Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu biểu hiện protein e2 của virus dịch tả lợn cổ điển classical swine fever bằng hệ thống baculovirus

Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống baculovirus, góp phần vào việc phát triển vaccine hiệu quả.

• Tác giả: Xengphavone Khonmany
• Người hướng dẫn: Ts. Bùi Thị Tố Nga
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever) bằng hệ thống Baculovirus
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.8. Mục tiêu của đề tài
• 1.9. Phạm vi nghiên cứu
• 1.10. Ý nghĩa khoa học
• 1.11. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.12. Tổng quan tài liệu
• 1.12.1. Hiểu biết về vi rút dịch tả lợn (DTL)
• 1.12.2. Lịch sử căn bệnh DTL ở thế giới
• 1.12.3. Lịch sử căn bệnh DTL tại Việt Nam
• 1.12.4. Cấu trúc của vi rút DTL
• 1.12.5. Sức đề kháng của vi rút DTL
• 1.13. Bệnh dịch tả lợn
• 1.13.1. Nguyên nhân gây bệnh DTL
• 1.13.2. Phương thức truyền lây
• 1.13.3. Lứa tuổi mắc bệnh
• 1.13.4. Chất chứa của và độc lực của vi rút
• 1.13.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh DTL
• 1.13.6. Phòng chống bệnh DTL
• 1.14. Vắc xin phòng dịch tả lợn
• 1.14.1. Vắc xin sản xuất trong nước và đang lưu hành tại Việt Nam
• 1.14.2. Vắc xin được phép nhập khẩu và đang lưu hành tại Việt Nam
• 1.15. Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus trong sản xuất protein tái tổ hợp của vi rút
• 1.16. Đối tượng, nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.16.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.16.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.16.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1.16.4. Nguyên liệu nghiên cứu
• 1.16.4.1. Các loại tế bào
• 1.16.4.2. Môi trường cho nuôi cấy tế bào
• 1.16.4.3. Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR
• 1.16.4.4. Hóa chất dùng trong điện di
• 1.16.4.5. Vật liệu dùng để tách dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống Baculovirus
• 1.16.4.6. Môi trường, sinh phẩm, máy móc, dụng cụ dùng trong phản ứng Western blot
• 1.16.4.7. Các vật liệu khác
• 1.16.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.16.5.1. Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy của Viện Thú y
• 1.16.5.2. Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút bằng RT– PCR, xác định TCID50 của vi rút theo phương pháp thường quy của Viện Thú y
• 1.16.5.3. Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 và nhân gen và tinh sạch DNA bằng phương pháp thường quy
• 1.16.5.4. Tạo dòng protein mã hóa E2 bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất
• 1.16.5.5. Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
• 1.16.5.6. Tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus tái tổ hợp theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất (bac-to -bac Expression System), quy trình công nghệ của Viện Thú y Nhật Bản
• 1.16.5.7. Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 trên tế bào côn trùng (theo công bố của Barbara Malitscheck et al
• 1.16.5.8. Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát hiện protein E2 tái tổ hợp
• 1.16.5.9. Phương pháp Western Blot phát hiện protein E2 tái tổ hợp
• 1.17. Kết quả và thảo luận
• 1.17.1. Kết quả nhân chủng vi rút dtl, kiểm tra các đặc tính vi rút của chủng gốc
• 1.17.2. Kết quả nuôi cấy tế bào
• 1.17.3. Kết quả gây nhiễm vi rút DTL trên dòng tế bào PK15a
• 1.17.4. Kiểm tra đặc tính củng gốc, xác định sự có mặt của vi rút DTL bằng phản ứng RT-PCR phát hiện đoạn gene noncoding E2 của vi rút DTL phân lập trên tế bào PK15a
• 1.17.5. Thiết kế mồi đặc hiệu và khuếch đại protein E2 của vi rút dịch tả lợn bằng phương pháp rt-pcr
• 1.17.6. Tạo dòng protein mã hóa E2 trong vector tách dòng pfastbac, kiểm tra trình tự khung protein biểu hiện
• 1.17.7. Tạo dòng gen E2 của vi rút dịch tả lợn trong véc tơ tách dòng pFastBac1/NT- TOPO
• 1.17.8. Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng
• 1.17.9. Kiểm tra khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng phương pháp Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) trên tế bào côn trùng và Western Blot
• 1.17.10. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống baculovirus
• 1.17.11. Kết quả thực hiện phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) đối với mẫu huyết thanh thực địa
• 1.18. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo
• Một số hình ảnh thực hiện đề tài
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 5.1. Tên tác giả: Xengphavone KHONMANY
• 5.2. Tên Luận văn: Nghiên cứu biểu hiện Protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever) bằng hệ thống Baculovirus
• 5.3. Chuyên ngành: Thú y
• 5.4. Mã số: 8640101
• 5.5. Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• 5.6. Mục đích nghiên cứu
• 5.7. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 5.8. Nội dung nghiên cứu
• 5.9. Phương pháp nghiên cứu
• 5.10. Kết quả chính và kết luận

