Nghiên Cứu Phát Triển Que Thử Phát Hiện Nhanh Virus Sởi

Tài liệu nghiên cứu Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus sởi, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Tác giả: Vũ Văn Huy
• Người hướng dẫn: PGS. Trương Quốc Phong
• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus Sởi
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình nhiễm vi rút Sởi trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. Tình hình nhiễm vi rút Sởi trên thế giới
• 1.3. Tình hình nhiễm vi rút Sởi tại Việt Nam
• 1.4. Đặc điểm của vi rút Sởi
• 1.4.1. Hình thái và cấu trúc
• 1.4.2. Sự nhân lên của vi rút Sởi
• 1.4.3. Nguồn truyền nhiễm
• 1.4.4. Cách thức lây truyền bệnh Sởi
• 1.4.5. Những biến chứng của bệnh Sởi
• 1.5. Các phương pháp chuẩn đoán vi rút Sởi
• 1.6. Thiết kế que thử nhanh dựa trên phương pháp sắc kĩ miễn dịch
• 1.7. Đặc tính một số thành phần que thử
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng thể
• 2.2. Hóa chất và kháng thể
• 2.3. Các vật liệu chế tạo que thử và kiểm tra
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp sản xuất kháng thể
• 2.4.2. Phương pháp tinh sạch kháng thể kháng Sởi bằng protein A
• 2.4.3. Phương pháp ELISA
• 2.4.4. Phương pháp điện di SDS – PAGE
• 2.4.5. Phương pháp Bradford
• 2.4.6. Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng
• 2.4.7. Phương pháp cố định kháng thể trên màng nitrocellulose
• 2.4.8. Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp
• 2.4.9. Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử
• 2.4.10. Phương pháp đánh giá đặc tính của que thử
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu sản xuất huyết thanh thỏ kháng vi rút Sởi
• 3.2. Tinh sạch kháng thể kháng vi rút Sởi
• 3.3. Nghiên cứu chế tạo que thử
• 3.3.1. Thiết lập điều kiện thiết kế que thử
• 3.3.2. Nghiên cứu tạo điều kiện cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng
• 3.3.3. Nghiên cứu điều kiện hấp phụ cộng hợp kháng thể-hạt nano vàng lên miếng cộng hợp
• 3.3.4. Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể kháng vi rút Sởi lên màng nitrocellulose
• 3.3.5. Nghiên cứu đặc tính que thử
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Phát Triển Que Thử Sởi Nhanh

Bệnh sởi do virus sởi gây ra, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính với tốc độ lây lan rất nhanh. Việc chẩn đoán sớm và chính xác bệnh sởi đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và điều trị hiệu quả. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như PCR và ELISA đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có trình độ cao và thời gian chờ đợi kết quả lâu. Do đó, việc phát triển một phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản, chi phí thấp và có thể thực hiện tại chỗ là vô cùng cần thiết. Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus sởi là một hướng đi đầy tiềm năng, hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho công tác phòng chống dịch bệnh. Que thử nhanh giúp phát hiện sớm kháng nguyên sởi, từ đó giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị kịp thời, giảm thiểu biến chứng và ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh trong cộng đồng. Hiện nay, tại Việt Nam chưa có nhiều công ty sản xuất kit test nhanh sởi, do đó việc nghiên cứu và phát triển sản phẩm này có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế và xã hội.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Chẩn Đoán Sớm Bệnh Sởi

Chẩn đoán sớm bệnh sởi giúp bệnh nhân được điều trị kịp thời, giảm nguy cơ biến chứng như viêm phổi, viêm não, tiêu chảy và thậm chí tử vong. Việc phát hiện sớm cũng giúp ngăn chặn sự lây lan của virus sởi trong cộng đồng, đặc biệt là ở những khu vực có tỷ lệ tiêm chủng thấp. Theo nghiên cứu, việc chẩn đoán và cách ly bệnh nhân sởi trong vòng 4 ngày kể từ khi phát ban có thể giảm đáng kể số ca mắc mới. Xét nghiệm sởi nhanh đóng vai trò then chốt trong việc đạt được mục tiêu này.

1.2. Ưu Điểm Của Que Thử Nhanh Phát Hiện Virus Sởi

Que thử phát hiện nhanh virus sởi có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Thứ nhất, thời gian cho kết quả nhanh chóng, thường chỉ từ 15-30 phút. Thứ hai, thao tác đơn giản, không đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ cao. Thứ ba, chi phí thấp hơn so với PCR và ELISA. Thứ tư, có thể thực hiện tại chỗ, ở các vùng sâu vùng xa, nơi không có điều kiện trang thiết bị hiện đại. Những ưu điểm này giúp que thử sởi trở thành một công cụ hữu ích trong công tác phòng chống dịch bệnh.

