Tổng quan luận án
Ung thư đầu cổ (UTĐC) là nhóm bệnh lý ác tính phát sinh tại các vị trí giải phẫu thuộc khu vực đầu và cổ, bao gồm khoang miệng, mũi, xoang cạnh mũi, vòm mũi họng, thanh quản, hạ họng và tuyến nước bọt. Khoảng 90% các trường hợp ung thư đầu cổ có bản chất mô bệnh học là ung thư biểu mô tế bào vảy (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma - HNSCC). Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2012, toàn cầu ghi nhận khoảng 14,1 triệu ca ung thư mới mắc và 8,2 triệu ca tử vong; đến năm 2018, các con số này tăng lên 18,1 triệu ca mắc mới và 9,6 triệu ca tử vong. Trong đó, ung thư đầu cổ đứng hàng thứ 7 trên thế giới, chiếm khoảng 4,8% tổng số ca ung thư mới chẩn đoán. Tại Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân được chẩn đoán mắc ung thư đầu cổ chiếm khoảng 7,8% tổng số các trường hợp ung thư.
Phương pháp điều trị ung thư đầu cổ truyền thống chủ yếu dựa trên ba giải pháp kinh điển gồm phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu. Mặc dù các phương pháp này đã đạt được những kết quả nhất định, tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân ung thư đầu cổ giai đoạn tiến triển hoặc tái phát vẫn còn thấp. Bên cạnh đó, hóa trị và xạ trị gây ra nhiều độc tính toàn thân và biến chứng muộn, ảnh hưởng nặng nề đến chất lượng cuộc sống của người bệnh.
Liệu pháp sử dụng virus ly giải tế bào ung thư (Oncolytic Virus - OLV) là hướng tiếp cận dựa trên khả năng của virus xâm nhập, nhân lên chọn lọc trong tế bào khối u và phá hủy tế bào ung thư mà không gây hại cho mô lành. Trong các chủng virus ly giải, virus vaccine sởi (Measles virus vaccine - MeV) chủng Edmonston giảm độc lực đã được chứng minh có tính an toàn cao qua nhiều thập kỷ tiêm chủng mở rộng và có ái lực đặc hiệu với thụ thể CD46 vốn biểu hiện quá mức trên tế bào ung thư biểu mô vảy. Song song với đó, liệu pháp điều trị đích sử dụng kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) như Nimotuzumab đã cho thấy hiệu quả ức chế tăng sinh mạch, kìm hãm phát triển khối u và kích hoạt quá trình chết theo chương trình (apoptosis) với độc tính da thấp hơn so với các kháng thể cùng nhóm.
Khoảng trống nghiên cứu được xác định: Mặc dù MeV và Nimotuzumab đã được nghiên cứu đơn lẻ hoặc phối hợp với các phương pháp hóa xạ trị, việc kết hợp đồng thời virus vaccine sởi và kháng thể đơn dòng Nimotuzumab trong điều trị ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ chưa từng được khảo sát toàn diện trong và ngoài nước.
Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Ngô Thu Hằng thực hiện tại Học viện Quân y, chuyên ngành Khoa học y sinh (Mã số: 9720101), dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Nguyễn Lĩnh Toàn và PGS. Hồ Anh Sơn, nhằm giải quyết hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:
- Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab in vitro trên dòng tế bào ung thư đầu cổ người Hep2.
- Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đầu cổ người (in vivo).
Đối tượng nghiên cứu gồm dòng tế bào ung thư đầu cổ người Hep2, virus vaccine sởi chủng Edmonston, kháng thể đơn dòng Nimotuzumab và mô hình động vật chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude mang đột biến gen Foxn1). Phạm vi nghiên cứu là các thực nghiệm sinh học phân tử, tế bào và thực nghiệm tiền lâm sàng trên động vật tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các cơ sở dịch tễ học, sinh học phân tử, cơ chế bệnh sinh của HNSCC và các liệu pháp điều trị đích, liệu pháp sinh học đương đại.
Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ của ung thư đầu cổ
Theo số liệu GLOBOCAN 2018 tại Việt Nam, ung thư vòm họng đứng thứ 6 trong các bệnh ung thư thường gặp ở cả hai giới (6.212 ca mắc mới, 4.232 ca tử vong) và đứng thứ 5 ở nam giới (chiếm 5% tổng số ca mắc mới); ung thư thanh quản có 1.685 ca mắc mới; ung thư môi và khoang miệng có 1.877 ca mắc mới; ung thư họng có 2.900 ca mắc mới.
