Nghiên cứu phát triển quy trình cryopreservation tối ưu cho spheroid tế bào gan

Chuyên khảo phân tích 1346470, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo., phục vụ nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

• Tác giả: Isobel Ruth Massie
• Trường học: University College London
• Chuyên ngành: Philosophy
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển quy trình cryopreservation tối ưu cho spheroid tế bào gan
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: London

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid

Quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học tái tạo. Spheroid tế bào gan, được tạo ra từ các tế bào HepG2, có khả năng mô phỏng chức năng gan tốt hơn so với các tế bào đơn lớp. Việc tối ưu hóa quy trình cryopreservation cho các spheroid này không chỉ giúp bảo tồn tế bào mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị bệnh gan hiệu quả hơn.

1.1. Tại sao cần nghiên cứu quy trình cryopreservation

Nghiên cứu quy trình cryopreservation là cần thiết để giải quyết vấn đề thiếu hụt tế bào gan trong điều trị bệnh. Việc bảo tồn tế bào gan spheroid giúp duy trì chức năng tế bào và tăng cường khả năng sống sót sau khi rã đông.

1.2. Lợi ích của spheroid tế bào gan trong nghiên cứu

Spheroid tế bào gan mang lại nhiều lợi ích trong nghiên cứu, bao gồm khả năng mô phỏng môi trường sinh lý tốt hơn và tăng cường khả năng tương tác giữa các tế bào. Điều này giúp cải thiện độ chính xác của các thí nghiệm và nghiên cứu lâm sàng.

II. Thách thức trong quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid

Mặc dù quy trình cryopreservation mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự hình thành băng trong tế bào, dẫn đến tổn thương tế bào và giảm khả năng sống sót. Ngoài ra, việc tối ưu hóa các điều kiện như nhiệt độ và thời gian cũng là một thách thức lớn.

2.1. Tổn thương do hình thành băng trong tế bào

Hình thành băng trong tế bào là một trong những nguyên nhân chính gây ra tổn thương tế bào trong quy trình cryopreservation. Điều này có thể dẫn đến sự chết tế bào và giảm khả năng phục hồi sau khi rã đông.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cryopreservation

Nhiều yếu tố như tốc độ làm lạnh, loại cryoprotectant và nồng độ của chúng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của quy trình cryopreservation. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để tối ưu hóa quy trình.

III. Phương pháp tối ưu hóa quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid

Để tối ưu hóa quy trình cryopreservation, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Việc sử dụng các cryoprotectant hiệu quả và điều chỉnh tốc độ làm lạnh là những yếu tố quan trọng trong việc cải thiện khả năng sống sót của tế bào sau khi rã đông.

3.1. Sử dụng cryoprotectant hiệu quả

Việc lựa chọn và sử dụng các cryoprotectant như DMSO và glycerol có thể giúp giảm thiểu tổn thương tế bào trong quy trình cryopreservation. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ và thời gian tiếp xúc với cryoprotectant có ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót của tế bào.

3.2. Điều chỉnh tốc độ làm lạnh

Tốc độ làm lạnh là một yếu tố quan trọng trong quy trình cryopreservation. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tốc độ làm lạnh chậm có thể giúp giảm thiểu tổn thương do hình thành băng, từ đó cải thiện khả năng phục hồi của tế bào.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid

Quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học, đặc biệt là trong việc phát triển các liệu pháp điều trị bệnh gan. Các spheroid tế bào gan có thể được sử dụng trong các nghiên cứu lâm sàng và thử nghiệm thuốc, giúp cải thiện hiệu quả điều trị.

4.1. Ứng dụng trong nghiên cứu lâm sàng

Spheroid tế bào gan có thể được sử dụng trong các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả của các liệu pháp điều trị mới. Việc sử dụng spheroid giúp mô phỏng chính xác hơn các phản ứng của tế bào gan trong cơ thể.

4.2. Tiềm năng trong phát triển liệu pháp điều trị

Quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid mở ra tiềm năng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho bệnh gan. Các spheroid này có thể được sử dụng để tạo ra các mô hình bệnh lý, từ đó giúp phát hiện và phát triển thuốc hiệu quả hơn.

