Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Sởi là một bệnh truyền nhiễm do virus Sởi gây ra, thuộc họ Paramyxoviridae, có khả năng lây lan rất nhanh qua tiếp xúc gần hoặc dịch tiết đường hô hấp. Trước khi có vắc xin, mỗi năm trên thế giới có khoảng 2,6 triệu ca tử vong do Sởi. Từ năm 2000 đến 2017, vắc xin đã giúp giảm 80% số ca tử vong, tương đương ngăn ngừa khoảng 21,1 triệu ca tử vong. Tuy nhiên, từ năm 2008 đến nay, dịch Sởi có xu hướng tăng trở lại tại nhiều khu vực như châu Phi, châu Âu, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Tại Việt Nam, năm 2019 ghi nhận hơn 40.000 ca mắc với 4 ca tử vong, trong khi năm 2020 giảm còn 3.365 ca. Tỷ lệ mắc cao tập trung ở các vùng núi, vùng sâu, vùng xa và khu công nghiệp với đa số bệnh nhân chưa được tiêm chủng đầy đủ.

Hiện nay, các phương pháp phát hiện virus Sởi như PCR, realtime-PCR và ELISA tuy chính xác nhưng đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí lớn và thời gian lâu. Các test nhanh kháng thể IgM, IgG cũng còn nhiều hạn chế về độ nhạy và đặc hiệu. Do đó, việc phát triển que thử phát hiện nhanh, nhạy, trực tiếp kháng nguyên virus Sởi là rất cần thiết để hỗ trợ chẩn đoán sớm, giúp điều trị kịp thời và hạn chế biến chứng. Luận văn này tập trung nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus Sởi dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch, với mục tiêu tạo ra sản phẩm có độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện 2.5×10^6 PFU/ml, phù hợp với điều kiện sản xuất và sử dụng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Virus học và miễn dịch học: Virus Sởi là virus ARN đơn chuỗi, có cấu trúc gồm các protein nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), protein nền (M), glycoprotein hemagglutinin (H) và fusion (F). Kháng thể IgG đặc hiệu chống lại protein H giúp bảo vệ miễn dịch suốt đời.
  • Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (Immunochromatography): Phương pháp dòng chảy một chiều sử dụng kháng thể gắn hạt nano vàng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu dịch hô hấp.
  • Công nghệ hạt nano vàng (Durian-like Gold Nanoparticles - DGNs): Hạt nano vàng kích thước 40-60 nm được sử dụng làm chất đánh dấu, có khả năng gắn kết bền với kháng thể mà không làm ảnh hưởng đến chức năng nhận biết.
  • Phương pháp tinh sạch kháng thể bằng Protein A: Sử dụng sắc ký ái lực để thu nhận kháng thể IgG đặc hiệu từ huyết thanh thỏ.
  • Phương pháp ELISA và SDS-PAGE: Đánh giá hiệu giá kháng thể và độ tinh sạch protein.

Các khái niệm chính bao gồm: kháng nguyên virus Sởi, kháng thể đa dòng IgG, hạt nano vàng DGNs, màng nitrocellulose, miếng cộng hợp và miếng thấm mẫu.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Huyết thanh thỏ kháng virus Sởi được sản xuất tại Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC). Hạt nano vàng được điều chế tại Phòng thí nghiệm Proteomic, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
  • Phương pháp chọn mẫu: Thỏ đực khỏe mạnh được tiêm miễn dịch 5 lần cách nhau 14 ngày với kháng nguyên virus Sởi phối hợp tá dược Freund để tạo huyết thanh kháng thể đa dòng.
  • Phương pháp phân tích:
    • Tinh sạch kháng thể IgG bằng sắc ký ái lực Protein A trên hệ thống AKTA FPLC.
    • Đánh giá hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.
    • Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE và nhuộm Coomassie Brilliant Blue.
    • Tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng DGNs bằng phương pháp hấp phụ vật lý.
    • Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose bằng máy phun CAMAG.
    • Lắp ráp que thử với các thành phần: miếng thấm mẫu, miếng cộng hợp, màng nitrocellulose.
    • Đánh giá đặc tính que thử: độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện, độ lặp lại.
  • Timeline nghiên cứu: Quá trình tiêm miễn dịch và lấy mẫu kéo dài khoảng 70 ngày, các bước tinh sạch, tạo cộng hợp, cố định và đánh giá que thử thực hiện trong vòng 3 tháng tiếp theo.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Sản xuất huyết thanh kháng virus Sởi: Sau 4 lần tiêm miễn dịch, lượng IgG trong huyết thanh thỏ tăng rõ rệt, đạt hiệu giá cao theo phương pháp ELISA, chứng tỏ kháng nguyên đã kích thích đáp ứng miễn dịch hiệu quả.