Các yếu tố nguy cơ chính của ung thư đầu cổ gồm:
- Khói thuốc lá: Chứa khoảng 5.000 hợp chất hóa học với ít nhất 60 chất gây ung thư như các hydrocarbon thơm đa vòng và nitrosamines (điển hình là 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone). Các chất này tạo phức hợp ADN adducts (như 6-methyl-guanine), kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB, sản sinh các gốc oxy hóa tự do (ROS) và các cytokine tiền viêm (IL-8, TNF-α), làm tổn thương niêm mạc và suy giảm miễn dịch.
- Rượu: Acetaldehyde là chất chuyển hóa độc hại của ethanol qua cảm ứng cytochrome P4502E1 (CYP2E1), ức chế enzym sửa chữa ADN $O^6$-methyl-guanyl-transferase, gây đột biến điểm tại locus HGPRT và suy giảm chức năng tế bào lympho, tế bào NK. Phân tích của tập hợp nghiên cứu INHANCE trên 11.221 ca bệnh và 16.168 nhóm chứng chỉ ra 72% ca ung thư đầu cổ liên quan đến thuốc lá và rượu (4% do rượu đơn thuần, 33% do thuốc lá đơn thuần, 35% do kết hợp cả hai). Nguy cơ kết hợp phân bố khác nhau theo vị trí: thanh quản (89%), họng miệng (72%), khoang miệng (64%).
- Nhiễm virus sinh ung: Human Papillomavirus (đặc biệt là HPV-16) liên quan mật thiết đến ung thư biểu mô tế bào vảy họng miệng (OPSCC) thông qua các oncoprotein E6 (ức chế p53) và E7 (bất hoạt pRb). Epstein-Barr Virus (EBV) liên quan đến ung thư vòm mũi họng (NPC thể không biệt hóa loại III theo WHO) thông qua các protein màng tiềm ẩn LMP1, LMP2A/B và các ARN không mã hóa EBERs, BART microRNAs.
Cơ chế bệnh sinh phân tử của HNSCC
Quá trình sinh ung vùng đầu cổ liên quan đến các đột biến gen và biến đổi các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào:
- Đột biến gen kiểm soát chu kỳ tế bào: Gen TP53 bị đột biến hoặc mất chức năng trong hơn 50% trường hợp HNSCC; gen RB1 mất kiểm soát phức hợp giải phóng yếu tố phiên mã E2F; mất đoạn đồng hợp tử hoặc đột biến gen CDKN2A (mã hóa p16INK4a và p14ARF); khuếch đại gen CCND1 (mã hóa Cyclin D1) thúc đẩy chuyển tiếp pha G1/S; đột biến gen NOTCH1 (11-15% trường hợp) và biến đổi yếu tố phiên mã p63.
- Con đường tín hiệu EGFR: Thụ thể EGFR (HER1/ErbB-1) biểu hiện quá mức trong 80-92% trường hợp HNSCC. Sự liên kết của EGF hoặc TGF-α gây dimer hóa thụ thể, tự phosphoryl hóa miền tyrosine kinase nội bào, kích hoạt các dòng thác tín hiệu Ras/Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR, PLCγ và STAT3/STAT5, dẫn đến tăng sinh, ức chế apoptosis, xâm lấn và tăng sinh mạch máu qua tiết VEGF.
- Con đường PI3K/AKT/PTEN và TGF-β/SMAD: Đột biến điểm gen PIK3CA (8,3-11%) và mất đoạn dị hợp tử chất ức chế khối u PTEN (lên tới 40%); bất hoạt thụ thể TGFBR2 hoặc mất gen SMAD4 trên nhiễm sắc thể 18q.