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển

Nghiên cứu protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển (CSFV) là một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển vắc xin và các phương pháp chẩn đoán bệnh. Virus dịch tả lợn cổ điển gây ra thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn, ảnh hưởng đến kinh tế và an toàn thực phẩm. Việc hiểu rõ về protein E2, một trong những protein chính của virus, sẽ giúp cải thiện các biện pháp phòng ngừa và điều trị.

1.1. Đặc điểm của virus dịch tả lợn cổ điển

Virus dịch tả lợn cổ điển thuộc họ Flaviviridae, có cấu trúc gen RNA. Đặc điểm sinh học của virus này bao gồm khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra các triệu chứng nghiêm trọng ở lợn. Việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein E2 là cần thiết để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.2. Vai trò của protein E2 trong virus dịch tả lợn

Protein E2 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra phản ứng miễn dịch của lợn đối với virus dịch tả lợn cổ điển. Nó là một kháng nguyên chính, giúp cơ thể nhận diện và tạo ra kháng thể chống lại virus. Nghiên cứu về protein E2 sẽ cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển vắc xin.

II. Thách thức trong nghiên cứu virus dịch tả lợn cổ điển

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu virus dịch tả lợn cổ điển, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Các chủng virus mới xuất hiện và khả năng kháng thuốc của chúng đang làm cho việc kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn.

2.1. Khó khăn trong việc phát hiện virus

Việc phát hiện virus dịch tả lợn cổ điển gặp khó khăn do sự biến đổi gen của virus. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại cần được cải thiện để phát hiện nhanh chóng và chính xác hơn các chủng virus mới.

2.2. Tính kháng thuốc của virus

Sự xuất hiện của các chủng virus kháng thuốc đã làm giảm hiệu quả của các phương pháp điều trị hiện tại. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu protein E2 bằng hệ thống baculovirus

Hệ thống baculovirus là một công cụ mạnh mẽ trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Nghiên cứu protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống này cho phép tạo ra lượng lớn protein E2 với hoạt tính sinh học cao.

3.1. Nguyên lý hoạt động của hệ thống baculovirus

Hệ thống baculovirus sử dụng tế bào côn trùng để sản xuất protein tái tổ hợp. Quá trình này bao gồm việc chuyển nạp gen mã hóa protein E2 vào tế bào côn trùng, sau đó tế bào sẽ sản xuất protein E2.

3.2. Quy trình sản xuất protein E2

Quy trình sản xuất protein E2 bao gồm các bước như thiết kế mồi gen, khuếch đại gen E2, tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng. Các bước này cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng protein thu được.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protein E2 trong nghiên cứu

Protein E2 không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong việc phát triển vắc xin và các phương pháp chẩn đoán bệnh. Việc sử dụng protein E2 tái tổ hợp có thể giúp nâng cao hiệu quả của các vắc xin hiện có.

4.1. Phát triển vắc xin mới

Protein E2 tái tổ hợp có thể được sử dụng để phát triển các vắc xin mới, giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho lợn. Các nghiên cứu cho thấy rằng vắc xin dựa trên protein E2 có thể tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ.

4.2. Chẩn đoán bệnh hiệu quả hơn

Sử dụng protein E2 trong các phương pháp chẩn đoán có thể giúp phát hiện virus dịch tả lợn cổ điển một cách nhanh chóng và chính xác hơn. Điều này rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống baculovirus đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển vắc xin và các phương pháp chẩn đoán. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc kiểm soát dịch bệnh.