II. Thách Thức Trong Phát Triển Que Thử Phát Hiện Sởi Hiệu Quả

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc phát triển que thử phát hiện nhanh virus sởi hiệu quả cũng đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là đảm bảo độ nhạy que thử sởi và độ đặc hiệu que thử sởi cao. Virus sởi có nhiều chủng khác nhau, do đó que thử cần có khả năng phát hiện được tất cả các chủng phổ biến. Ngoài ra, que thử cần phân biệt được virus sởi với các loại virus khác có triệu chứng tương tự, như rubella và sốt xuất huyết. Một thách thức khác là đảm bảo tính ổn định và bảo quản que thử sởi trong điều kiện môi trường khác nhau, đặc biệt là ở những vùng có khí hậu nóng ẩm. Cuối cùng, cần đảm bảo giá thành que thử sởi hợp lý để có thể tiếp cận được với nhiều người dân.

2.1. Yêu Cầu Về Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Que Thử Sởi

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng nhất để đánh giá chất lượng của que thử sởi. Độ nhạy thể hiện khả năng của que thử trong việc phát hiện virus sởi khi có mặt với nồng độ thấp. Độ đặc hiệu thể hiện khả năng của que thử trong việc phân biệt virus sởi với các loại virus khác. Một que thử lý tưởng cần có cả độ nhạy và độ đặc hiệu cao để đảm bảo kết quả chính xác.

2.2. Ổn Định Và Bảo Quản Que Thử Trong Điều Kiện Khác Nhau

Tính ổn định và khả năng bảo quản que thử sởi là một yếu tố quan trọng, đặc biệt là ở những vùng có điều kiện khí hậu khắc nghiệt. Que thử cần có khả năng chịu được nhiệt độ và độ ẩm cao mà không bị ảnh hưởng đến hiệu quả phát hiện. Việc nghiên cứu các phương pháp bảo quản que thử sởi phù hợp, như sử dụng chất hút ẩm hoặc bao bì đặc biệt, là rất cần thiết.

2.3. Vấn Đề Giá Thành Và Khả Năng Tiếp Cận Que Thử Sởi

Giá thành que thử sởi là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng tiếp cận của người dân. Que thử cần có giá thành hợp lý để có thể được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Việc nghiên cứu các phương pháp sản xuất que thử sởi với chi phí thấp, như sử dụng vật liệu thay thế hoặc quy trình sản xuất đơn giản hơn, là rất quan trọng.

III. Phương Pháp Phát Triển Que Thử Phát Hiện Nhanh Virus Sởi

Việc phát triển que thử phát hiện nhanh virus sởi thường dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch. Nguyên lý này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể sởi và antigen sởi. Mẫu bệnh phẩm được nhỏ lên que thử, nếu có virus sởi, antigen sởi sẽ kết hợp với kháng thể sởi gắn trên hạt nano vàng. Phức hợp này di chuyển dọc theo que thử và bị bắt giữ bởi kháng thể sởi cố định trên vạch thử (T), tạo thành vạch màu. Vạch chứng (C) xuất hiện để đảm bảo que thử hoạt động bình thường. Các bước chính trong quá trình phát triển que thử sởi bao gồm: sản xuất kháng thể sởi, tạo phức hợp kháng thể - hạt nano vàng, cố định kháng thể lên màng nitrocellulose và đánh giá độ chính xác que thử sởi.

3.1. Sản Xuất Kháng Thể Đặc Hiệu Kháng Virus Sởi

Sản xuất kháng thể đặc hiệu kháng virus sởi là một bước quan trọng trong quá trình phát triển que thử sởi. Kháng thể có thể được sản xuất bằng cách tiêm antigen sởi vào động vật (ví dụ: thỏ, chuột) và thu thập huyết thanh chứa kháng thể. Kháng thể sau đó được tinh chế để loại bỏ các tạp chất. Theo luận văn, kháng thể đa dòng kháng virus Sởi đã được tinh chế thành công.