  2. Tinh sạch kháng thể IgG: Sử dụng sắc ký Protein A, thu được kháng thể tinh sạch với nồng độ 15,51 mg/ml. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chỉ có hai băng protein đặc trưng cho chuỗi nặng (50 kDa) và chuỗi nhẹ (25 kDa) của IgG, loại bỏ hoàn toàn các protein không mong muốn như albumin (66 kDa).

  3. Điều kiện tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng: Xác định tỷ lệ kháng thể 0,1 µg trên 100 µl DGNs OD1.2, phản ứng ở 25°C trong 30 phút là tối ưu. BSA được sử dụng để lấp đầy vị trí trống trên bề mặt hạt nano vàng, ngăn ngừa liên kết không đặc hiệu.

  4. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose: Lượng kháng thể phun lên vạch T là 2,0 µg, sấy ở 37°C trong 60 phút cho kết quả cố định tốt, đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử.

  5. Đặc tính que thử:

    • Ngưỡng phát hiện virus Sởi đạt 2.5×10^6 PFU/ml.
    • Độ nhạy đạt 90%, độ đặc hiệu 100%.
    • Độ lặp lại 100% với 10 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính.
    • Kết quả cho thấy que thử có khả năng phát hiện nhanh và chính xác virus Sởi trong mẫu dịch hầu họng.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng kháng thể đa dòng IgG tinh sạch kết hợp với hạt nano vàng DGNs tạo ra que thử phát hiện nhanh virus Sởi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Điều kiện tạo cộng hợp và cố định kháng thể được tối ưu giúp tăng cường tín hiệu màu sắc, dễ dàng quan sát bằng mắt thường. So với các phương pháp PCR hay ELISA truyền thống, que thử này có ưu điểm về thời gian cho kết quả nhanh (10-20 phút), chi phí thấp và thao tác đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm cơ bản hoặc sử dụng tại điểm chăm sóc sức khỏe.

Các kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ động học sản sinh kháng thể IgG, phổ điện di SDS-PAGE thể hiện độ tinh sạch kháng thể, biểu đồ so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử với các phương pháp chuẩn. Bảng tổng hợp điều kiện tạo cộng hợp và cố định kháng thể cũng giúp minh họa quá trình tối ưu hóa.

Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ứng dụng hạt nano vàng trong xét nghiệm miễn dịch nhanh, đồng thời mở ra hướng phát triển kit test nhanh virus Sởi sản xuất trong nước, góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai sản xuất thử nghiệm que thử phát hiện nhanh virus Sởi trong quy mô công nghiệp nhằm đáp ứng nhu cầu chẩn đoán sớm tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở trong vòng 12 tháng tới.

  2. Đào tạo nhân viên y tế và kỹ thuật viên sử dụng que thử nhanh, đảm bảo thao tác chuẩn xác, nâng cao hiệu quả chẩn đoán và giảm thiểu sai sót, thực hiện trong 6 tháng đầu sau khi sản phẩm được cấp phép.

  3. Mở rộng nghiên cứu cải tiến que thử để phát hiện đồng thời nhiều loại virus gây sốt phát ban, tăng tính ứng dụng và hiệu quả kinh tế, tiến hành trong 2 năm tiếp theo.