Vị trí và khoảng trống nghiên cứu của luận án
Trước thực trạng các liệu pháp ức chế EGFR như Cetuximab hay các chất ức chế tyrosine kinase (TKI như Gefitinib, Erlotinib) có thể gặp hiện tượng kháng thuốc hoặc độc tính ngoài da đáng kể, việc tìm kiếm liệu pháp phối hợp mới là cần thiết. Nimotuzumab là kháng thể đơn dòng nhân bản hóa IgG1 gắn đặc hiệu vào miền ngoại bào của EGFR với ái lực trung bình ($K_d = 4,5 \times 10^{-8}\text{ M}$), tập trung chọn lọc tại các tế bào có mật độ EGFR cao (khối u) mà ít tích lũy ở mô lành, từ đó giảm thiểu tác dụng phụ phát ban da (<10%). Trong khi đó, virus vaccine sởi chủng Edmonston sử dụng thụ thể CD46 (vốn bộc lộ tới 85-99% trên bề mặt tế bào HNSCC) để xâm nhập và kích hoạt tạo hợp bào (syncytia) ly giải tế bào u. Luận án đặt vị trí nghiên cứu vào việc lần đầu tiên phối hợp cơ chế ly giải chọn lọc của MeV và tác dụng ức chế tín hiệu EGFR/tăng sinh mạch của Nimotuzumab trên mô hình thực nghiệm HNSCC.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án xây dựng thiết kế nghiên cứu thực nghiệm có đối chứng, kết hợp giữa phương pháp đánh giá sinh học phân tử, tế bào in vitro và mô hình động vật ghép dị loài in vivo.
Khung lý thuyết và cơ chế tác dụng
- Cơ chế ly giải của virus vaccine sởi (MeV): MeV nhận diện thụ thể CD46 qua glycoprotein Hemagglutinin (H), kích hoạt glycoprotein Fusion (F) làm hòa màng virus với màng tế bào ung thư, giải phóng phức hợp ribonucleoprotein (RNP gồm N, P, L) vào tế bào chất. Sự biểu hiện protein F và H trên màng tế bào nhiễm kích thích hợp nhất màng với 50-100 tế bào lân cận, tạo thành hợp bào khổng lồ đa nhân và tự thoái hóa sau 4-5 ngày. MeV đồng thời cảm ứng tín hiệu DAMPs, PAMPs và điều biến con đường JAK/STAT, kích hoạt phiên mã các gen cảm ứng bởi interferon như ISG15.
- Cơ chế tác dụng của Nimotuzumab: Cạnh tranh vị trí gắn với EGF trên miền ngoại bào của EGFR, ức chế tự phosphoryl hóa tyrosine kinase, ngăn chặn tín hiệu xuôi dòng STAT3/AKT/ERK, ức chế biểu hiện VEGF và phục hồi quá trình apoptosis.
- Cơ chế hiệp đồng: Sự kết hợp giữa MeV và Nimotuzumab vừa tấn công trực tiếp màng tế bào và tạo hợp bào, vừa triệt tiêu tín hiệu sinh tồn và tăng sinh mạch từ EGFR.
Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
- Dòng tế bào: Tế bào ung thư biểu mô người Hep2 (Human epithelial type 2) và dòng tế bào thận khỉ xanh châu Phi Vero (dùng để nhân dòng và chuẩn độ virus).
- Tác nhân sinh học: Virus vaccine sởi sống giảm độc lực (MeV) chủng Edmonston; Kháng thể đơn dòng kháng EGFR Nimotuzumab (Cimaher, nồng độ 5 mg/ml, sản xuất bởi Trung tâm Miễn dịch Phân tử Havana, Cuba).
- Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh (chuột nude athymic mang đột biến gen Foxn1), trọng lượng trung bình 18-22g, được nuôi dưỡng trong hệ thống chuồng nuôi thông khí độc lập (IVC) đảm bảo điều kiện vô trùng.
- Trang thiết bị chuyên dụng: Hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy BD FACSLyric, kính hiển vi đảo ngược, kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), máy đọc mật độ quang ELISA phiến 96 giếng, hệ thống buồng nuôi cấy $CO_2$.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
[Quy trình thực nghiệm in vitro & in vivo]
1. In vitro (Hep2):
- Chuẩn độ virus CCID50 (Vero / Methylene blue)
- Hình thái học & Hợp bào (Kính hiển vi)
- Độc lực tế bào (Thử nghiệm MTT ở 72h, 96h)
- Chết Apoptosis / Hoại tử (Flow Cytometry Annexin V/PI ở 48h, 72h, 96h)
- Biểu hiện gen STAT3, ISG15 (Real-time RT-PCR ở 48h, 72h)
2. In vivo (Chuột nude mang u Hep2):
- Ghép dị loài tế bào Hep2 dưới da đùi
- Phân nhóm điều trị (Chứng, MeV, Nimotuzumab, MeV + Nimotuzumab)
- Đánh giá thể tích u (0, 2, 4, 6, 8 tuần) & Cân nặng chuột
- Thời gian sống trung bình & Đường cong sống tích lũy
- Phân tích Apoptosis tế bào u tách rời (Flow Cytometry)
- Mô bệnh học u (Nhuộm HE) & Siêu cấu trúc (Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM)
- Phương pháp nuôi cấy và chuẩn độ virus:
- Tế bào Hep2 và Vero được nuôi cấy trong môi trường EMEM bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh.