3.2. Tạo Cộng Hợp Kháng Thể Hạt Nano Vàng

Việc tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng giúp khuếch đại tín hiệu và làm cho vạch thử (T) dễ nhìn thấy hơn. Hạt nano vàng có kích thước nhỏ và có khả năng phát ra màu sắc đặc trưng khi tập hợp lại. Quá trình tạo cộng hợp cần được tối ưu hóa để đảm bảo kháng thể gắn kết hiệu quả với hạt nano vàng mà không làm mất đi khả năng nhận biết antigen sởi.

3.3. Cố Định Kháng Thể Lên Màng Nitrocellulose

Việc cố định kháng thể lên màng nitrocellulose là một bước quan trọng để tạo ra vạch thử (T) và vạch chứng (C) trên que thử sởi. Kháng thể cần được cố định một cách chắc chắn để không bị rửa trôi trong quá trình sử dụng. Nồng độ kháng thể và điều kiện cố định cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử.

IV. Đánh Giá Đặc Tính Que Thử Phát Hiện Nhanh Virus Sởi

Sau khi que thử phát hiện nhanh virus sởi được phát triển, cần tiến hành đánh giá các đặc tính quan trọng như độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại và độ chính xác. Độ nhạy được xác định bằng cách sử dụng các mẫu bệnh phẩm có nồng độ virus sởi khác nhau. Độ đặc hiệu được xác định bằng cách sử dụng các mẫu bệnh phẩm chứa các loại virus khác. Độ lặp lại được xác định bằng cách lặp lại xét nghiệm nhiều lần trên cùng một mẫu bệnh phẩm. Độ chính xác được xác định bằng cách so sánh kết quả của que thử với kết quả của các phương pháp chẩn đoán tiêu chuẩn như PCR.

4.1. Xác Định Ngưỡng Phát Hiện Virus Sởi Của Que Thử

Ngưỡng phát hiện là nồng độ virus sởi thấp nhất mà que thử có thể phát hiện được. Ngưỡng phát hiện càng thấp, que thử càng nhạy. Theo luận văn, ngưỡng phát hiện của que thử là 2.5*10^6 PFU/ml.

4.2. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Que Thử Sởi

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu là bước quan trọng để đảm bảo que thử hoạt động chính xác. Độ nhạy cho biết khả năng phát hiện đúng các mẫu dương tính, trong khi độ đặc hiệu cho biết khả năng loại trừ đúng các mẫu âm tính. Theo luận văn, độ nhạy của que thử là 90% và độ đặc hiệu là 100%.

4.3. Kiểm Tra Độ Lặp Lại Và Độ Chính Xác Của Que Thử

Độ lặp lại và độ chính xác đảm bảo rằng que thử cho kết quả nhất quán và đáng tin cậy. Độ lặp lại được kiểm tra bằng cách thực hiện nhiều xét nghiệm trên cùng một mẫu, trong khi độ chính xác được kiểm tra bằng cách so sánh kết quả với phương pháp chuẩn. Theo luận văn, độ lặp lại của que thử là 100%.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Triển Vọng Của Que Thử Sởi Nhanh

Que thử phát hiện nhanh virus sởi có nhiều ứng dụng thực tiễn trong công tác phòng chống dịch bệnh. Que thử có thể được sử dụng để sàng lọc nhanh các trường hợp nghi ngờ mắc bệnh sởi tại các cơ sở y tế, trường học và cộng đồng. Kết quả nhanh chóng giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị và cách ly kịp thời, ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh. Ngoài ra, que thử cũng có thể được sử dụng để theo dõi hiệu quả của chương trình tiêm chủng và phát hiện sớm các ổ dịch tiềm ẩn. Trong tương lai, que thử sởi có thể được cải tiến để phát hiện đồng thời nhiều loại virus khác nhau, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác các bệnh truyền nhiễm.

5.1. Sàng Lọc Nhanh Các Trường Hợp Nghi Ngờ Mắc Bệnh Sởi

Que thử sởi là công cụ hữu ích để sàng lọc nhanh các trường hợp nghi ngờ mắc bệnh sởi, đặc biệt là trong các đợt dịch bệnh. Việc sàng lọc nhanh giúp phát hiện sớm các ca bệnh và thực hiện các biện pháp phòng ngừa kịp thời.

5.2. Theo Dõi Hiệu Quả Chương Trình Tiêm Chủng Sởi

Que thử sởi có thể được sử dụng để theo dõi hiệu quả của chương trình tiêm chủng sởi bằng cách kiểm tra sự hiện diện của kháng thể sởi trong máu của những người đã được tiêm chủng. Điều này giúp đánh giá khả năng bảo vệ của vắc xin và điều chỉnh chương trình tiêm chủng khi cần thiết.