V. Kết luận và tương lai của quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid

Quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid đã chứng minh được tiềm năng lớn trong nghiên cứu và điều trị bệnh gan. Tương lai của lĩnh vực này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong y học tái tạo và điều trị bệnh gan.

5.1. Tương lai của nghiên cứu cryopreservation

Nghiên cứu về quy trình cryopreservation sẽ tiếp tục phát triển, với mục tiêu cải thiện khả năng sống sót của tế bào và tối ưu hóa các điều kiện bảo quản. Điều này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong y học.

5.2. Tác động đến điều trị bệnh gan

Quy trình cryopreservation tế bào gan spheroid có thể tạo ra những bước đột phá trong điều trị bệnh gan, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân và giảm thiểu tình trạng thiếu hụt tế bào gan trong điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Development of an Optimised Cryopreservation Protocol for Encapsulated Liver Cell Spheroids: towards delivery of a Bioartificial Liver A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) Isobel Ruth Massie 2011 UCL Centre for Hepatology Royal Free Campus Department of Medicine University College London 1 Declaration I, Isobel Ruth Massie confirm that the work presented in this thesis is my own. Where information has been derived from other sources, I confirm that this has been indicated in the thesis. 2 Abstract Acute liver failure (ALF) has a rapid and unpredictable onset with high mortality. The only current treatment is to transplant a donor organ but donor organ shortages exist.

A bioartificial liver (BAL) could bridge the gap to transplant or buy time for spontaneous recovery. This BAL comprises HepG2 cells encapsulated within alginate that have formed tissue-like spheroids (ELS), which display upregulated function compared to monolayer cultures approximately 9 days after encapsulation. In order to treat ALF in a timely fashion, this thesis aimed to provide an off-the-shelf treatment via development of a cryopreservation protocol for ELS. A baseline recovery for ELS post-cryopreservation was established with particular attention paid to the clinically relevant time-course of recovery.

Intracellular ice formation was identified as an injury mechanism causing large amounts of cell death. A strategy was devised to limit this and improved recovery was demonstrated. Other, more subtle, injury mechanisms were subsequently identified and steps taken to ameliorate their effects resulting in decreased apoptosis and improved ELS recovery. As ELS will be used to treat human patients as the cellular component of a BAL, a number of regulations must be complied with.

The optimised cryopreservation protocol was modified to ensure mandates were met without a loss in ELS cell recovery. Using this knowledge, cryopreservation was then scaled-up near to volumes that would be required to treat an adult patient. Finally, these techniques were applied to cryopreservation of single cell suspensions of primary human hepatocytes. By doing so, it was determined whether or not a different cell type in a different culture format suffered injury via the same mechanisms as ELS and whether or not these could be ameliorated using the same methods.

In conclusion, an optimised cryopreservation protocol has been developed for ELS which may be used within a BAL. 3 List of Contents TITLE PAGE __________________________________________________________________________1 DECLARATION _______________________________________________________________________2 ABSTRACT ___________________________________________________________________________3 LIST OF FIGURES _____________________________________________________________________15 LIST OF TABLES ______________________________________________________________________19 ABBREVIATIONS _____________________________________________________________________20 ACKNOWLEDGMENTS ________________________________________________________________23 CHAPTER 1: INTRODUCTION ___________________________________________________________24 1. INTRODUCTION TO THE LIVER _______________________________________________24 1. Structure of the liver_ ___________________________________________24 1.

Cells of the liver ________________________________________________25 1. Functions of the liver____________________________________________26 1. Acute liver failure _________________________________________________________27 1. Artificial liver devices ____________________________________29 1.

Molecular adsorbent recirculating system _________29 1. Bioartificial liver devices (BALS) ____________________________30 1. Extra-corporeal liver assist device _______________30 1. The Liver Group BAL _______________________________________________________31 1.

