Tổng quan nghiên cứu

Việc kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm trong chuỗi cung ứng thịt gia súc là nhiệm vụ cấp thiết nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giữ vững đà tăng trưởng kinh tế. Tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, tỉnh Kiên Giang giữ vai trò trọng điểm về sản xuất nông sản và thực phẩm với tổng sản phẩm trên địa bàn (GRDP) năm 2018 đạt 21.528 tỷ đồng, tăng trưởng 5,7% so với năm 2017. Tuy nhiên, vì mục tiêu lợi nhuận, tình trạng lạm dụng chất tăng trọng nhóm Beta-agonist (tạo nạc, giảm mỡ, rút ngắn thời gian nuôi) vẫn diễn biến phức tạp. Theo nghiên cứu của Chử Văn Tuất, có tới 4,3% mẫu thịt heo và 6,3% mẫu nước tiểu heo tại các lò mổ phía Bắc cho kết quả dương tính với salbutamol (hàm lượng dao động từ 2,86 µg/kg đến 6.810,0 µg/kg). Tồn dư các hợp chất này qua đường ăn uống có thể dẫn đến ngộ độc cấp tính và mãn tính, gây loạn nhịp tim, tăng huyết áp, run cơ, rối loạn thần kinh, thậm chí đe dọa tính mạng người tiêu dùng.

Nhằm ngăn chặn hiểm họa trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành Thông tư số 21/2019/TT-BNNPTNT đưa Salbutamol và Clenbuterol vào danh mục 25 hóa chất cấm trong chăn nuôi. Đồng thời, Thông tư số 01/2016/TT-BNNPTNT quy định ngưỡng phát hiện để xử lý vi phạm trong mẫu thịt đối với Clenbuterol là 0,2 ppb, Ractopamine là 1,0 ppb và Salbutamol là 5,0 ppb. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất của học viên Trần Thị Huỳnh (Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, 2021) đã thực hiện đề tài xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng thời dư lượng Salbutamol, Ractopamine và Clenbuterol trong thịt gia súc (thịt heo và thịt bò) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối khối phổ ba lần tứ cực (LC-MS/MS). Nghiên cứu được triển khai từ tháng 02/2020 đến tháng 06/2021, hướng tới việc cung cấp một công cụ kiểm nghiệm có độ nhạy cao, độ chọn lọc vượt trội, phục vụ giám sát thực phẩm an toàn tại Kiên Giang và cả nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng dược lý học và độc chất học của nhóm chất chủ vận thụ thể Beta-2 adrenergic (Beta-agonist), kết hợp với nguyên lý phân tích hiện đại trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần liên tiếp (LC-MS/MS).

  • Dược lý học nhóm Beta-agonist: Beta-agonist là các dẫn xuất tổng hợp của catecholamin (adrenalin), có tác dụng kích thích thụ thể Beta-2 trên cơ trơn, làm giãn phế quản trong điều trị hen suyễn. Khi đưa vào cơ thể vật nuôi với liều cao (1.000 - 6.000 mg/ngày), hợp chất này kích thích chuyển hóa các chất dinh dưỡng từ mô mỡ sang mô cơ, tăng tổng hợp protein, làm giảm độ dày mỡ lưng từ 1,0 - 1,5 cm xuống còn khoảng 0,4 cm. Các hợp chất tiêu biểu gồm Salbutamol (C13H21NO3, phân tử lượng 239,152 Da), Ractopamine (C18H23NO3, phân tử lượng 301,167 Da) và Clenbuterol (C12H18Cl2N2O, phân tử lượng 276,079 Da).
  • Lý thuyết ion hóa và phân tích khối phổ ba lần tứ cực (QQQ): Hệ thống sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử chế độ dương (ESI+), trong đó dung dịch phân tích đi qua ống mao quản điện thế từ 2,0 kV đến 4,5 kV. Bộ phân tích khối QQQ hoạt động theo chế độ quan trắc đa phản ứng (MRM): tứ cực Q1 lọc chọn ion phân tử mẹ [M+H]+ (m/z 240,12 đối với Salbutamol; 302,14 đối với Ractopamine; 277,05 đối với Clenbuterol), buồng va chạm Q2 phân rã ion mẹ thành các ion phân mảnh đặc trưng dưới tác động của khí trơ Argon/Nitơ, và tứ cực Q3 ghi nhận các ion định lượng và định danh.
  • Kỹ thuật xử lý mẫu chiết xuất pha rắn và tủa protein kết hợp QuEChERS biến tính: Tận dụng tính chất dung môi phân cực và muối vô cơ để tách chiết hoạt chất ra khỏi chất béo, protein phức tạp trong nền thịt gia súc.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng thiết kế thực nghiệm phân tích kiểm nghiệm với tổng quy mô 282 mẫu thử nghiệm, phân bổ chi tiết qua 3 giai đoạn:

  1. Giai đoạn phát triển quy trình (99 mẫu): Khảo sát tối ưu hóa các thông số khối phổ (nguồn ESI+, thế mao quản, năng lượng va chạm CE, tốc độ khí hóa hơi) và điều kiện sắc ký (cột C18, pha động Acetonitril - Nước chứa Acid formic 0,1%), đồng thời tối ưu hóa quy trình chiết xuất mẫu (dung môi, khối lượng muối, tỷ lệ pha loãng, thời gian ngâm lạnh loại tạp).
  2. Giai đoạn thẩm định quy trình (168 mẫu): Thẩm định toàn diện các chỉ tiêu phân tích theo hướng dẫn quốc tế EC-657/2002 của Ủy ban châu Âu và AOAC 2002, bao gồm: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu (hệ thống điểm nhận danh ≥ 4 điểm), độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại (7 lần/nồng độ tại 3 mức nồng độ 0,5; 1,0 và 1,5 lần MRL), độ tái lập (tiến hành ở 3 thời điểm khác nhau) và độ thu hồi.
  3. Giai đoạn ứng dụng thực tế (15 mẫu): Thu thập 15 mẫu thịt heo và thịt bò tươi sống tại các chợ truyền thống và siêu thị trên địa bàn tỉnh Kiên Giang theo tiêu chuẩn TCVN 4833-1:2002 (khối lượng lấy từ 0,5 kg đến 1,0 kg/mẫu, đóng gói trong túi PE/HDPE vô trùng, vận chuyển lạnh về phòng kiểm nghiệm trong vòng 24 giờ).

Phương pháp LC-MS/MS được lựa chọn thay thế cho các kỹ thuật miễn dịch (ELISA - dễ dương tính giả do phản ứng chéo) và sắc ký khí GC-MS (đòi hỏi chất bền nhiệt và dẫn xuất hóa phức tạp) nhờ độ nhạy vượt bậc tới mức phần tỷ (ppb), khả năng phân tích đồng thời nhiều chất và loại trừ hoàn toàn nhiễu nền sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình phân tích đồng thời 3 chất cấm Beta-agonist với các chỉ số kỹ thuật xuất sắc:

  • Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu siêu tinh sạch: Quy trình sử dụng 2,0 g mẫu thịt đồng nhất, chiết bằng 3,0 mL Acetonitril kết hợp hỗn hợp muối vô cơ (0,48 g NaCl; 1,6 g Na2SO4; 0,4 g MgSO4). Dịch chiết sau ly tâm được làm bay hơi bằng dòng khí nitơ ở 40 ºC, hòa tan cắn trong 1,0 mL hỗn hợp Acetonitril 10% trong dung dịch Acid formic pH 3,00, sau đó ngâm lạnh ở -20 ºC trong 30 phút để loại bỏ triệt để chất béo và lọc qua màng teflon 0,2 µm. Hiệu suất thu hồi quy trình chiết đạt trên 85,0% đối với cả 3 chất.
  • Tính đặc hiệu và điểm nhận danh tuyệt đối: Phương pháp đạt trọn vẹn 4,0 điểm nhận danh theo chuẩn EC-657/2002 cho mỗi chất (1 ion tiền thân tương ứng 1,0 điểm và 2 ion sản phẩm tương ứng 1,5 điểm x 2). Tỷ lệ ion mảnh phân tích hoàn toàn nằm trong giới hạn sai lệch cho phép (dưới ±20% đối với ion có cường độ >50%). Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu trên sắc ký đồ đều nhỏ hơn 0,5% (thấp hơn nhiều so với quy định tối đa 2,5%).
  • Độ nhạy vượt trội và khoảng tuyến tính rộng:
    • Salbutamol: Khoảng tuyến tính 0,5 - 20,0 ppb, hệ số tương quan R² = 0,9993, LOD = 0,15 ppb, LOQ = 0,50 ppb.
    • Ractopamine: Khoảng tuyến tính 1,0 - 40,0 ppb, hệ số tương quan R² = 0,9991, LOD = 0,30 ppb, LOQ = 1,00 ppb.
    • Clenbuterol: Khoảng tuyến tính 0,10 - 0,80 ppb, hệ số tương quan R² = 0,9995, LOD = 0,03 ppb, LOQ = 0,10 ppb.
  • Độ lặp lại, độ tái lập và độ thu hồi cao: Tại cả 3 mức nồng độ khảo sát (0,5 MRL; 1,0 MRL; 1,5 MRL), độ lệch chuẩn tương đối về độ lặp lại và độ tái lập đều đạt RSD < 8,5% (đáp ứng yêu cầu EC-657/2002 là RSD < 15%). Độ thu hồi thực tế của quy trình dao động ổn định trong khoảng 88,4% đến 102,6%.
  • Khảo sát thực tế trên địa bàn tỉnh Kiên Giang: Phân tích 15 mẫu thịt gia súc (gồm 8 mẫu thịt heo và 7 mẫu thịt bò) thu thập tại các siêu thị và chợ truyền thống tại Kiên Giang cho thấy 100% mẫu khảo sát không phát hiện dư lượng Salbutamol, Ractopamine và Clenbuterol vượt ngưỡng hành động của Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT.

Thảo luận kết quả

Dữ liệu phân tích trong nghiên cứu có thể được trực quan hóa rõ nét thông qua việc tích hợp bảng tổng hợp các thông số thẩm định (R², LOD, LOQ, RSD%, % Thu hồi) và biểu đồ sắc ký đồ đa kênh MRM chồng phổ (Overlaid Chromatograms) thể hiện sự tách biệt sắc nét giữa mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu thử thực tế.

Việc kết hợp kỹ thuật tủa protein bằng Acetonitril với hỗn hợp muối trung tính (NaCl, Na2SO4, MgSO4) và bước ngâm lạnh -20 ºC trong 30 phút chứng minh hiệu quả vượt trội so với phương pháp chiết pha rắn (SPE) truyền thống. Trong khi các nghiên cứu quốc tế của Xu (2019) hay Mastrianni (2018) phải sử dụng cột chiết SPE đắt tiền và tốn nhiều dung môi hữu cơ độc hại, quy trình QuEChERS biến tính này giúp giảm 65% chi phí hóa chất phân tích và rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 60 phút/mẻ nhưng vẫn duy trì hiệu ứng nền mẫu (Matrix Effect) ở mức dưới ±15%.

So sánh với các nghiên cứu trong nước, ngưỡng phát hiện của phương pháp này tương đương với nghiên cứu của Nguyễn Hữu Giang (2017) trên nền gan/thịt heo (LOD = 0,06 ppb), nhưng có ưu thế lớn là tối ưu hóa đồng thời trên cả hai nền mẫu phức tạp là thịt heo và thịt bò, kiểm soát hoàn hảo tính biến thiên cấu trúc lipid khác nhau giữa hai loài gia súc. Kết quả kiểm tra mẫu thực tế âm tính tại Kiên Giang phản ánh tín hiệu khả quan từ công tác quản lý nhà nước sau khi các chế tài xử phạt hành chính theo Nghị định 90/2017/NĐ-CP được thực thi nghiêm ngặt.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp mang tính hành động cao:

  1. Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kiểm nghiệm: Đề nghị Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc - Mỹ phẩm - Thực phẩm và Chi cục Chăn nuôi & Thú y tỉnh Kiên Giang tiếp nhận chuyển giao quy trình LC-MS/MS này. Mục tiêu giảm thời gian trả kết quả phân tích mẫu thịt nghi vấn từ 48 giờ xuống dưới 4 giờ, đảm bảo phát hiện chính xác dư lượng Clenbuterol ở ngưỡng 0,03 ppb và Salbutamol ở ngưỡng 0,15 ppb.
  2. Nâng cấp năng lực trang thiết bị và thẩm định liên phòng: Sở Y tế và Sở Nông nghiệp & Phát triển nông thôn các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long cần đầu tư đồng bộ hệ thống sắc ký lỏng khối phổ ba lần tứ cực (LC-MS/MS), phấn đấu 100% phòng kiểm nghiệm tuyến tỉnh đạt chuẩn ISO/IEC 17025 đối với chỉ tiêu phân tích chất cấm Beta-agonist trước năm 2025.
  3. Tăng cường thanh tra đột xuất tại các cơ sở giết mổ tập trung: Đội ngũ Quản lý thị trường phối hợp liên ngành Thú y triển khai lấy mẫu định kỳ và đột xuất tại 100% cơ sở giết mổ gia súc quy mô lớn. Áp dụng mức xử phạt kịch khung theo Nghị định số 90/2017/NĐ-CP đối với các hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi nhằm duy trì tỷ lệ mẫu vi phạm ở mức 0%.
  4. Mở rộng phạm vi nghiên cứu trên các ma trận sinh học phức tạp: Nhóm nghiên cứu đề xuất tiếp tục phát triển quy trình phân tích trên các nền mẫu nội tạng gia súc (gan, thận, phổi) và nước tiểu trong giai đoạn 2022 - 2024, bởi đây là những cơ quan tích lũy nồng độ Beta-agonist cao hơn từ 10 đến 100 lần so với mô cơ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị thực tiễn và học thuật sâu sắc, đặc biệt phù hợp với các nhóm độc giả sau:

  • Cán bộ kiểm nghiệm và chuyên viên phân tích độc chất: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về điều kiện vận hành thiết bị LC-MS/MS (thông số nguồn ESI+, thế mao quản, năng lượng va chạm MRM) và kỹ thuật xử lý nền mẫu thịt gia súc nhanh gọn, tiết kiệm chi phí.
  • Cơ quan quản lý nhà nước về An toàn thực phẩm và Thú y: Cung cấp cơ sở khoa học và bằng chứng thực nghiệm vững chắc để xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN), đồng thời phục vụ công tác thanh tra, giám sát chất cấm trong chuỗi cung ứng thực phẩm tươi sống.
  • Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa phân tích, Dược học, Độc chất học: Cung cấp mô hình thẩm định phương pháp phân tích toàn diện theo chuẩn quốc tế EC-657/2002 và AOAC 2002 với đầy đủ công thức tính toán và biện luận khoa học.
  • Doanh nghiệp chăn nuôi, chế biến và xuất khẩu thịt gia súc: Giúp các kỹ sư kiểm soát chất lượng (QC/QA) hiểu rõ cơ chế tồn dư và phương pháp tầm soát chất tăng trọng, từ đó thiết lập quy trình kiểm soát nguyên liệu đầu vào đạt tiêu chuẩn xuất khẩu sang các thị trường khó tính như EU và Hoa Kỳ.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần phải phân tích đồng thời cả 3 chất Salbutamol, Ractopamine và Clenbuterol?
Trong thực tế chăn nuôi trái phép, người nuôi có xu hướng trộn lẫn hoặc thay đổi linh hoạt giữa các dẫn xuất Beta-agonist nhằm né tránh sự kiểm tra đơn chất thông thường. Việc phân tích đồng thời 3 hoạt chất trong một lần tiêm mẫu giúp tiết kiệm hơn 60% thời gian chạy máy, giảm chi phí dung môi và cung cấp bức tranh toàn diện về tình trạng tồn dư chất cấm.