5.3. Phát Triển Que Thử Đa Năng Phát Hiện Nhiều Loại Virus

Trong tương lai, que thử sởi có thể được phát triển thành que thử đa năng có khả năng phát hiện đồng thời nhiều loại virus khác nhau, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác các bệnh truyền nhiễm. Điều này sẽ giúp giảm chi phí và thời gian chẩn đoán, đồng thời cải thiện hiệu quả của công tác phòng chống dịch bệnh.

VI. Kết Luận Về Nghiên Cứu Phát Triển Que Thử Phát Hiện Sởi

Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus sởi là một hướng đi đầy hứa hẹn trong công tác phòng chống dịch bệnh. Que thử có nhiều ưu điểm như thời gian cho kết quả nhanh chóng, thao tác đơn giản, chi phí thấp và có thể thực hiện tại chỗ. Tuy nhiên, việc phát triển que thử hiệu quả cũng đối mặt với nhiều thách thức, như đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tính ổn định và khả năng bảo quản. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc giải quyết những thách thức này để que thử sởi có thể được ứng dụng rộng rãi trong thực tế, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cần có sự đầu tư và hợp tác giữa các nhà khoa học, nhà sản xuất que thử sởi và các cơ quan y tế để đưa sản phẩm này đến với người dân.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Về Que Thử Phát Hiện Sởi

Nghiên cứu đã đạt được những kết quả đáng khích lệ trong việc phát triển que thử phát hiện nhanh virus sởi. Kháng thể đặc hiệu đã được sản xuất và tinh chế thành công. Các điều kiện tối ưu cho việc tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng và cố định kháng thể lên màng nitrocellulose đã được xác định. Que thử đã được đánh giá về độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại và độ chính xác.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Hoàn Thiện Que Thử Sởi

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử, tăng cường tính ổn định và khả năng bảo quản, giảm giá thành và đơn giản hóa quy trình sản xuất. Ngoài ra, cần tiến hành thử nghiệm lâm sàng que thử sởi trên quy mô lớn để đánh giá hiệu quả thực tế của sản phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Sởi là một bệnh truyền nhiễm do virus Sởi gây ra, thuộc họ Paramyxoviridae, có khả năng lây lan rất nhanh qua tiếp xúc gần hoặc dịch tiết đường hô hấp. Trước khi có vắc xin, mỗi năm trên thế giới có khoảng 2,6 triệu ca tử vong do Sởi. Từ năm 2000 đến 2017, vắc xin đã giúp giảm 80% số ca tử vong, tương đương ngăn ngừa khoảng 21,1 triệu ca tử vong. Tuy nhiên, từ năm 2008 đến nay, dịch Sởi có xu hướng tăng trở lại tại nhiều khu vực như châu Phi, châu Âu, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Tại Việt Nam, năm 2019 ghi nhận hơn 40.000 ca mắc với 4 ca tử vong, trong khi năm 2020 giảm còn 3.365 ca. Tỷ lệ mắc cao tập trung ở các vùng núi, vùng sâu, vùng xa và khu công nghiệp với đa số bệnh nhân chưa được tiêm chủng đầy đủ.

Hiện nay, các phương pháp phát hiện virus Sởi như PCR, realtime-PCR và ELISA tuy chính xác nhưng đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí lớn và thời gian lâu. Các test nhanh kháng thể IgM, IgG cũng còn nhiều hạn chế về độ nhạy và đặc hiệu. Do đó, việc phát triển que thử phát hiện nhanh, nhạy, trực tiếp kháng nguyên virus Sởi là rất cần thiết để hỗ trợ chẩn đoán sớm, giúp điều trị kịp thời và hạn chế biến chứng. Luận văn này tập trung nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus Sởi dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch, với mục tiêu tạo ra sản phẩm có độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện 2.5×10^6 PFU/ml, phù hợp với điều kiện sản xuất và sử dụng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Virus học và miễn dịch học: Virus Sởi là virus ARN đơn chuỗi, có cấu trúc gồm các protein nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), protein nền (M), glycoprotein hemagglutinin (H) và fusion (F). Kháng thể IgG đặc hiệu chống lại protein H giúp bảo vệ miễn dịch suốt đời.
• Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (Immunochromatography): Phương pháp dòng chảy một chiều sử dụng kháng thể gắn hạt nano vàng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu dịch hô hấp.
• Công nghệ hạt nano vàng (Durian-like Gold Nanoparticles - DGNs): Hạt nano vàng kích thước 40-60 nm được sử dụng làm chất đánh dấu, có khả năng gắn kết bền với kháng thể mà không làm ảnh hưởng đến chức năng nhận biết.
• Phương pháp tinh sạch kháng thể bằng Protein A: Sử dụng sắc ký ái lực để thu nhận kháng thể IgG đặc hiệu từ huyết thanh thỏ.
• Phương pháp ELISA và SDS-PAGE: Đánh giá hiệu giá kháng thể và độ tinh sạch protein.

