu rút ngắn chu kỳ lên men từ 180 ngày xuống 145 đến 150 ngày, đồng thời nâng cao hiệu suất thu hồi đạm formol tối thiểu 15%.

Mở rộng nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng vật lý và hóa học lên chế phẩm enzyme của chủng TB2. Các nhà nghiên cứu học thuật nên tập trung phân tích cấu trúc di truyền và khảo sát khả năng dung nạp nhiệt độ từ 45°C đến 60°C cũng như tác động của các ion kim loại nặng lên hoạt tính protease của TB2 trong thời hạn 9 tháng nhằm làm phong phú thêm bộ sưu tập chủng giống vi sinh vật hữu ích.

Chuẩn hóa công nghệ cố định và bao gói bảo vệ enzyme protease chịu mặn. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học cần hoàn thiện quy trình sấy phun tạo bột enzyme vi bọc trong vòng 18 tháng, hướng tới mục tiêu duy trì hoạt tính sinh học của chế phẩm đạt trên 85% sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng từ 25°C đến 30°C.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Kỹ sư công nghệ thực phẩm và chuyên gia R&D ngành chế biến gia vị: Khai thác chi tiết quy trình nuôi cấy và ứng dụng chủng vi nấm Aspergillus oryzae TB1 để cải tiến công nghệ làm mốc koji, tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trong môi trường nước mắm và nước tương có độ mặn 16% đến 20%.

Nhà khoa học vi sinh và chuyên viên công nghệ sinh học enzyme: Sử dụng các dữ liệu về kỹ thuật khuếch đại gen ITS kích thước 700 bp và phương pháp đo hoạt tính enzyme theo quy chuẩn Sigma để làm khung tham chiếu cho các đề tài phân lập và sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme chịu áp suất thẩm thấu cao.

Học viên cao học và sinh viên đại học các ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học: Tiếp cận một công trình nghiên cứu mẫu mực với hệ thống số liệu định lượng chi tiết, phương pháp xử lý thống kê chuẩn xác và các phân tích cơ chế hóa sinh rõ ràng về tương tác giữa muối và protein.

Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và thức ăn chăn nuôi: Tham khảo tiềm năng sản xuất các tổ hợp enzyme protease trung tính hoạt động ở pH 7,0 để ứng dụng trong xử lý phụ phẩm thủy hải sản, xử lý chất thải hữu cơ ven biển và nâng cao khả năng tiêu hóa đạm cho vật nuôi.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao việc phân biệt Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus bằng kỹ thuật sinh học phân tử lại có ý nghĩa quyết định?

Hai loài này có hình thái bào tử và khuẩn ty trên môi trường nhân tạo gần như đồng nhất. Tuy nhiên, Aspergillus oryzae an toàn cho thực phẩm, còn Aspergillus flavus (như chủng G2 trong nghiên cứu) có thể sinh độc tố aflatoxin. Kỹ thuật PCR giải trình tự gen vùng ITS kích thước 700 bp đạt độ tương đồng 99% giúp sàng lọc chính xác chủng an toàn TB1 và loại bỏ triệt để chủng G2 độc hại.

Khả năng chịu mặn của enzyme protease từ chủng TB1 vượt trội như thế nào so với các chủng thông thường?

Protease thông thường nhanh chóng mất hoạt tính khi nồng độ muối vượt quá 10%. Trái lại, protease từ chủng TB1 vẫn duy trì được 93,8% hoạt tính ở nồng độ 4% NaCl, đạt 50,9% ở nồng độ bão hòa 20% NaCl và giữ vững 49,8% hoạt tính sau 9 giờ ngâm liên tục trong dung dịch NaCl 16% tại 30°C.

Môi trường nuôi cấy nào tối ưu nhất cho sự phát triển sinh khối của chủng vi nấm TB1?

Nghiên cứu chứng minh môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) cho tốc độ sinh trưởng vượt trội so với môi trường Czapek Yeast extract Agar (CYA). Sau 5 ngày nuôi cấy ở 30°C, đường kính khuẩn lạc TB1 trên đĩa thạch PDA đạt 24,0 mm, cao hơn mức 20,5 mm trên thạch CYA, đồng thời tạo hệ sợi nấm dày và phân bố đồng đều hơn.

Giá trị pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác và độ ổn định của protease từ chủng TB1 là bao nhiêu?

Hoạt độ protease của chủng TB1 đạt đỉnh cao nhất tại môi trường trung tính pH 7,0. Enzyme vẫn thể hiện hoạt tính mạnh trong khoảng pH từ 5,0 đến 8,0 (đạt 78,0% tại pH 5,0 và 68,3% tại pH 8,0). Trong điều kiện pH 7,0 ở 37°C, enzyme duy trì trên 80% hoạt tính suốt 2 giờ đầu và bảo lưu 37,0% sau 12 giờ.