  4. Hợp tác với các cơ quan quản lý và tổ chức y tế để xây dựng hướng dẫn sử dụng và quy trình kiểm soát chất lượng que thử, đảm bảo an toàn và hiệu quả khi đưa vào sử dụng đại trà.

  5. Thực hiện các nghiên cứu đánh giá lâm sàng mở rộng tại nhiều địa phương khác nhau nhằm xác nhận độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ổn định của que thử trong điều kiện thực tế, hoàn thành trong vòng 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh và Y học: Nắm bắt quy trình phát triển que thử miễn dịch nhanh, kỹ thuật tinh sạch kháng thể và ứng dụng hạt nano vàng trong chẩn đoán.

  2. Cơ sở sản xuất kit xét nghiệm và thiết bị y tế: Áp dụng công nghệ sản xuất que thử phát hiện nhanh virus Sởi, phát triển sản phẩm phù hợp với thị trường trong nước và quốc tế.

  3. Bệnh viện, phòng xét nghiệm và trung tâm y tế dự phòng: Sử dụng que thử nhanh để chẩn đoán sớm bệnh Sởi, nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh tại cộng đồng.

  4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách: Tham khảo để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực chẩn đoán, đồng thời thúc đẩy sản xuất trong nước, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Que thử phát hiện nhanh virus Sởi hoạt động dựa trên nguyên lý nào?
    Que thử sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch dòng chảy một chiều, trong đó kháng thể đặc hiệu gắn trên hạt nano vàng sẽ kết hợp với kháng nguyên virus Sởi trong mẫu, tạo phức hợp được giữ lại trên màng nitrocellulose tại vạch kiểm tra, tạo vạch màu dễ quan sát.

  2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử là bao nhiêu?
    Que thử đạt độ nhạy 90% và độ đặc hiệu 100%, nghĩa là có khả năng phát hiện chính xác 90% mẫu dương tính và không cho kết quả dương tính giả trên mẫu âm tính.

  3. Ngưỡng phát hiện virus của que thử là gì?
    Ngưỡng phát hiện là 2.5×10^6 PFU/ml, đủ để phát hiện virus trong các mẫu dịch hầu họng có tải lượng virus cao trong giai đoạn đầu nhiễm.

  4. Thời gian cho kết quả của que thử là bao lâu?
    Kết quả được đọc trong khoảng 10-20 phút sau khi nhỏ mẫu lên que thử, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp PCR hoặc ELISA truyền thống.

  5. Que thử có thể sử dụng ở đâu và cho đối tượng nào?
    Que thử phù hợp sử dụng tại các phòng khám, trung tâm y tế tuyến cơ sở, bệnh viện và các điểm chăm sóc sức khỏe cộng đồng để phát hiện sớm virus Sởi ở trẻ em và người lớn nghi ngờ mắc bệnh.

Kết luận

  • Đã sản xuất thành công kháng thể đa dòng IgG đặc hiệu kháng virus Sởi với nồng độ 15,51 mg/ml và độ tinh sạch cao.
  • Xác định được điều kiện tối ưu tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng DGNs và cố định kháng thể lên màng nitrocellulose.
  • Phát triển que thử phát hiện nhanh virus Sởi với độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện 2.5×10^6 PFU/ml và độ lặp lại 100%.
  • Que thử cho kết quả nhanh trong 10-20 phút, dễ sử dụng, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm cơ bản và điểm chăm sóc sức khỏe.
  • Đề xuất triển khai sản xuất thử nghiệm, đào tạo sử dụng và mở rộng nghiên cứu cải tiến để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh Sởi tại Việt Nam.

Luận văn mở ra hướng phát triển sản phẩm kit test nhanh virus Sởi sản xuất trong nước, góp phần nâng cao năng lực y tế dự phòng và giảm thiểu tác động của dịch bệnh. Các nhà nghiên cứu, cơ sở sản xuất và cơ quan quản lý được khuyến khích tiếp tục phát triển và ứng dụng kết quả này trong thực tiễn.