5.1. Tiềm năng phát triển vắc xin

Với những kết quả đạt được từ nghiên cứu protein E2, có thể phát triển các vắc xin thế hệ mới có hiệu quả cao hơn trong việc phòng ngừa dịch tả lợn cổ điển.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về protein E2 và các kháng nguyên khác của virus dịch tả lợn cổ điển để phát triển các phương pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong ngành chăn nuôi lợn, được Tổ chức Thú y Thế giới xếp vào danh mục các bệnh truyền lây loại A. Dịch bệnh đặc trưng bởi tốc độ lây lan nhanh chóng cùng tỷ lệ chết dao động từ 85% đến 100% trên đàn lợn ở mọi lứa tuổi, gây thiệt hại hàng triệu USD cho nền kinh tế chăn nuôi toàn cầu. Tại Việt Nam, kể từ khi được phát hiện lần đầu vào năm 1923, dịch tả lợn vẫn tồn tại dai dẳng và tiềm ẩn nguy cơ bùng phát thành các ổ dịch diện rộng.

Mục tiêu trọng tâm của luận văn là nghiên cứu biểu hiện thành công protein E2 của vi rút dịch tả lợn cổ điển trên hệ thống Baculovirus sử dụng tế bào côn trùng. Công trình hướng tới việc tạo ra nguồn kháng nguyên tái tổ hợp sạch, chuẩn hóa sinh phẩm phục vụ công tác chẩn đoán phân tử và cung cấp nguồn nguyên liệu chất lượng cao cho việc sản xuất vắc xin thế hệ mới phòng bệnh dịch tả lợn tại Việt Nam.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào chủng vi rút dịch tả lợn thực địa VN91 (mã số đăng bạ ngân hàng gen quốc tế GenBank: LC374604), được triển khai thực hiện từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 9 năm 2019 tại Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y Quốc gia phối hợp cùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài thể hiện qua việc xây dựng quy trình công nghệ tái tổ hợp protein đạt hiệu suất cao, giúp chủ động nguồn kháng nguyên trong nước với độ đặc hiệu đạt trên 95%, mở ra tiềm năng lớn trong việc nâng cao tỷ lệ bảo hộ miễn dịch cho đàn gia súc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở khoa học của đề tài dựa trên đặc tính sinh học phân tử của vi rút dịch tả lợn thuộc họ Flaviviridae, chi Pestivirus. Bộ gen của vi rút là một phân tử RNA đơn dương có kích thước xấp xỉ 12,3 kb, chứa một khung đọc mở duy nhất mã hóa cho chuỗi polyprotein dài khoảng 3.900 axit amin. Chuỗi polyprotein này sau khi dịch mã được phân cắt bởi các enzyme protease để tạo thành 4 protein cấu trúc (Core, Erns, E1, E2) và 7 protein phi cấu trúc (Npro, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B).

Trong cấu trúc hạt vi rút, glycoprotein vỏ ngoài E2 là kháng nguyên quan trọng nhất, mang các epitop có tính sinh miễn dịch mạnh mẽ và kích thích vật chủ sản sinh kháng thể trung hòa đặc hiệu. Mô hình nghiên cứu ứng dụng hệ thống biểu hiện Bac-to-Bac Expression System kết hợp vector pFastBac. So với các hệ thống biểu hiện tế bào nhân sơ, hệ thống tế bào côn trùng mang lại ưu thế vượt trội nhờ khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa và gấp cuộn chuỗi polypeptide chuẩn xác, giúp protein tái tổ hợp giữ nguyên cấu trúc không gian và hoạt tính sinh học tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn mẫu nghiên cứu sử dụng chủng vi rút dịch tả lợn VN91 phân lập tại Việt Nam. Phương pháp chọn mẫu thực hiện thông qua việc nhân chủng và sàng lọc trên dòng tế bào biểu mô thận lợn PK15a với mật độ nuôi cấy 50.000 tế bào/ml trong môi trường DMEM bổ sung 5% huyết thanh thai bò ở điều kiện 37°C và 5% CO2. Độc lực vi rút được chuẩn hóa thông qua việc xác định giá trị liều gây nhiễm mô nuôi cấy 50% (TCID50) theo quy trình thường quy.

Phương pháp phân tích sinh học phân tử ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế qua phần mềm FastPCR và đối chiếu chuỗi trên hệ thống NCBI để khuếch đại gen mã hóa E2. Lý do lựa chọn hệ thống vector pFastBac/NT-TOPO và tế bào E. coli DH10Bac nhằm tận dụng cơ chế tái tổ hợp vị trí đặc hiệu qua sốc nhiệt 42°C trong 90 giây, cho phép chọn lọc thể mang Bacmid tái tổ hợp dựa trên hệ thống chỉ thị màu Bluo-gal (100 µg/ml), IPTG (40 µg/ml) và ba loại kháng sinh chọn lọc gồm kanamycin (50 µg/ml), gentamicin (7 µg/ml), tetracyclin (10 µg/ml).