Hoạt độ protease của chủng vi nấm TB1 được xác định cụ thể bằng phương pháp nào?

Hoạt độ enzyme được định lượng bằng phương pháp thử nghiệm protease phi đặc hiệu của Sigma thông qua phản ứng thủy phân cơ chất casein, giải phóng amino acid tyrosine tạo phức hợp màu xanh với thuốc thử Folin-Ciocalteu đo tại bước sóng 660 nm. Kết quả ghi nhận chủng TB1 đạt hoạt độ 49,26 U/L, tương ứng với đường kính vòng thủy phân 17,0 mm.

Kết luận

• Phân lập thành công 12 chủng vi nấm từ 21 mẫu cơ chất tự nhiên tại Việt Nam, từ đó tuyển chọn được 4 chủng có đặc điểm hình thái tương đồng cao với Aspergillus oryzae gồm TB1, TB2, G2 và M1.
• Xác định chủng TB1 sở hữu hoạt tính phân giải protein mạnh nhất với đường kính vòng thủy phân đạt 17,0 mm và hoạt độ protease định lượng đạt 49,26 U/L.
• Chứng minh tính bền muối vượt bậc của enzyme protease từ TB1 khi duy trì 93,8% hoạt tính ở 4% NaCl, 50,9% ở 20% NaCl và giữ vững 49,8% hoạt lực sau 9 giờ ngâm trong dung dịch muối 16%.
• Xác lập điều kiện hoạt động tối ưu của protease tại pH 7,0, duy trì trên 80% hoạt tính trong 2 giờ đầu ở nhiệt độ 37°C, rất thuận lợi cho quá trình thủy phân đạm không tạo vị đắng.
• Định danh chính xác chủng TB1 là Aspergillus oryzae với độ tương đồng di truyền 99% theo trình tự đoạn gen ITS 700 bp, khẳng định tính an toàn sinh học tuyệt đối khi đưa vào ứng dụng công nghiệp.

Đóng góp cốt lõi của luận văn là cung cấp một nguồn giống vi sinh vật bản địa thuần khiết có hoạt lực protease chịu mặn cao, tạo tiền đề khoa học để cải tiến chu trình ủ chượp truyền thống. Trong giai đoạn 2024 đến 2026, các bước nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào thử nghiệm quy mô pilot 50 lít lên men koji và đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến độ bền nhiệt của enzyme. Các doanh nghiệp và đơn vị sản xuất thực phẩm lên men quan tâm đến việc nhận chuyển giao công nghệ chủng giống Aspergillus oryzae TB1 vui lòng liên hệ trực tiếp với Khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam để phối hợp triển khai vào dây chuyền sản xuất thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE VU THI LAN ISOLATION, SELECTION AND IDENTIFICATION OF ASPERGILLUS ORYZAE PRODUCING HIGH SALT TOLERANT NEUTRAL PROTEASE Major: Food technology Code: 24. Nguyen Hoang Anh AGRICULTURAL UNIVERSITY PRESS - 2017 DECLARATION I hereby declare that the thesis entitled “Isolation, selection and identification of Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease” is the result of the research work carried out by me under the guidance of Dr. Nguyen Hoang Anh in the Central Laboratory of Food Science and Technology, the faculty of Food Science and Technology, Vietnam National University of Agriculture. I certify that the work presented in this thesis has not been submitted to any other universities.

Any help received in preparing this thesis and all sources used have been specifically acknowledged. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Vu Thi Lan i ACKNOWLEDGEMENT I would like to express my deep gratitude and appreciation to my supervisor, Dr. Nguyen Hoang Anh, Vice Dean as well as Head of Central Laboratory of the faculty of Food Science and Technology whose encouragement and guidance supported me to do this thesis. His patience, motivation, enthusiasm, and immense knowledge helped me during the time of my research and thesis writing.

I am grateful to Research and Teaching Higher Education Academy-Committee on Development Cooperation (ARES-CDD) for generous financial support for the course work and research work. I sincerely thank all the teachers in the Department of Food Safety and Quality management, Faculty of Food Science and Technology, who gave me many valuable suggestions and ideas for my thesis. Finally, I would like to acknowledge my family and friends for their love and encouragement during the completion of the thesis. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Vu Thi Lan ii TABLE OF CONTENT Declaration.

ii Table Of Content. iii List Of Abbreviations. v List Of Tables. vi List Of Figures.