- Chuẩn độ hiệu lực virus sởi theo phương pháp xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy ($CCID_{50}$) trên phiến 96 giếng, nhuộm cố định bằng xanh methylen.
- Đánh giá tỷ lệ sống và ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT:
- Tế bào Hep2 được chia thành các nhóm: Nhóm chứng không can thiệp, nhóm dùng Nimotuzumab, nhóm dùng MeV (với các bội số nhiễm MOI khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 2 MOI), và nhóm phối hợp MeV + Nimotuzumab.
- Đo mật độ quang (OD) tại bước sóng quy định ở các thời điểm 72 giờ và 96 giờ sau điều trị.
- Phân tích tế bào chết Apoptosis và hoại tử bằng Flow Cytometry:
- Sử dụng bộ kít nhuộm kép Annexin V-FITC và Propidium Iodide (PI) trên máy BD FACSLyric tại các mốc thời gian 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
- Phân định rõ 4 quần thể tế bào: Tế bào sống ($Annexin\text{ }V^-/PI^-$), tế bào apoptosis sớm ($Annexin\text{ }V^+/PI^-$), tế bào apoptosis muộn ($Annexin\text{ }V^+/PI^+$), và tế bào chết hoại tử ($Annexin\text{ }V^-/PI^+$).
- Phân tích mức độ phiên mã gen bằng Real-time RT-PCR:
- Tách chiết ARN tổng số từ tế bào Hep2 ở các nhóm can thiệp tại thời điểm 48 giờ và 72 giờ.
- Tổng hợp cDNA và chạy Real-time PCR khuếch đại gen STAT3 và ISG15, chuẩn hóa theo gen nội chuẩn.
- Mô hình động vật và đánh giá in vivo:
- Tiêm hỗn dịch tế bào Hep2 dưới da vùng đùi chuột nude để tạo khối u dị loài.
- Khi khối u đạt thể tích tiêu chuẩn, chia ngẫu nhiên thành 4 lô: Lô chứng (tiêm PBS), Lô tiêm MeV nội u, Lô tiêm Nimotuzumab phúc mạc, Lô kết hợp tiêm MeV nội u và Nimotuzumab.
- Theo dõi cân nặng định kỳ, đo kích thước khối u bằng thước kẹp cơ học (tính thể tích $V = \frac{\text{dài} \times \text{rộng}^2}{2}$) tại các thời điểm ngày đầu (tuần 0), tuần 2, tuần 4, tuần 6 và tuần 8.
- Ghi nhận thời gian sống sót trung bình và xây dựng đường cong sống sót tích lũy.
- Tách khối u đánh giá tỷ lệ apoptosis bằng Flow Cytometry, làm tiêu bản mô bệnh học nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE), và cắt lát siêu mỏng quan sát siêu cấu trúc tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 1 tổng thuật chi tiết toàn bộ các cơ sở lý luận về ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu cổ, phân tích sâu các yếu tố dịch tễ, căn nguyên sinh bệnh học phân tử và các liệu pháp điều trị hiện hành:
| Nhóm liệu pháp điều trị đích trong HNSCC |
Cơ chế tác động sinh học |
Các hoạt chất tiêu biểu |
| Kháng thể đơn dòng kháng EGFR |
Gắn miền ngoại bào EGFR, ức chế dimer hóa và truyền tín hiệu nội bào |
Cetuximab, Panitumumab, Zalutumumab, Nimotuzumab |
| Chất ức chế EGFR Tyrosine Kinase (TKI) |
Cạnh tranh gắn vị trí ATP tại miền kinase nội bào của EGFR |
Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Afatinib, Dacomitinib |
| Chất ức chế phối tử VEGF / Thụ thể VEGFR |
Ngăn cản quá trình tân tạo mạch máu nuôi dưỡng khối u |
Bevacizumab, Sorafenib, Sunitinib, Vandetanib, Pazopanib |
| Chất ức chế con đường PI3K/AKT/mTOR |
Ngăn chặn tín hiệu sinh tồn và tăng sinh tế bào phụ thuộc mTOR |
Rapamycin, Temsirolimus, Everolimus, Torin1, PP242, PP30 |
| Kháng thể kháng chốt kiểm soát miễn dịch PD-1 |
