ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) - năm 2009, Việt Nam đứng thứ 4 thế giới về chăn nuôi lợn với 27,6 triệu con. Tổng cục Hải quan cho biết, năm 2015 số lượng đàn heo giống nhập khẩu cả nước là 2.146 con, tăng 90,6% so với năm 2014. Bên cạnh sự phát triển về chăn nuôi, tình hình dịch bệnh xảy ra ở đàn lợn cũng gây không ít khó khăn cho chăn nuôi. Ở Việt Nam, trước năm 2007, Porcine parvovirus (PPV) và Porcine pseudorabies virus được xác định là nguyên nhân virus gây hội chứng rối loạn sinh sản (RLSS) ở lợn (Trần Duy Khanh, 2004).
Tuy nhiên, kể từ khi bệnh Tai xanh xuất hiện, có rất ít nghiên cứu liên quan tới PPV được thực hiện. Porcine parvovirus gây bệnh chủ yếu trên lợn nái và lợn con theo mẹ với khả năng lây nhiễm và phá hủy cả phôi thai và bào thai. Virus được xác định bởi kháng thể có trong huyết thanh hoặc kháng nguyên virus trong bào thai, nó có mặt ở khắp mọi nơi (Van Leengoed, 1983) và gây ra hội chứng thai chết lưu và khô thai ở lợn (Mengeling, 2000). Ngày nay, PPV còn được biết đến như là một yếu tố kích hoạt trong sinh bệnh học của hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa do porcine circovirus type 2 gây ra (Ellis et al.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định sự lưu hành của Porcine Parvovirus (PPV) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận” nhằm: - Xác định sự lưu hành (huyết thanh học và virus) của PPV ở đàn lợn nuôi tại các khu vực nghiên cứu; - Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học phân tử của PPV ở đàn lợn tại khu vực nghiên cứu. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài này đã cung cấp bằng chứng huyết thanh học về sự lưu hành phổ biến của PPV ở lợn thịt (đối tượng không được sử dụng vacxin phòng bệnh do PPV gây ra). Các kết quả thu được đã góp phần làm giàu thêm hiểu biết về đặc điểm dịch tễ học của virus lưu hành ở nước ta. 1 - Đề tài này nghiên cứu sự lưu hành PPV dưới hai khía cạnh: huyết thanh học và virus.
Trong bối cảnh PPV được chứng minh là yếu tố kích hoạt quan trọng trong sinh bệnh học của hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa, việc chỉ ra mức độ lưu hành phổ biến của PPV ở đàn lợn sẽ là cơ sở khoa học quan trọng cho việc điều chỉnh lịch sử dụng vacxin phòng bệnh ở lợn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PORCINE PARVOVIRUS Hội chứng rối loạn sinh sản (RLSS) ở lợn là thuật ngữ dùng để chỉ các hiện tượng vô sinh, tỷ lệ thụ thai thấp, rối loạn chu kỳ động dục, sảy thai, thai chết lưu, thai ướp, thai gỗ, thai dị hình, lợn con đẻ ra chết yểu,. Ngày nay khái niệm về RLSS được mở rộng hơn, nó bao gồm tất cả những hiện tượng sinh sản không bình thường, như phối giống nhiều lần nhưng không thụ thai, lợn mẹ chậm động dục, chửa giả, thời gian chửa kéo dài, số lượng lợn con mỗi lứa đẻ ít.
RLSS ở lợn là một hội chứng hết sức phức tạp, do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra. Các nguyên nhân gây RLSS ở lợn thường được đề cập như: vi khuẩn Brucella, xoắn khuẩn Leptospira, virus Aujeszky, virus dịch tả lợn, Parvovirus, nấm mốc và độc tố nấm mốc, rối loạn nội tiết, cơ quan sinh dục không bình thường (dị dạng), thời tiết,. Từ những năm 1990 đến nay, hội chứng hô hấp và rối loạn sinh sản ở lợn (PRRS) là một bệnh gây rối loạn sinh sản gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Porcine parvovirus (PPV) được phân lập lần đầu tiên từ những thai ướp, thai sảy.