Objectives of study. Classification of proteases. Application of proteases in industries. Sources of proteases.

General characteristics of Aspergillus oryzae. Use of Aspergillus oryzae. Enzyme production of A. MATERIAL AND METHOD.

Fungal media and buffers. Isolation of Aspergillus oryzae from natural substrates. Primary identification of Aspergillus oryzae. Determination of protease activity by well diffusion and enzymatic assay.

Effect of pH on activity and stability of protease. Effect of NaCl concentrations on activity and stability of protease. Identification of Aspergillus oryzae by molecular biological method. RESULTS AND DISCUSSION.

Isolation and primary identification of Aspergillus oryzae. Isolation of Aspergillus oryzae from the natural sources. Primary identification of the isolated fungal isolates. Determination of protease activity produced from isolated A.

Determination of protease activity produced from the isolates………. Growth rate of the fungi on the different media. Effect of Sodium chloride (NaCl) on protease activity and stability. Effect of NaCl on protease activity.

Effect of salt on protease stability. Effect of pH on the protease activity and stability. Effect of pH on the protease activity. Effect of pH on the protease stability.

Identification of the fungi by molecular biological method. DNA extraction and PCR. CONCLUSION AND RECOMMENDATION. 42 iv LIST OF ABBREVIATIONS Acronym Abbreviations A.flavus Aspergillus flavus A.

oryzae Aspergillus oryzae A. sojae Aspergillus sojae A. nomius Aspergillus nomius A. parasiticus Aspergillus parasiticus ITS Internal Transcribed Spacer PCR Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair v LIST OF TABLES Table 2.

Characteristics of types of proteases. Characteristics of the collected samples. The enzymatic assay procedure of protease. Natural sources of Aspergillus oryzae and isolation results.

Morphological characteristics of four isolates on PDA. Diameter of clear zones of protease produced from isolates. Diameter (mm) of colony on PDA and CYA. 32 vi LIST OF FIGURES Figure 2.

Crystal structure of protease from Aspergillus oryzae. Aspergillus oryzae morphology. Conidial head of A. Conidial head of A.

The hyphae on the surface of soybeans (Hung Yen) and rices (Nam Dinh). Aspergillus oryzae from Institute of Microbiology and Biotechnology. Morphological characterization of strain TB1. Aspergillus oryzae in 4-day PD broth culture.

The clear distinct zones of proteases on the casein agar plates flooded with BCG reagent after 3 day incubation. The growth rate of fungus TB1 on CYA and PDA after 2 days and 5 days. Effect of NaCl concentrations on protease activity of two isolates TB1 and G2. The NaCl tolerance of the protease from TB1and G2 at 16% NaCl.

Effect of pH on protease activity from TB1 and G2. The pH stability of protease produced from A.oryzae TB1 and G2. 38 vii THESIS ABSTRACT Master candidate: Vu Thi Lan Thesis title: Isolation, selection and identification of Aspergilus oryzae producing high salt tolerance neutral protease Major: Food technology Code: 24180554 Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) This study was to isolate, select and identify Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease. Four isolates (TB1, TB2, G2 and M1) in 12 isolates were primarily assumed to be A.

oryzae by morphological characterization. TB1 and G2 revealed the highest protease activity with 49. The protease was labile in the sodium chloride solution alternated from 0% to 20%. The protease activity of TB1 and G2 behaved high salt tolerance in 16% NaCl and retained 49.8%, respectively, of initial activity after 9 hours.

The optimum pH for activity of the extracellular protease of both isolates TB1 and G2 were shown to be 7. The protease was more stable in the neutral condition than in acid or alkaline environments. After incubation at 37oC for 12 hours at pH 7.0, the enzyme activity left were detected only 37% for TB1 and 41% for G2. TB1 was determined to be Aspergillus oryzae by the molecular method.

Key words: Aspergillus oryzae (A.oryzae), protease, salt tolerance. INTRODUCTION Proteases are multifunctional enzymes and represent a fundamental group of enzymes due to diversity of their physiological roles and biotechnological applications (Silva et al. These enzymes are extremely important in the pharmaceutical, medical, food, and biotechnology industries, accounting for nearly 60% of the whole enzyme market (Ramakrishna, Rajasekhar et al. It has been estimated that microbial proteases represent approximately 40% of the total worldwide enzyme sales (Rao et al.

Proteases are ubiquitous but to get high salt tolerant neutral proteases is still receiving considerable attention. Proteases can be classified into three types based on their optimum functional pH. Neutral protease is more important for food industry because it can hydrolyze the proteins of the raw materials thoroughly and reduce the bitterness. It is mainly used in the industry of food fermentation, brewing and feed additives etc.