Tái kích hoạt chức năng nhận diện và tiêu diệt khối u của tế bào T |
Pembrolizumab, Nivolumab |
Chương này cũng phân tích chi tiết chu trình sinh học của virus vaccine sởi: cấu trúc bộ gen sợi đơn RNA 16 kb mã hóa cho 6 gen và 8 protein (N, P, M, F, H, L cùng protein không cấu trúc V, C). Điểm lại các thử nghiệm tiền lâm sàng của MeV trên các mô hình ung thư hạch, đa u tủy xương, ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư gan và u thần kinh đệm. Đồng thời, chương 1 trình bày đặc tính dược lý học của Nimotuzumab với hằng số phân ly ái lực $K_d = 4,5 \times 10^{-8}\text{ M}$, giải thích lý do kháng thể này dung nạp tốt, hầu như không gây tổn thương da nặng như Cetuximab.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ các quy trình thao tác chuẩn, tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn đánh giá:
- Phương pháp nuôi cấy tế bào Hep2 bám đáy trong môi trường vô trùng; kỹ thuật cấy truyền tế bào Vero và chuẩn độ virus theo phương pháp Reed-Muench/Karber xác định giá trị $CCID_{50}$.
- Phác đồ điều trị in vitro: Thử nghiệm các liều virus sởi (0,1 MOI; 0,5 MOI; 1 MOI; 2 MOI) đơn độc hoặc phối hợp với Nimotuzumab trên phiến nuôi cấy.
- Quy trình nhuộm Annexin V/PI trên máy dòng chảy BD FACSLyric để định lượng chính xác tỷ lệ phần trăm tế bào chết qua các con đường apoptosis sớm, apoptosis muộn và hoại tử ở các mốc thời gian 48, 72 và 96 giờ.
- Thiết kế mô hình động vật: Kỹ thuật gây u dưới da đùi chuột nude Foxn1 bằng tế bào Hep2 ($10^6 - 10^7$ tế bào/chuột). Phác đồ đưa thuốc: MeV tiêm trực tiếp vào khối u theo liều xác định, Nimotuzumab tiêm phúc mạc theo chu kỳ.
- Đạo đức nghiên cứu trên động vật: Quy trình chăm sóc, nuôi dưỡng trong chuồng IVC độc lập và giảm thiểu đau đớn cho động vật thực nghiệm tuân thủ chặt chẽ các quy định y đức của Học viện Quân y.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
Chương 3 tổng hợp và phân tích các số liệu thực nghiệm thu được từ cả hai hệ thống in vitro và in vivo:
1. Kết quả tác dụng kháng ung thư in vitro trên dòng tế bào Hep2
- Tạo hợp bào và ly giải tế bào: Quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học cho thấy sau khi nhiễm MeV, tế bào Hep2 xuất hiện hiện tượng hòa màng, các tế bào kết tụ tạo thành hợp bào khổng lồ đa nhân (syncytia). Hiện tượng này tăng dần theo liều MOI và thời gian tiếp xúc.
- Ức chế tăng sinh (MTT): Tỷ lệ sống sót của tế bào Hep2 giảm rõ rệt ở các nhóm điều trị bằng MeV và phối hợp MeV + Nimotuzumab so với nhóm chứng. Tại các thời điểm 72 giờ và 96 giờ, nhóm phối hợp MeV và Nimotuzumab thể hiện tỷ lệ ức chế tế bào vượt trội so với các nhóm dùng đơn chất ở mọi mức liều MOI.
- Kích hoạt chết Apoptosis: Phân tích Flow Cytometry ghi nhận tỷ lệ tế bào apoptosis (bao gồm apoptosis sớm và apoptosis muộn) ở nhóm phối hợp MeV + Nimotuzumab tăng cao có ý nghĩa tại các thời điểm 48h, 72h và 96h:
- Tại 48 giờ: Bắt đầu xuất hiện sự chuyển dịch quần thể tế bào sang pha apoptosis sớm ($Annexin\text{ }V^+/PI^-$).
- Tại 72 giờ và 96 giờ: Tỷ lệ tế bào apoptosis muộn ($Annexin\text{ }V^+/PI^+$) và hoại tử tăng mạnh ở liều 2 MOI khi kết hợp cùng Nimotuzumab.