Bằng phương pháp nghiện cứu gây bệnh thực nghiệm cho lợn con và lợn nái có chửa, nhiều nhà khoa học đã chỉ rõ PPV gây RLSS với đặc tính lây nhiễm gây chết phôi, chết thai và thường ở lợn mẹ không có triệu chứng lâm sàng. Bệnh phát triển chủ yếu ở lợn mẹ có huyết thanh âm tính và nhiễm virus theo đường mũi, miệng vào giai đoạn đầu mang thai, hậu quả là hợp tử bị nhiễm qua nhau thai trước khi chúng có khả năng đáp ứng miễn dịch. Sự lây nhiễm PPV ngoài thời kỳ mang thai không có ý nghĩa, vì PPV không gây bất kỳ triệu chứng lâm sàng nào ngoài gây chết phôi, chết thai. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy PPV phân bố rộng rãi ở đàn lợn khắp nơi trên thế giới, là bệnh có tính chất địa phương.
Kết quả điều tra cho thấy PPV là nguyên nhân chính gây hiện tượng nhiễm trùng phôi và chết thai (Cartwright S. PPV được xác định là ngoài nguyên nhân gây RLSS ở lợn còn góp phần khiến cho lợn nhiễm Porcine circovirus type 2 (PCV2) mắc chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) (Krakowka, 2000, Opriessnig, 2004). Căn bệnh Porcine parvovirus (PPV) được xếp vào giống Parvovirus (tiếng Latin parvus = nhỏ bé) thuộc họ Parvoviridae (Bachmann, 1979, Siegl, 1976). Tất cả các chúng PPV trên thế giới được so sánh đều có tính kháng nguyên tương tự nhau (nếu không nói là giống hệt nhau) (Cartwright, 1969, Johnson R.
PPV còn có kháng nguyên giống với một số virus khác trong giống (Cotmore, 1983, Mengeling, 1986, Mengeling, 1988). Tuy nhiên, tính tương đồng này có thể được xác định bằng các phản ứng huyết thanh học tương đối chặt chẽ như phản ứng trung hòa (virus neutralization, VN) và phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (hemagglutination inhibition, HI). PPV được phân lập lần đầu tiên tại Anh và được công bố vào năm 1967., 1967) phân lập được PPV có liên quan đến RLSS, sau đó tiến hành kiểm tra huyết thanh học ở 449 trại lợn trong cả nước, kết quả kiểm tra cho thấy có 93% số trại bị nhiễm PPV. Trong đó 83% lợn nái cơ bản, 56% lợn nái hậu bị và 53% lợn đực giống kiểm tra có kháng thể kháng PPV (Robinson, 1985).
PPV gây rối loạn sinh sản ở lợn cũng được phát hiện tại nước Pháp. PPV phân bố phổ biến trong đàn lợn ở Pháp với tỷ lệ nhiễm PPV chung trên tổng đàn là 58%, trong đó 80% lợn nái và 37% lợn đực giống nhiễm PPV. Ở Đức, đến năm 1973 trong một cuốc điều tra về PPV cho thấy, PPV phân bố phổ biến ở đàn lợn trong cả nước, 79,5% số lợn nuôi bị nhiễm PPV, 65,5% số mẫu thu thập được ở lợn rừng cho kết quả dương tính với PPV ở hiệu giá kháng thể từ 1:20 đến 1:2560. Hình thái, cấu trúc PPV là một trong những virus trần hình khối đa diện đều có kích thước nhỏ.
Đường kính của virion từ 18-26nm.Trọng lượng phân tử của virion là 5,3x10 6 Dalton. Lõi một sợi đơn DNA. Sợi DNA của PPV có trọng lượng 1,4x106 Dalton, chiếm 26,5% trọng lượng virion nguyên vẹn (Berns, 1984, Molitor, 1983, Siegl, 1976). Capsid là lớp vỏ, trực tiếp bao lấy lõi DNA của virus.