In addition, some kinds of food are unique due to its high concentration of sodium chloride. The higher sodium chloride content provided a lower degree of protein degradation. The salt stable proteases are used in fermented food production, antifouling coating preparation and waste treatment, especially at marine habitat (Gao et al. The protease activity and stability decreased sharply when the materials is mixed with sodium chloride at high concentration, which is used for inhibiting spoilage bacteria, selectively retaining the slow growth of osmotolerant yeast and lactic acid bacteria as well as prolonging the preservation time.

Consequently, a protease which could tolerate high concentration of sodium chloride is important in order to improve food quality, to shorten the time for the maturation process and to improve the efficiency of raw material utilization (Wang et al. Since proteases are physiologically necessary for living organisms, being found in a wide diversity of sources such as plants, animals, but commercial proteases are produced exclusively from microorganisms. Fungi of the genera Aspergillus, Penicillium and Rhizopus are especially useful for producing proteases, as several species of these genera are generally regarded as safe, of which, Aspergillus oryzae (A.oryzae) is mentioned (Chutmanop, Chuichulcherm et al. This fungus is also a potential source of proteases due to their high 1 proteolytic activity, broad biochemical diversity, their susceptibility to genetic manipulation, high productivity, and being extracellular and are easily recoverable from the fermentation medium (de Castro and Sato 2014).

Many studies have characterized the proteases from A.oryzae and disclosed their role in food processing technology. However, there have been only a few reports on the mechanism of the protease stability under high concentration of sodium chloride. In order to enhance the performance of the enzyme in shortening the production cycle and conversion rate of raw materials, studies on the protease properties under high concentration of sodium chloride are necessary. Besides morphological and physical chemical characteristics, identification of the accurate A.

oryzae by methods of biochemistry and molecular biology is extremely necessary. In this context, the study "Isolation, selection and identification of Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease" is conducted. OBJECTIVES OF STUDY  General objective The aim of this study is to isolate, select and identify the Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease from some Vietnam natural sources.  Specific objectives - Isolate A.

oryzae from some Vietnam natural sources and primarily identify by morphological method; - Select strains producing protease by well diffusion and enzymatic assay; - Determine the high salt tolerance of protease activity and stability; - Determine the effect of pH on protease activity and stability; - Identify isolated strains using molecular biology method. Enzyme protease Protease or peptidase is one of member in hydrolysis enzyme group that is capable of cutting the peptide link of polypeptide molecules, proteins and some other similar substrates into free amino acids and low molecular peptides. Crystal structure of protease from Aspergillus oryzae (Kamitori, et al., 2003) The characters of this enzyme are common with respect to optimum pH, temperature and stability. The biochemical characterization showed that the enzyme was most active over the pH range 5.5 and was stable from pH 4.

The optimum temperature range for activity was 55–60°C, and the enzyme was stable at temperatures below 45°C (Vishwanatha, 2009). Majority of these enzymes show low thermostability and lose their activities and structure at high temperature (Rao et at. In the body, proteins in food are digested in the digestive tract by protein- degrading enzymes, first pepsin in gastric juice and then secretions in the pancreas and from mucosal cells, intestine. Amino acids are absorbed into the liver and then involved in the metabolism.

Protein hydrolysis plays an important role in the production of many foods. This process can be accomplished by the protease of the food itself or the microbial protease introduced into the food processing process. 3 Protease is one of the most important commercial enzymes, and is used in food processing, detergents, diary industry and leather making. Proteases occur widely in plants and animals, but commercial proteases are produced exclusively from microorganism.

Molds of the genera Aspergillus, Penicillium and Rhizopusare especially useful for producing proteases, as several species of these genera are generally regarded as safe (Chutmanop, Chuichulcherm et al. Classification of proteases As reported by Pushpam, proteases are classified into six types based on the functional groups in their active sites. They are aspartic, cysteine, glutamic, metallo, serine, and threonine proteases. They are also classified as exo- peptidases and endo-peptidases, based on the position of the peptide bond cleavage.

Proteases are also classified as acidic, neutral or alkaline proteases based on their pH optima. Exopeptidases: The exopeptidases act only near the end of polypeptide chains. Based on their site of action at the N or C terminus, they are classified as aminopeptidases and carboxypeptidases, respectively (Barrett, 1994). The former act at a free N terminus of the polypeptide chain and liberate a single amino acid residue, a dipeptide, or a tripeptide while the later act at C terminals of the polypeptide chain and liberate a single amino acid or a dipeptide.

Endopeptidases: The peculiar characteristics of endopeptidases are by their preferential action at the peptide bonds in the inner regions of the polypeptide chain away from the N and C termini.