2. Kỹ thuật xử lý mẫu trong nghiên cứu có ưu điểm gì nổi bật so với phương pháp truyền thống?
Quy trình sử dụng phương pháp QuEChERS biến tính kết hợp ngâm lạnh -20 ºC trong 30 phút để tủa lipid triệt để thay vì dùng cột chiết pha rắn (SPE) đắt đỏ. Kỹ thuật này giúp loại bỏ hoàn toàn hiện tượng tắc nghẽn đầu dò khối phổ, đạt độ thu hồi hoạt chất từ 88,4% đến 102,6% mà chỉ tiêu tốn 3,0 mL Acetonitril cho mỗi mẫu 2,0 g thịt.

3. Khái niệm "điểm nhận danh" (Identification Points) theo tiêu chuẩn EC-657/2002 được áp dụng thế nào?
Theo quy định EC-657/2002 đối với kỹ thuật LC-MS/MS, việc định danh một chất cấm cần tối thiểu 4,0 điểm nhận danh. Trong nghiên cứu này, mỗi chất được xác định bằng 1 ion phân tử mẹ (1,0 điểm) và 2 ion phân mảnh đặc trưng (mỗi ion đạt 1,5 điểm), tổng cộng đạt 4,0 điểm, đảm bảo loại trừ 100% nguy cơ nhầm lẫn phổ và kết quả dương tính giả.

4. Giới hạn định lượng (LOQ) của quy trình có đáp ứng yêu cầu pháp lý tại Việt Nam không?
Hoàn toàn đáp ứng vượt trội. Quy chuẩn Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT quy định ngưỡng hành động phát hiện đối với Clenbuterol là 0,2 ppb, Ractopamine là 1,0 ppb và Salbutamol là 5,0 ppb. Trong khi đó, LOQ thực tế của phương pháp đạt 0,10 ppb đối với Clenbuterol, 1,00 ppb đối với Ractopamine và 0,50 ppb đối với Salbutamol, đủ độ nhạy để phát hiện sớm các vi phạm.

5. Phương pháp LC-MS/MS này có thể mở rộng cho các loại thực phẩm khác ngoài thịt heo và thịt bò không?
Có thể mở rộng áp dụng. Nguyên lý chiết tách và điều kiện phân tích khối phổ trong luận văn hoàn toàn có thể áp dụng cho các nền mẫu khác như thịt gia cầm, phủ tạng (gan, thận) hoặc thủy hải sản sau khi hiệu chỉnh một số thông số nhỏ về tỷ lệ dung môi chiết và thời gian ly tâm để tương thích với hàm lượng lipid từng loại mẫu.

Kết luận

  • Luận văn đã xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời Salbutamol, Ractopamine và Clenbuterol trong thịt heo và thịt bò bằng hệ thống UPLC-MS/MS hiện đại.
  • Quy trình chuẩn bị mẫu kết hợp QuEChERS và hạ nhiệt độ sâu giúp tiết kiệm 65% chi phí hóa chất, thời gian xử lý mẫu dưới 60 phút, độ thu hồi đạt từ 88,4% đến 102,6%.
  • Phương pháp được thẩm định toàn diện trên 168 mẫu theo chuẩn EC-657/2002 và AOAC 2002, đạt độ nhạy cực cao với LOD từ 0,03 đến 0,30 ppb và LOQ từ 0,10 đến 1,00 ppb.
  • Ứng dụng kiểm nghiệm thực tế trên 15 mẫu thịt tại tỉnh Kiên Giang ghi nhận 100% mẫu đạt chỉ tiêu an toàn, không phát hiện tồn dư vượt ngưỡng quy định.
  • Quy trình có tính ứng dụng thực tiễn cao, sẵn sàng chuyển giao cho các phòng kiểm nghiệm độc chất trên toàn quốc nhằm siết chặt an toàn thực phẩm chuỗi thịt giai đoạn 2021 - 2025. Các cơ quan kiểm nghiệm và viện nghiên cứu quan tâm có thể triển khai áp dụng quy trình để nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng thực phẩm tại đơn vị.