Capsid của PPV gồm 32 capxome xếp theo kiểu đối xứng hình cầu chặt chẽ tạo thành các mặt đa diện bao quanh lõi DNA. Capsid có chức năng chính bảo vệ lõi DNA khỏi tác động của môi trường, ngoài ra capsid còn tham gia hấp thụ virus vào tế bào thụ cảm. Quá trình hấp thụ virus vào tế bào cảm thụ được quyết định bởi mối tương tác 4 giữa virus và thụ thể tế bào, trong đó lực điện động đóng vai trò chủ yếu. Sự hấp thụ chỉ xảy ra khi trên bề mặt virus cũng có những cấu trúc phân tử đặc hiệu tương ứng để phát hiện và gắn vào thụ thể tế bào.
Capsid quyết định tính kháng nguyên của PPV. Sự nhân lên của virus Sự nhân lên của PPV khi nuôi cấy nhân tạo đặc trưng là hiện tượng diệt tế bào (cytocidal) đặc trưng bởi sự kết đặc nhân tế bào (pyknosis) và dung giải tế bào (lysis of cell) (hình 2. Nhiều mảnh tế bào bám lại khiến cho chai nuôi cấy có hiện tượng bong tróc. Các tiểu thể bao hàm hình thành trong nhân nhưng rất thưa thớt; đồng thời môi trường có hiện tượng hấp phụ hồng cầu (Cartwright, 1969, Rondhuis P.
Biến đổi bệnh tích tế bào ngày càng nhiều khi virus đã thích ứng nhân lên trên môi trường tế bào trong điều kiện thích hợp. Tuy nhiên, khi phân lập virus từ bệnh phẩm, cần phải qua một vài lần cấy chuyển để virus nhân lên tốt. Việc sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence), soi dưới kính hiển vi sẽ giúp cho việc xác định sự nhân lên của virus trên môi trường tế bào dễ dàng hơn. Môi trường tế bào thận bào thai lợn hoặc lợn con sơ sinh sơ cấp hoặc thứ cấp (primary and secondary culture of fetal or neonatal porcine kidney cells) thường được sử dụng để cấy chuyển và xác định hiệu giá PPV.
Sự nhân lên của virus sẽ được tăng lên khi gây nhiễm vào tế bào đang giai đoạn phân chia (Bachmann, 1972, Cartwright, 1969, Hallauer, 1972); đặc biệt giai đoạn S (pha sinh tổng hợp ADN). Nếu sử dụng huyết thanh bào thai bê hoặc huyết thanh bò trưởng thành nhằm bổ sung dinh dưỡng cho môi trường nuôi cấy tế bào cần phải kiểm tra chất ức chế sự nhân lên của virus (Coackley W. Bên cạnh đó, môi trường tế bào cũng phải kiểm tra trước xem có bị nhiễm PPV không (Lucas M. Nếu môi trường bị nhiễm virus, tế bào nuôi cấy có thể được cấy chuyển nhiều lần trong môi trường có bổ sung kháng thể kháng PPV(Mengeling, 1978).
Một phương pháp có thể sử dụng để xác định sự nhân lên của virus trong môi trường tế bào là sử dụng kính hiển vi huỳnh quang. Thông thường virus nhân lên trong nguyên sinh chất tế bào rất nhanh ngay sau khi gây nhiễm với một lượng lớn virus. Tế bào bị gây nhiễm bởi PPV (A) Bệnh tích tế bào (CPE) khi nuôi cấy trên môi trường tế bào thận bào thai lợn thứ cấp (Mengeling, 1972); (B) Hiện tượng hấp phụ hồng cầu (hemadsorption) sử dụng tế bào tuyến giáp lợn trưởng thành (secondary adult porcine thyroid cells), hồng cầu chuột lang, 22 giờ sau khi gây nhiễm và cấy chuyển Dấu hiệu đầu tiên có thể nhận biết sự nhân lên của virus là sự xuất hiện kháng nguyên virus non (nascent viral antigen) trong nhân tế bào (hình 2.2A), khiến cho nhân và nguyên sinh chất phát sáng huỳnh quang. Các tế bào bị nhiễm thường được tìm thấy trong phổi của bào thai sảy có hiệu giá cao kháng thể kháng PPV rất cao trong giai đoạn đang phân chia (hình 2.
Tế bào bị nhiễm sau đó co tròn, nhân đặc lại và tan ra cùng với sự giải phóng virus và kháng nguyên virus (hình 2.