Fluidised bed bioreactor culture ___________________________________32 1. Liver Group bioartificial liver principle ______________________________32 1. Biopreservation for BAL as long- or short-term strategies _________________________32 1. Short-term preservation _________________________________________33 4 1.

Tissue-engineering construct preservation ___________________34 1. Storage at intermediate temperature with oxygenated support (perfluorodecalins) ______________________________________34 1. Long-term cryopreservation ______________________________________34 1. Cooling rates during cryopreservation ______________________________35 1.

Cell death at slow-cooling rates – solute toxicity _______________36 1. Cell death at rapid cooling rates ____________________________37 1. Methods to avoid supercooling _________________38 1. Thawing/warming protocols ______________________________________41 1.

Warming of slowly cooled cells ____________________________41 1. Warming of rapidly cooled cells ____________________________41 1. Addition and removal of cryoprotectants ____________________42 1. Non-penetrating CPAs ___________________________________43 1.

Cryopreservation of hepatocytes __________________________________43 1. Cryopreservation of alginate-encapsulated cells ______________________44 1. Cryopreservation of interconnecting cells ___________________________44 1. Intracellular ice formation ________________________________45 1.

Intercellular ice formation ________________________________45 1. Assessment of success following cryopreservation ____________________46 1. Aim and hypothesis ________________________________________________________48 CHAPTER 2: GENERAL METHODS _______________________________________________________50 2. HepG2 cell line culture _____________________________________________________50 2.

Culture medium preparation _____________________________________50 2. HepG2 culture medium (complete culture medium) ___________50 2. Culture medium for HepG2 cells encapsulated in alginate using the Inotech syringe pump system (high glucose medium) ___________50 2. Culture medium for HepG2 cells encapsulated in alginate using the JetCutter system (FFP medium) ____________________________51 2.

Preparation of fresh frozen plasma ______________51 2. Preparation of FFP media ______________________51 5 2. Culture of HepG2 cell line as monolayer cultures of adherent cells _______51 2. Determination of cell number and viability ___________________52 2.

Cryopreservation and revival of HepG2 cell line _______________52 2. Cryopreservation for maintaining HepG2 cell stocks for monolayer cultures ___________________________53 2. Alginate encapsulation and 3D culture ________________________________________53 2. Encapsulation of HepG2 cells using the Inotech syringe pump system _____53 2.

Preparation of 2% alginate solution _________________________55 2. Preparation of polymerization buffer _______________________55 2. Preparation of alginate cell suspension ______________________55 2. Cell encapsulation and bead collection ______________________55 2.

Static culture of Inotech encapsulated HepG2 cells ____________56 2. JetCutter cell encapsulation ______________________________________56 2. Cell encapsulation and bead collection ______________________58 2. Culture of JetCutter encapsulated cells ______________________58 2.

Fluidised bed bioreactor _______________________58 2. Preparation for bioreactor setup _________59 2. Rotating cell culture system ____________________60 2. Evaluation of cell numbers from 3D cultures ____________________________________61 2.

Removing cells from alginate _____________________________________61 2. Methods for beads maintained in 6-well plates _______________61 2. Methods for beads maintained in FBB or RCCS ________________61 2. Quantification of cell number using the Nucleocounter system __________62 2.

Calculation of viable cell number _____________________________________________63 2. Evaluation of cell viability and basal metabolic activities __________________________63 2. Qualitative assessment in beads – fluorescein diacetate/propidium iodide staining ______________________________________________________63 2. Quantitative assessment in beads – image analysis ____________________64 2.

Quantitative assessment – tetrazolium salt reduction assay _____________65 2. Quantification of total protein content using bicinchoninic acid protein assay _________66 2. Quantification of hepato-specific proteins synthesized and secreted in culture ________66 2. Quantification of broad-spectrum cytochrome P450 activity _______________________68 2.

Induction using indirubin ________________________________________69 2. Cryopreservation of alginate-encapsulated liver cell spheroids _____________________70 2. Use of controlled rate freezers ____________________________________70 6 2. Filling the CRF nitrogen dewar _____________________________70 2.