Các khái niệm chính bao gồm: kháng nguyên virus Sởi, kháng thể đa dòng IgG, hạt nano vàng DGNs, màng nitrocellulose, miếng cộng hợp và miếng thấm mẫu.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Huyết thanh thỏ kháng virus Sởi được sản xuất tại Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC). Hạt nano vàng được điều chế tại Phòng thí nghiệm Proteomic, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
• Phương pháp chọn mẫu: Thỏ đực khỏe mạnh được tiêm miễn dịch 5 lần cách nhau 14 ngày với kháng nguyên virus Sởi phối hợp tá dược Freund để tạo huyết thanh kháng thể đa dòng.
• Phương pháp phân tích:
  • Tinh sạch kháng thể IgG bằng sắc ký ái lực Protein A trên hệ thống AKTA FPLC.
  • Đánh giá hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.
  • Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE và nhuộm Coomassie Brilliant Blue.
  • Tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng DGNs bằng phương pháp hấp phụ vật lý.
  • Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose bằng máy phun CAMAG.
  • Lắp ráp que thử với các thành phần: miếng thấm mẫu, miếng cộng hợp, màng nitrocellulose.
  • Đánh giá đặc tính que thử: độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện, độ lặp lại.
• Timeline nghiên cứu: Quá trình tiêm miễn dịch và lấy mẫu kéo dài khoảng 70 ngày, các bước tinh sạch, tạo cộng hợp, cố định và đánh giá que thử thực hiện trong vòng 3 tháng tiếp theo.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sản xuất huyết thanh kháng virus Sởi: Sau 4 lần tiêm miễn dịch, lượng IgG trong huyết thanh thỏ tăng rõ rệt, đạt hiệu giá cao theo phương pháp ELISA, chứng tỏ kháng nguyên đã kích thích đáp ứng miễn dịch hiệu quả.

2. Tinh sạch kháng thể IgG: Sử dụng sắc ký Protein A, thu được kháng thể tinh sạch với nồng độ 15,51 mg/ml. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chỉ có hai băng protein đặc trưng cho chuỗi nặng (50 kDa) và chuỗi nhẹ (25 kDa) của IgG, loại bỏ hoàn toàn các protein không mong muốn như albumin (66 kDa).

3. Điều kiện tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng: Xác định tỷ lệ kháng thể 0,1 µg trên 100 µl DGNs OD1.2, phản ứng ở 25°C trong 30 phút là tối ưu. BSA được sử dụng để lấp đầy vị trí trống trên bề mặt hạt nano vàng, ngăn ngừa liên kết không đặc hiệu.

4. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose: Lượng kháng thể phun lên vạch T là 2,0 µg, sấy ở 37°C trong 60 phút cho kết quả cố định tốt, đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử.

5. Đặc tính que thử:

   • Ngưỡng phát hiện virus Sởi đạt 2.5×10^6 PFU/ml.
   • Độ nhạy đạt 90%, độ đặc hiệu 100%.
   • Độ lặp lại 100% với 10 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính.
   • Kết quả cho thấy que thử có khả năng phát hiện nhanh và chính xác virus Sởi trong mẫu dịch hầu họng.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng kháng thể đa dòng IgG tinh sạch kết hợp với hạt nano vàng DGNs tạo ra que thử phát hiện nhanh virus Sởi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Điều kiện tạo cộng hợp và cố định kháng thể được tối ưu giúp tăng cường tín hiệu màu sắc, dễ dàng quan sát bằng mắt thường. So với các phương pháp PCR hay ELISA truyền thống, que thử này có ưu điểm về thời gian cho kết quả nhanh (10-20 phút), chi phí thấp và thao tác đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm cơ bản hoặc sử dụng tại điểm chăm sóc sức khỏe.