- Biến đổi phiên mã gen STAT3 và ISG15: Phân tích Real-time PCR cho thấy sự thay đổi mức độ biểu hiện mARN của STAT3 (yếu tố phiên mã thúc đẩy tăng sinh hạ lưu của EGFR) và ISG15 (gen cảm ứng bởi interferon liên quan đến apoptosis và đáp ứng kháng virus) ở thời điểm 48 giờ và 72 giờ, chứng minh cơ chế can thiệp phân tử đa tầng của liệu pháp phối hợp.
2. Hiệu quả điều trị in vivo trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang u Hep2
- Tính an toàn và thể trạng: Khối lượng trung bình của chuột ở các nhóm điều trị không bị sụt giảm nghiêm trọng so với trước điều trị; chuột duy trì hoạt động bình thường, không ghi nhận độc tính cấp hay tử vong do nhiễm độc toàn thân.
- Kìm hãm kích thước khối u: Quá trình theo dõi thể tích khối u từ ngày đầu điều trị đến các tuần 2, 4, 6 và 8 cho thấy sự khác biệt rõ rệt:
| Nhóm theo dõi (in vivo) |
Đặc điểm thể tích khối u qua 8 tuần |
Thời gian sống sót & Tỷ lệ sống |
| Nhóm đối chứng (PBS) |
Thể tích u tăng nhanh liên tục, u phát triển lớn gây hoại tử bề mặt |
Thời gian sống ngắn nhất, tỷ lệ tử vong tích lũy cao nhất |
| Nhóm Nimotuzumab |
Tốc độ tăng trưởng khối u chậm hơn nhóm chứng |
Kéo dài thời gian sống trung bình ở mức độ vừa phải |
| Nhóm MeV |
Khối u bị kìm hãm đáng kể, có sự suy thoái u tại chỗ |
Cải thiện tỷ lệ sống sót tích lũy so với nhóm chứng |
| Nhóm phối hợp MeV + Nimotuzumab |
Kích thước khối u bị ức chế mạnh nhất qua các tuần 2, 4, 6, 8 |
Thời gian sống trung bình dài nhất, tỷ lệ sống tích lũy cao nhất |
- Đánh giá tế bào u tách rời: Kết quả chạy Flow Cytometry trên các tế bào tách từ khối u sau điều trị xác nhận tỷ lệ tế bào đi vào con đường chết apoptosis ở nhóm phối hợp cao hơn rõ rệt so với các nhóm đơn trị liệu.
- Mô bệnh học và siêu cấu trúc tế bào (TEM):
- Hình ảnh mô bệnh học (nhuộm HE): Khối u ở nhóm chứng gồm các đám tế bào biểu mô vảy ác tính phân chia mạnh; trong khi nhóm phối hợp MeV + Nimotuzumab cho thấy nhiều vùng hoại tử rộng, thoái hóa mô u và giảm mật độ tế bào ung thư.
- Phân tích siêu cấu trúc dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Nhóm tế bào u Hep2 đối chứng (mẫu chuột C3) có màng nhân nguyên vẹn, chất nhiễm sắc phân bố đều, bào quan phong phú. Ngược lại, nhóm điều trị phối hợp MeV + Nimotuzumab (mẫu chuột KH4, KH5) thể hiện các tổn thương siêu cấu trúc đặc trưng: màng tế bào gián đoạn, nhân đông, chất nhiễm sắc co cụm vón cục sát màng nhân, ty thể phồng to mất mào và xuất hiện các thể apoptosis.
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Xác lập bằng chứng khoa học đầu tiên về phối hợp MeV và Nimotuzumab: Luận án là công trình thực nghiệm đầu tiên chứng minh hiệu quả kháng ung thư đầu cổ khi kết hợp virus vaccine sởi sống giảm độc lực (chủng Edmonston) với kháng thể đơn dòng kháng EGFR Nimotuzumab trên dòng tế bào ung thư biểu mô vảy người Hep2 và mô hình động vật.
- Làm sáng tỏ cơ chế tác động hiệp đồng ở mức độ tế bào và phân tử:
- Chứng minh sự phối hợp giữa MeV và Nimotuzumab làm gia tăng tỷ lệ ức chế tăng sinh và kích hoạt tế bào chết theo chương trình (apoptosis) mạnh hơn so với việc sử dụng từng tác nhân đơn lẻ.