Entering and running a programme _________________________70 2. Cryopreservation and thawing of ELS _______________________________71 2. Addition of CPA _________________________________________71 2. Starting cryopreservation protocol _________________________72 2.

Storage of cryopreserved samples _________________________72 2. Thawing of ELS following cryopreservation ___________________73 2. Temperature measurements during cryopreservation _________________73 2. Differential scanning calorimetry _________________________________________74 2.

Evaluation of oxidative stress ____________________________________________76 2. Reactive oxygen species assay ____________________________________76 2. Method for 3D cultures __________________________________76 2. Method for monolayer culture _____________________________77 2.

Oxidative damage assay _________________________________________77 2. Statistical analysis _____________________________________________________78 CHAPTER 3: COOLING RATES, SUPERCOOLING AND NUCLEATION _____________________________79 3. Time over which ELS recovery should be assessed in post-thaw cultures ___79 3. Cooling rates, supercooling and warming rates _______________________79 3.

Determination of optimal cooling rates _____________________________81 3. Determination of supercooling ____________________________________81 3. Determination of equilibrium melting point by mDSC __________________83 3. Silver iodide bead formation ______________________________________84 3.

Assessing recovery in post-thaw cultures ____________________________86 3. Recovery in the first 6 hours following cryopreservation _______________88 3. Qualitative assessment of viability __________________________88 3. Quantitative assessment of viability ________________________89 7 3.

Recovery between 24 and 72 hours following cryopreservation __________90 3. Qualitative assessment of viability __________________________90 3. Quantitative assessment of viability ________________________90 3. Supercooling without nucleators ___________________________92 3.

Effect of nucleators ______________________________________92 3. Silver iodide bead formation and effect on supercooling ___________________________________________92 3. Effect of cholesterol on supercooling _____________93 3. Effect of minimizing supercooling using cholesterol on ice formation intra- and extracellularly ______________________________________________95 3.

Ice formation in the absence of DMSO ______________________95 3. Ice formation in presence of DMSO _________________________96 3. Ice formation in presence of DMSO and cholesterol ____________97 3. Effect of minimizing supercooling using cholesterol on ELS recovery in post- thaw cultures __________________________________________________97 3.

Effect of cholesterol on viability in post-thaw cultures __________98 3. Effect of cholesterol on viable cell numbers in post-thaw cultures _98 3. Effect of cholesterol on function in post-thaw cultures _________99 3. Hepato-specific protein synthetic function _______ 101 3.

Effect of warming rate on ELS recovery in post-thaw cultures ___ 107 3. Viable cell numbers __________________________107 3. Conclusions _____________________________________________________________121 CHAPTER 4: CRYOPRESERVATION STRESSES _____________________________________________122 4. Approaches to limit onset of apoptosis as a result of cryopreservation ____________________________123 4.

Cryopreservation of ELS ________________________________________126 4. Dose response to antioxidants ____________________________126 4. Inclusion of antioxidants during and after cryopreservation _____126 4. Inclusion of 1K1 during and after cryopreservation ____________126 4.

Assessing necrosis in post-thaw cultures ___________________________128 4. Assessing apoptosis in post-thaw cultures _________________________129 4. Assessment of oxidative injury ___________________________________131 4. Lipid peroxidation assay _________________________________131 4.

Reactive oxygen species assay ____________________________131 4. Measuring effect of 1K1 on ELS cell growth _________________________132 4. Cryopreservation of ELS with optimised CPA media __________________132 4. Assessment of ELS recovery in post-thaw cultures ___________________132 4.

Viable cell numbers ____________________________________132 4. Hepato-specific protein synthesis and secretion ______________132 4. Time course of necrosis in post-warming culture ____________________133 4. Time course of apoptosis in post-warming culture ___________________133 4.

Effect of catalase during cryopreservation __________________________135 4. Viable cell number _____________________________________135 4. Effect of Trolox during cryopreservation ___________________________136 4. Viable cell number _____________________________________137 4.

Does hypothermia cause oxidative stress? _________________________138 4. Storage at 4°C for 20 hours ______________________________138 4. Reactive oxygen species production ____________138 4. Storage at -4°C for 2 hours _______________________________139 4.

