HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN NHŨ DẦU PHÒNG HỘI CHỨNG GIẢM ĐẺ Ở Gà (EGG DROP SYNDROME-EDS’76) TẠI CÔNG TY FIVEVET Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: TS. Trương Hà Thái TS. Trịnh Quang Đại NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 03 tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Đức i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trương Hà Thái và TS Trịnh Quang Đại đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức công ty Cổ phần thuốc thú y Trung Ương 5 đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 03 tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Đức ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.
vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract.
Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Tổng quan tài liệu. Hiểu biết chung về hội chứng giảm đẻ EDS (egg drop syndrome).
Giới thiệu chung. Vi rút gây bệnh hội chứng giảm đẻ. Hội chứng giảm đẻ EDS 76. Hiểu biết chung về vắc xin.
Những đặc tính cơ bản của vắc xin. Sản xuất vắc xin bằng phương pháp vô hoạt vi rút. Chất bổ trợ. Hiểu biết chung về miễn dịch.
Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS). Đánh giá và kiểm tra chất lượng vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS).
Đối tượng, nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu. 19 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu.
Các loại dung dịch, môi trường. Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu. Tiêm vào xoang niệu mô.
Phương pháp nhân vi rút trên trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi. Phương pháp làm HA, HI. Phương pháp xác định EID50. Xác định vi rút và chuẩn độ vi rút EDS trong nước trứng thu được.
Bất hoạt vi rút. Kiểm tra bất hoạt. Phương pháp nhũ hóa vắc xin. Phương pháp kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin.
Quy trình sản xuất vắc xin. Kiểm tra chất lượng vắc xin. Phương pháp tiêm vắc xin và thu thập huyết thanh. Phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học.
Kết quả và thảo luận. Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng giảm đẻ EDS’76. Xác định liều gây nhiễm vi rút EDS trên phôi trứng vịt 10-11 ngày và thời gian thu vi rút trên phôi trứng vịt. Nghiên cứu tối ưu nồng độ chất bất hoạt trong vắc xin.
Nghiên cứu xác định liều vi rút sử dụng trong vắc xin. Nghiên cứu quá trình nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ vắc xin. Đánh giá và kiểm tra chất lượng vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS). Nghiên cứu sản xuất 03 lô vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ gà.
Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội hội chứng giảm đẻ EDS ở gà. Kiểm tra hiệu lực và độ dài miễn dịch vắc xin trên gà 4-6 tuần tuổi. Kết luận và kiến nghị. 50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Giống vi rút EDS’76 có các đặc điểm và chỉ số sau đây. Vắc xin EDS đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực trong quá trình kiểm nghiệm. 51 Tài liệu tham khảo. 52 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BPL β probiolacton ĐC Đối chứng EDS Egg Drop Syndrome EID50 Embryo Infective Dosage 50 (Liều gây nhiễm 50% phôi) FiveVet Central Veterinary Medicine JSC No.5 GMP Good Manufacturing Practices (Thực hành sản xuất tốt) HGKT Hiệu giá kháng thể HI Haemagglutination inhibition IHA Indirect Haemagglutination Assay (Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp) PBS Phosphate Buffered Saline SPF Specific Pathogen-Free VX Vắc xin WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) HT Huyết thanh TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam HC Hồng cầu vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.
Bảng phân loại họ Adenoviridae. Công thức Reed & Muench tính EID50. Bố trí thí nghiệm tại nhà nuôi động vật. Xác định liều gây nhiễm và thời gian thu hoạch.
Kết quả nghiên cứu bất hoạt kháng nguyên EDS với formol ở ba nồng độ 0,05%, 0,1%, 0,2%. Xác định liều vi rút sử dụng trong vắc xin. Kết quả lý hóa sau nhũ hóa vắc xin bằng dầu khoáng ISA 71 VG. Kết quả hiệu giá thu được 3 lô kháng nguyên liên tiếp.
Kết quả kiểm tra vô trùng. Kết quả xác định EID50 của vi rút EDS. Kết quả EID50 của 3 lô kháng nguyên. Kết quả kiểm tra vi rút sau vô hoạt trên phôi vịt ở nồng độ 0,1%.