- Chỉ ra sự biến đổi có ý nghĩa trong quá trình phiên mã của gen STAT3 và gen cảm ứng interferon ISG15 tại các mốc 48 giờ và 72 giờ, chứng minh liệu pháp phối hợp tác động đồng thời vào con đường tín hiệu EGFR và hệ thống đáp ứng nội bào qua trung gian interferon.
- Cung cấp bằng chứng siêu cấu trúc và mô bệnh học: Luận án ghi nhận các biến đổi siêu vi thể rõ ràng của tế bào ung thư Hep2 dưới kính hiển vi điện tử truyền qua sau điều trị phối hợp, xác nhận sự phá hủy màng tế bào, thoái hóa bào quan và hình thành các thể apoptosis trên mô hình in vivo.
Đóng góp thực tiễn và khả năng ứng dụng
- Khẳng định tính an toàn sinh học của phác đồ phối hợp MeV và Nimotuzumab trên động vật thực nghiệm (không làm suy giảm thể trạng hoặc gây độc tính toàn thân nghiêm trọng trên chuột nude).
- Cung cấp mô hình tiền lâm sàng hoàn chỉnh (tạo khối u Hep2 dị loài trên chuột nude, quy trình chuẩn độ virus, quy trình tiêm nội u phối hợp tiêm phúc mạc) làm tiền đề cho các nghiên cứu chuyển giao và thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư biểu mô vảy đầu cổ giai đoạn tiến triển hoặc tái phát kháng xạ trị/hóa trị.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
Theo phạm vi thực hiện của luận án:
- Nghiên cứu mới tiến hành trên một dòng tế bào ung thư đầu cổ người đại diện là Hep2, chưa mở rộng khảo sát trên nhiều dòng tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ khác nhau (như các dòng ung thư thanh quản, vòm họng, khoang miệng có tình trạng đột biến EGFR và nhiễm HPV khác nhau).
- Mô hình thực nghiệm sử dụng chuột nhắt trắng thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh (chuột nude đột biến gen Foxn1). Mặc dù mô hình này cho phép ghép dị loài tế bào ung thư người mà không bị thải ghép, nhưng do thiếu hụt dòng tế bào lympho T trưởng thành nên chưa thể đánh giá toàn diện đáp ứng miễn dịch thích ứng toàn thân (đặc biệt là vai trò của tế bào T CD8+, T CD4+ và hiện tượng trình diện chéo của tế bào đuôi gai) đối với liệu pháp virus ly giải kết hợp kháng thể.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Mở rộng thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư đầu cổ có đặc điểm sinh học phân tử đa dạng (dương tính và âm tính với HPV/EBV, mức độ biểu hiện EGFR và CD46 khác nhau).
- Khảo sát trên các mô hình động vật có hệ miễn dịch hoàn chỉnh (mô hình đồng loài - syngeneic model hoặc chuột nhân hóa hệ miễn dịch) để đánh giá đầy đủ vai trò kích hoạt miễn dịch kháng u toàn thân và trí nhớ miễn dịch của liệu pháp.
- Nghiên cứu tối ưu hóa phác đồ liều lượng, đường dùng (kết hợp tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch) và phối hợp thêm với các liệu pháp chuẩn (xạ trị, hóa trị liều thấp) trước khi chuyển tiếp sang các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao đối với nhiều nhóm độc giả và các lĩnh vực nghiên cứu chuyên sâu:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Khoa học y sinh, Sinh lý bệnh, Miễn dịch học và Ung thư học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn mực về nuôi cấy tế bào ung thư, chuẩn độ virus ly giải ($CCID_{50}$), kỹ thuật nhuộm Annexin V/PI trên hệ thống Flow Cytometry BD FACSLyric, và kỹ thuật Real-time RT-PCR đánh giá biểu hiện gen.
- Các nhà nghiên cứu phát triển thuốc sinh học và liệu pháp miễn dịch: Tài liệu tham khảo quan trọng về cơ chế tương tác giữa virus ly giải tế bào (Oncolytic Virotherapy) và kháng thể đơn dòng hướng đích (Monoclonal Antibodies), cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hằng số sinh học và động học khối u in vivo.
- Bác sĩ lâm sàng ung bướu và tai mũi họng: Cung cấp cái nhìn toàn diện về cơ chế bệnh sinh phân tử của ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ (vai trò của EGFR, TP53, Rb, HPV, EBV), cập nhật các xu hướng điều trị trúng đích mới nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc và giảm thiểu tác dụng phụ của hóa xạ trị truyền thống.