Bacmid tinh sạch được chuyển nạp vào tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda SF21AE với cỡ mẫu mật độ tế bào đạt từ 1,5 đến 2,5 triệu tế bào/ml nhờ chất mang Cellfectin II, nuôi ủ ở nhiệt độ 27°C trong 72 giờ. Hoạt tính protein E2 được phân tích bằng phương pháp miễn dịch gắn enzyme trên lớp đơn tế bào (IPMA) trên tế bào High Five TN5 (mật độ 200.000 tế bào/ml) và kỹ thuật Western Blot sử dụng gel tách polyacrylamide 12% cùng gel cô 5% với kháng thể đặc hiệu cung cấp từ Viện Thú y Nhật Bản. Toàn bộ timeline thực nghiệm kéo dài liên tục 12 tháng đảm bảo tính chuẩn xác và độ lặp lại của dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã khuếch đại và tách dòng thành công gen mã hóa protein E2 từ chủng vi rút dịch tả lợn thực địa VN91. Kết quả giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger cho thấy độ tương đồng đạt 100% so với trình tự chuẩn đã công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank mã số LC374604, bảo đảm khung đọc mở chính xác hoàn toàn và không xuất hiện đột biến ngoài ý muốn.

Thứ hai, quá trình chuyển nạp gen vào hệ thống vi khuẩn E. coli DH10Bac tạo Bacmid tái tổ hợp đạt hiệu suất sàng lọc cao, với tỷ lệ khuẩn lạc trắng mang gen tái tổ hợp chiếm trên 85% tổng số khuẩn lạc trên đĩa thạch chọn lọc. Kiểm tra bằng phản ứng PCR trực tiếp trên 6 khuẩn lạc ngẫu nhiên đã khẳng định 100% các dòng này đều mang vector tái tổ hợp pFastBac_E2.

Thứ ba, sự biểu hiện protein E2 tái tổ hợp trong tế bào côn trùng SF21AE và TN5 sau 72 giờ nuôi cấy ở 27°C cho kết quả dương tính rõ rệt. Thử nghiệm IPMA trên đĩa 96 giếng cho thấy nguyên sinh chất tế bào bắt màu đỏ đậm đặc trưng từ cơ chất AEC, đạt độ nhạy nhận diện kháng thể ở độ pha loãng huyết thanh lên tới 1/400 và kháng thể cộng hợp ở tỷ lệ 1/1600.

Thứ tư, phương pháp Western Blot trên bản gel 12% đã phát hiện dải băng protein đặc thù tương ứng với kích thước phân tử của glycoprotein E2 tự nhiên. Dữ liệu khi được tổng hợp qua bảng so sánh hiệu giá kháng thể trung hòa (VNT) cho thấy sự kết hợp giữa kháng nguyên E2 tái tổ hợp và chất bổ trợ Interferon alpha đã nâng cao hiệu giá kháng thể bảo hộ lên gấp 4 đến 8 lần so với việc chỉ sử dụng đơn lẻ một thành phần kháng nguyên.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thực nghiệm khẳng định hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào côn trùng đã hoàn thành xuất sắc quá trình tổng hợp và biến đổi sinh học sau dịch mã, đặc biệt là quá trình glycosyl hóa bề mặt. Điều này giúp protein E2 tái tổ hợp giữ vững cấu trúc epitop tự nhiên, giải quyết triệt để nhược điểm tạo thể vùi bất hoạt thường gặp khi biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn truyền thống.

Bên cạnh đó, thể truyền Baculovirus chỉ có khả năng nhân lên trên tế bào côn trùng và hoàn toàn vô hại đối với động vật có vú, đảm bảo tính an toàn sinh học tuyệt đối khi ứng dụng trong thực tế. Sự gia tăng đáp ứng miễn dịch khi phối hợp cùng Interferon alpha phản ánh cơ chế kích thích miễn dịch bẩm sinh, thúc đẩy quá trình biệt hóa của tế bào lympho B và nâng cao hiệu quả trung hòa mầm bệnh. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng công nghệ DIVA, giúp phân biệt rõ ràng giữa lợn được tiêm vắc xin tiểu phần E2 và lợn nhiễm vi rút dịch tả lợn ngoài tự nhiên.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, mở rộng quy mô sản xuất protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống bioreactor công nghiệp nhằm tối ưu hóa năng suất sinh khối tế bào côn trùng, hướng tới mục tiêu đạt nồng độ biểu hiện trên 50 mg/lít dịch nuôi cấy trong giai đoạn 2024-2025 do các viện nghiên cứu chuyên ngành thú y chủ trì.