Kết quả kiểm tra vô trùng. Kết quả của ba lô sản xuất. Kết quả kiểm tra cảm quan vắc xin EDS vô hoạt. Kết quả vô trùng của 3 lô vắc xin.
Kiểm tra tính ổn định của vắc xin. Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vắc xin nhũ dầu trên gà. Biến động hiệu giá kháng thể kháng vi rút EDS ở gà 4-6 tuổi chưa được miễn dịch cơ sở EDS. 47 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.
Cấu tạo hính thái. Trứng biến đổi. Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin EDS’76 nhũ dầu chế trên phôi vịt. Hình ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng vi rút EDS.
Biểu đồ thể hiện hiệu giá HI (log2) theo dõi trong 84 ngày. Hình ảnh về HI. 49 vii i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Văn Đức Tên luận văn: Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng Hội Chứng Giảm Đẻ ở gà (EGG DROP SYNDROME-EDS’76) tại công ty FIVEVET. Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu và xây dựng quy trình sản xuất vắc xin đơn giá vô hoạt nhũ dầu với qui mô phòng thí nghiệm.
- Xây dựng một số chỉ tiêu kỹ thuật cơ bản trong qui trình sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin EDS’76 vô hoạt nhũ dầu. - Thông qua quá trình thử nghiệm đánh giá được hiệu lực, độ dài miễn dịch của vắc xin EDS’76 vô hoạt nhũ dầu. Phƣơng pháp nghiên cứu Đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau: Tiêm vào xoang niệu mô, phương pháp nhân vi rút trên trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi, phương pháp làm HA, HI, phương pháp xác định EID50, phương pháp xác định virus và chuẩn độ virus EDS trong nước trứng thu được, phương pháp bất hoạt virus, phương pháp nhũ hóa vắc xin, phương pháp kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin, quy trình sản xuất vắc xin, kiểm tra chất lượng vắc xin, phương pháp tiêm vắc xin và thu thập huyết thanh, phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học. Kết quả chính và kết luận Giống virus EDS’76 có các đặc điểm và chỉ số sau đây: Liều gây nhiễm thích hợp nhất đối với virus hội chứng giảm đẻ EDS trên phôi vịt là 200EID50.
Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus EDS thích hợp nhất, hàm lượng virus cao, chất lượng tốt là sau gây nhiễm virus là 96 giờ. - Bất hoạt vi rút ở nồng độ Formol 0,1% ở điều kiện 40C trong 24 giờ Hiệu giá HA= 12-13 Log2 Hiệu giá gây nhiễm 50% phôi vịt EID50/1ml là 107,5. Virus EDS’76 đáp ứng được yêu cầu kỹ thuật về tính an toàn và đặc tính gây miễn dịch. ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vắc xin EDS đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực đã được thử nghiệm tại thực địa.
Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà đảm bảo theo tiêu chuẩn TCVN 8685-4:2011 Vắc xin vô trùng và an toàn 100% khi tiêm gấp đôi liều sử dụng và có hiệu lực tốt. Đảm bảo an toàn trong thử nghiệm chủng 2 liều cho gà. Tạo được kháng thể EDS cho gà sau khi chủng theo tiêu chuẩn TCVN 8685-4:2011 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Van Duc Thesis title: Research on the production of inactivated oil emulsion vaccine for the prevention of Egg drop syndrome-EDS’76 at Fivevet company Major: Veterinary Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives - To research and establish the production process of the inactivated oil emulsion vaccine at laboratory scale. - To establish some basic technical criteria in the production process and quality testing methods for EDS’76 vaccine.
- To evaluate the efficacy, the duration of immunity in chickens vaccinated by EDS’76 inactivated oil emulsion vaccine. Materials and Methods This study used the following methods: production of the virus on embryonated duck eggs (10 -11 days) via allantoic sac. Haemagglutination test (HA) and haemagglutination inhibition (HI) test. Method to calculate egg infective dose 50 (EID 50).
End point titration method to determine the titer of virus in allantoic fluid.