Câu hỏi thường gặp
1. Thụ thể tế bào chính mà chủng virus vaccine sởi Edmonston sử dụng để xâm nhập và ly giải tế bào ung thư đầu cổ là gì?
Chủng virus vaccine sởi giảm độc lực Edmonston sử dụng chủ yếu thụ thể CD46 (một glycoprotein xuyên màng điều hòa bổ thể biểu hiện quá mức từ 85-99% trên bề mặt tế bào HNSCC) để xâm nhập và tạo hợp bào. Ngoài ra, virus còn có thể sử dụng thụ thể CD150 (trên tế bào lympho) và Nectin-4 (phân tử kết dính biểu mô).
2. Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab có đặc tính sinh học gì khác biệt so với các kháng thể kháng EGFR khác như Cetuximab?
Nimotuzumab là kháng thể đơn dòng nhân bản hóa IgG1 có ái lực gắn kết trung bình với miền ngoại bào của EGFR ($K_d = 4,5 \times 10^{-8}\text{ M}$). Ái lực này tương đương với EGF tự nhiên và thấp hơn khoảng 10 lần so với Cetuximab hay Panitumumab. Đặc tính này giúp Nimotuzumab tích tụ chọn lọc tại các mô có mật độ EGFR cao (tế bào khối u) mà ít gắn vào mô lành có mật độ EGFR thấp, do đó tỷ lệ tác dụng phụ phát ban trên da rất thấp (<10%), cho phép điều trị an toàn và kéo dài.
3. Nghiên cứu đã sử dụng những mốc thời gian và kỹ thuật nào để chứng minh tế bào Hep2 bị ức chế và đi vào con đường chết Apoptosis in vitro?
Luận án sử dụng thử nghiệm MTT tại các mốc 72 giờ và 96 giờ để xác định tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào; đồng thời sử dụng kỹ thuật nhuộm kép Annexin V-FITC/PI trên máy dòng chảy BD FACSLyric tại các mốc 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ để định lượng tỷ lệ tế bào apoptosis sớm, apoptosis muộn và tế bào chết hoại tử.
4. Mức độ phiên mã của những gen nào được khảo sát để giải thích cơ chế phân tử của liệu pháp phối hợp?
Luận án tiến hành định lượng mức độ phiên mã mARN của gen STAT3 (chất truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã thuộc con đường EGFR) và gen ISG15 (Interferon-stimulated gene 15 thuộc con đường đáp ứng interferon và apoptosis) tại hai thời điểm 48 giờ và 72 giờ bằng phương pháp Real-time RT-PCR.
5. Mô hình động vật thực nghiệm in vivo được thiết kế như thế nào và đánh giá những chỉ tiêu chính nào?
Nghiên cứu sử dụng chuột nhắt trắng thiếu hụt miễn dịch (chuột nude athymic mang đột biến gen Foxn1) được cấy ghép dị loài tế bào ung thư người Hep2 dưới da đùi. Các chỉ tiêu đánh giá gồm: thể tích khối u định kỳ (tuần 0, 2, 4, 6, 8), cân nặng và sức khỏe chuột, thời gian sống trung bình, tỷ lệ sống sót tích lũy, tỷ lệ apoptosis của tế bào tách từ u (Flow Cytometry), mô bệnh học u (nhuộm HE) và siêu cấu trúc tế bào u dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Kết luận
Luận án tiến sĩ y học của tác giả Ngô Thu Hằng đã thực hiện nghiên cứu thực nghiệm đánh giá tác dụng kháng ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ của virus vaccine sởi chủng Edmonston phối hợp với kháng thể đơn dòng Nimotuzumab. Kết quả nghiên cứu chứng minh trên mô hình in vitro (dòng tế bào Hep2) và in vivo (chuột nude mang u dị loài), liệu pháp phối hợp làm tăng cường tạo hợp bào, ức chế tăng sinh tế bào, gia tăng tỷ lệ chết theo chương trình apoptosis, điều biến biểu hiện gen STAT3 và ISG15, đồng thời kìm hãm rõ rệt thể tích khối u và kéo dài thời gian sống của động vật thực nghiệm mà không gây độc tính toàn thân. Công trình cung cấp hệ thống dữ liệu khoa học tiền lâm sàng có giá trị, mở ra triển vọng ứng dụng hướng tiếp cận sinh học kết hợp mới trong điều trị ung thư vùng đầu và cổ.