Thứ hai, nghiên cứu hoàn thiện công thức phối chế tá dược nhũ dầu kết hợp chất kích thích miễn dịch Interferon alpha theo tỷ lệ chuẩn hóa, đặt mục tiêu duy trì tỷ lệ bảo hộ kháng thể trung hòa đạt trên 95% ở đàn lợn thương phẩm sau 6 tháng tiêm phòng, thực hiện bởi các trung tâm kiểm nghiệm sinh phẩm trước năm 2026.

Thứ ba, triển khai thử nghiệm vắc xin tiểu phần E2 trên quy mô thực địa với cỡ mẫu tối thiểu 500 cá thể lợn tại các trang trại chăn nuôi tập trung, theo dõi các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực bảo hộ trong thời gian từ 12 đến 18 tháng dưới sự phối hợp giữa doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và cơ quan quản lý dịch tễ.

Thứ tư, ứng dụng kháng nguyên E2 tái tổ hợp để phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh dạng kit ELISA và IPMA phục vụ công tác giám sát dịch tễ tại các vùng chăn nuôi trọng điểm, rút ngắn thời gian xét nghiệm mẫu bệnh phẩm xuống dưới 4 giờ, do Cục Thú y và các chi cục vùng chỉ đạo triển khai.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm nghiên cứu viên và nhà khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học nông nghiệp, vi rút học thú y; tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết từ khâu thiết kế mồi, tách dòng đến biểu hiện gen trên tế bào côn trùng để ứng dụng cho các loại mầm bệnh nguy hiểm khác.

Nhóm kỹ sư R&D và chuyên gia sản xuất tại các doanh nghiệp dược phẩm thú y; luận văn mang lại cơ sở dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về điều kiện nuôi cấy 27°C và chuyển nạp Bacmid, phục vụ trực tiếp cho việc phát triển các dòng vắc xin tiểu phần thế hệ mới có tính cạnh tranh cao.

Nhóm cán bộ thú y vùng, chuyên viên dịch tễ và kiểm soát dịch bệnh động vật; tài liệu hỗ trợ nâng cao năng lực chẩn đoán huyết thanh học qua phương pháp IPMA và định hướng giải pháp phòng dịch theo nguyên lý DIVA phân biệt lợn tiêm phòng và lợn nhiễm bệnh.

Nhóm giảng viên, học viên cao học và sinh viên các trường đại học khối ngành Nông - Lâm - Ngư nghiệp; công trình là tài liệu học thuật giá trị phục vụ giảng dạy các học phần Sinh học phân tử, Miễn dịch học thú y và Bệnh truyền nhiễm gia súc.

Câu hỏi thường gặp

Hệ thống biểu hiện Baculovirus mang lại lợi thế gì so với hệ thống vi khuẩn trong sản xuất protein E2? Hệ thống Baculovirus trên tế bào côn trùng thực hiện được các quá trình biến đổi sau dịch mã phức tạp như glycosyl hóa và tạo cầu nối disunfua. Nhờ đó, protein E2 tái tổ hợp duy trì cấu trúc không gian 3D tự nhiên, mang lại hoạt tính sinh học và khả năng liên kết kháng thể vượt trội so với protein dạng thể vùi trong vi khuẩn.

Tại sao protein E2 được lựa chọn làm kháng nguyên mục tiêu cho vắc xin dịch tả lợn thế hệ mới? Glycoprotein E2 nằm ở vỏ ngoài của vi rút dịch tả lợn và là kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh nhất. Protein này kích thích cơ thể vật chủ sản sinh lượng lớn kháng thể trung hòa đặc hiệu, giúp ngăn chặn sự xâm nhập của vi rút vào tế bào và tạo khả năng bảo hộ lâm sàng đạt gần 100%.

Vắc xin tiểu phần protein E2 hỗ trợ chiến lược kiểm soát dịch bệnh DIVA như thế nào? Vắc xin tiểu phần E2 chỉ chứa một loại kháng nguyên cấu trúc duy nhất nên lợn tiêm phòng chỉ có kháng thể kháng E2. Khi lợn nhiễm vi rút thực địa, cơ thể sẽ xuất hiện thêm kháng thể chống lại các protein khác như Erns hay NS3, giúp các xét nghiệm chẩn đoán phân biệt chính xác cá thể được tiêm phòng và cá thể mang mầm bệnh tự nhiên.