Reactive oxygen species production _____________139 4. Does cryopreservation cause oxidative stress? ______________________141 4. Reactive oxygen species production _______________________141 4. Can 1K1 protect against staurosporine-triggered apoptosis? ___________142 4.

Can 1K1 protect against apoptosis caused by cryopreservation? ________144 9 4. Effect of 1K1 when included during cryopreservation __________144 4. Effect of 1K1 when included during cryopreservation and in post- warming cultures ______________________________________144 4. Does 1K1 improve ELS recovery following cryopreservation? ___________146 4.

Does 1K1 affect cell growth rates? ________________________________146 4. Recovery of ELS cryopreserved using optimal CPA media ______________147 4. Conclusions _____________________________________________________________156 CHAPTER 5: SCALE UP _______________________________________________________________157 5. Encapsulated liver cell spheroid cell density ________________________157 5.

Cryopreservation of ELS at different cell densities ____________________160 5. Cryopreservation of cell-dense ELS at slower cooling rates _____________161 5. Cryopreservation of ELS with different volumes of cryoprotectant medium ____________________________________________________________161 5. Cryopreservation in cryobags ____________________________________162 5.

Measuring temperature profiles in cryobags during cooling and warming _____________________________________________162 5. Comparison between cryopreservation in cryobags and cryovials _____________________________________________________163 5. Cryopreservation in culture chamber ______________________________163 5. Cooling of culture chamber ______________________________164 5.

Warming of culture chamber _____________________________164 5. Standard warming of culture chamber ___________164 5. Improved warming of culture chamber __________165 5. Measuring temperature profiles in culture chamber during cooling and warming _________________________________________166 5.

Effect of ELS cell density on recovery following warming ______________167 5. Effect of slower cooling rates for cell-dense ELS _____________________169 5. Viable cell number _____________________________________169 5. Effect of different ELS:CPA ratio on ELS recovery following warming _____170 5.

Viable cell number _____________________________________170 5. Cryopreservation in cryobags ____________________________________172 10 5. Viable cell number __________________________173 5. Cryopreservation in culture chamber ______________________________175 5.

ELS recovery following cryopreservation in culture chamber using standard thawing methodology ___________________________177 5. ELS recovery following cryopreservation in culture chamber using optimised thawing methodology __________________________178 5. Conclusions _____________________________________________________________189 CHAPTER 6: REGULATORY CONSIDERATIONS ____________________________________________190 6. Use of fresh frozen plasma in place of foetal calf serum during cryopreservation ______________________________________________190 6.

Use of DMSO during cryopreservation _____________________________191 6. Use of GMP-compliant preservation media during cryopreservation _____192 6. Use of liquid nitrogen during cryopreservation ______________________193 6. Avoiding the use of nitrogen during cooling _________________193 6.

Avoiding the use nitrogen during long-term storage at low temperatures _________________________________________194 6. Effect of FFP on ELS recovery ____________________________________197 6. Reducing DMSO concentration during cryopreservation _______________197 6. Use of GMP-compliant CPA media ________________________________197 6.

Avoiding the use liquid nitrogen during cooling _____________________198 6. Can the EF600 perform a multi-step cooling profile? __________198 6. Can the EF600 apply a multi-step cooling profile to cryovials? ___198 6. Does cholesterol function as a heterogeneous nucleator in the EF600? _______________________________________________199 6.

How does the EF600 compare to a cryogen cooler? ___________199 6. Can ELS be stored without nitrogen for extended time periods? ________199 11 6. Differential scanning calorimetry __________________________200 6. Effect of fresh frozen plasma on cell viability, number and function in post- warming cultures _____________________________________________201 6.

Effect of reducing DMSO concentration during cryopreservation ________202 6. Use of different GMP-compliant cryopreservation media ______________205 6. Use of EF600 during cooling _____________________________________206 6. Can the EF600 perform a multi-step cooling profile? __________206 6.

Can the EF600 apply cooling to cryovials? ___________________206 6.