Thời gian và nhiệt độ tối ưu để tế bào côn trùng biểu hiện protein tái tổ hợp là bao nhiêu? Quy trình thực nghiệm đã chuẩn hóa điều kiện nuôi cấy tế bào côn trùng SF21AE và TN5 ở nhiệt độ ổn định 27°C trong thời gian 72 giờ sau khi chuyển nạp Bacmid. Đây là thời điểm lượng protein E2 tích lũy đạt mức cao nhất trước khi tế bào bắt đầu bước vào giai đoạn thoái hóa bệnh lý.

Vai trò của việc kết hợp Interferon alpha trong đáp ứng miễn dịch của protein E2 là gì? Interferon alpha đóng vai trò là một cytokine điều hòa miễn dịch tự nhiên, có tác dụng kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và gia tăng sản xuất kháng thể thể dịch. Dữ liệu thử nghiệm chứng minh sự kết hợp này làm tăng hiệu giá kháng thể trung hòa trong phản ứng VNT lên từ 4 đến 8 lần so với việc sử dụng đơn lẻ kháng nguyên E2.

Kết luận

• Tách dòng và nhân bản thành công đoạn gen mã hóa protein E2 của chủng vi rút dịch tả lợn VN91 (GenBank: LC374604) vào vector biểu hiện pFastBac.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình chuyển nạp Bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng SF21AE và TN5, biểu hiện thành công glycoprotein E2 đạt hoạt tính sinh học tự nhiên.
• Đánh giá và xác nhận độ đặc hiệu cao của kháng nguyên E2 tái tổ hợp qua phản ứng IPMA và Western Blot với kháng thể chuẩn ở độ pha loãng 1/400.
• Chứng minh sự phối hợp giữa protein E2 và Interferon alpha giúp gia tăng hiệu giá kháng thể trung hòa của vật chủ lên từ 4 đến 8 lần.
• Cung cấp luận cứ khoa học vững chắc phục vụ việc sản xuất vắc xin tiểu phần DIVA và sinh phẩm chẩn đoán dịch tả lợn thế hệ mới tại Việt Nam.

Công trình đã khẳng định tính khả thi vượt trội của công nghệ Baculovirus trong lĩnh vực công nghệ sinh học thú y, mở ra hướng tiếp cận hiện đại và an toàn sinh học. Lộ trình tiếp theo cần tập trung hoàn thiện công nghệ ở quy mô bán công nghiệp trong thời gian 12 đến 24 tháng tới. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp sản xuất vắc xin cần đẩy mạnh hợp tác chuyển giao công nghệ để sớm đưa sản phẩm vắc xin tiểu phần E2 vào ứng dụng thực tiễn, góp phần bảo vệ bền vững ngành chăn nuôi lợn Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngày nay, với những mô hình chăn nuôi quy mô công nghiệp ngày càng phát triển thì kéo theo đó dịch bệnh ngày càng trở nên phức tạp. Trong đó, bệnh Dịch tả lợn (DTL) cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên đàn lợn bởi sự lây lan mạnh, tỷ lệ chết cao (85-100%) cho mọi lứa tuổi và gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế lớn nhất cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung. Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp châu Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó.

Dịch tả lợn là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân khác…Tác nhân gây bệnh là một vi rút thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Vi rút này có tính kháng nguyên chung với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và vi rút bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus). Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày càng khó kiểm soát. Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống.

Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam. Để phân tích chính xác vi rút gây bệnh DTL với những vi rút khác cùng chi Pestivirus như BVDV, BDV., kỹ thuật RT - PCR trở nên hữu ích với những đoạn gene như 5’NTR, E2, NS5B trong việc phân biệt chủng vi rút DTL và tổng kết sự phân biệt chủng vi rút DTL ở nhiều nước trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối liên giữa các chủng ở một số nước. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về vi rút DTL của các tác giả, tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những vi rút phân lập được từ các ổ dịch. Protein E2 là một 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trong những gen của bộ gen vi rút DTL cổ điển được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút.

Vì vậy việc thực hiện đề tài “ Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống Baculovirus ” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Dịch tả lợn sau này. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn cổ điển sử dụng tế bào côn trùng làm sinh phẩm dùng trong chẩn đoán và nguyên liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng bệnh Dịch tả lợn cổ điển tại Việt Nam. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Protein E2 của vi rút DTL cổ điển phân lập tại Việt Nam. - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2018 tới tháng 2/2019.