Các kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ động học sản sinh kháng thể IgG, phổ điện di SDS-PAGE thể hiện độ tinh sạch kháng thể, biểu đồ so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử với các phương pháp chuẩn. Bảng tổng hợp điều kiện tạo cộng hợp và cố định kháng thể cũng giúp minh họa quá trình tối ưu hóa.

Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ứng dụng hạt nano vàng trong xét nghiệm miễn dịch nhanh, đồng thời mở ra hướng phát triển kit test nhanh virus Sởi sản xuất trong nước, góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai sản xuất thử nghiệm que thử phát hiện nhanh virus Sởi trong quy mô công nghiệp nhằm đáp ứng nhu cầu chẩn đoán sớm tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở trong vòng 12 tháng tới.

2. Đào tạo nhân viên y tế và kỹ thuật viên sử dụng que thử nhanh, đảm bảo thao tác chuẩn xác, nâng cao hiệu quả chẩn đoán và giảm thiểu sai sót, thực hiện trong 6 tháng đầu sau khi sản phẩm được cấp phép.

3. Mở rộng nghiên cứu cải tiến que thử để phát hiện đồng thời nhiều loại virus gây sốt phát ban, tăng tính ứng dụng và hiệu quả kinh tế, tiến hành trong 2 năm tiếp theo.

4. Hợp tác với các cơ quan quản lý và tổ chức y tế để xây dựng hướng dẫn sử dụng và quy trình kiểm soát chất lượng que thử, đảm bảo an toàn và hiệu quả khi đưa vào sử dụng đại trà.

5. Thực hiện các nghiên cứu đánh giá lâm sàng mở rộng tại nhiều địa phương khác nhau nhằm xác nhận độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ổn định của que thử trong điều kiện thực tế, hoàn thành trong vòng 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh và Y học: Nắm bắt quy trình phát triển que thử miễn dịch nhanh, kỹ thuật tinh sạch kháng thể và ứng dụng hạt nano vàng trong chẩn đoán.

2. Cơ sở sản xuất kit xét nghiệm và thiết bị y tế: Áp dụng công nghệ sản xuất que thử phát hiện nhanh virus Sởi, phát triển sản phẩm phù hợp với thị trường trong nước và quốc tế.

3. Bệnh viện, phòng xét nghiệm và trung tâm y tế dự phòng: Sử dụng que thử nhanh để chẩn đoán sớm bệnh Sởi, nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh tại cộng đồng.

4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách: Tham khảo để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực chẩn đoán, đồng thời thúc đẩy sản xuất trong nước, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu.

Câu hỏi thường gặp

1. Que thử phát hiện nhanh virus Sởi hoạt động dựa trên nguyên lý nào?
   Que thử sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch dòng chảy một chiều, trong đó kháng thể đặc hiệu gắn trên hạt nano vàng sẽ kết hợp với kháng nguyên virus Sởi trong mẫu, tạo phức hợp được giữ lại trên màng nitrocellulose tại vạch kiểm tra, tạo vạch màu dễ quan sát.

2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử là bao nhiêu?
   Que thử đạt độ nhạy 90% và độ đặc hiệu 100%, nghĩa là có khả năng phát hiện chính xác 90% mẫu dương tính và không cho kết quả dương tính giả trên mẫu âm tính.

3. Ngưỡng phát hiện virus của que thử là gì?
   Ngưỡng phát hiện là 2.5×10^6 PFU/ml, đủ để phát hiện virus trong các mẫu dịch hầu họng có tải lượng virus cao trong giai đoạn đầu nhiễm.

4. Thời gian cho kết quả của que thử là bao lâu?
   Kết quả được đọc trong khoảng 10-20 phút sau khi nhỏ mẫu lên que thử, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp PCR hoặc ELISA truyền thống.

5. Que thử có thể sử dụng ở đâu và cho đối tượng nào?
   Que thử phù hợp sử dụng tại các phòng khám, trung tâm y tế tuyến cơ sở, bệnh viện và các điểm chăm sóc sức khỏe cộng đồng để phát hiện sớm virus Sởi ở trẻ em và người lớn nghi ngờ mắc bệnh.

Kết luận

• Đã sản xuất thành công kháng thể đa dòng IgG đặc hiệu kháng virus Sởi với nồng độ 15,51 mg/ml và độ tinh sạch cao.
• Xác định được điều kiện tối ưu tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng DGNs và cố định kháng thể lên màng nitrocellulose.
• Phát triển que thử phát hiện nhanh virus Sởi với độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện 2.5×10^6 PFU/ml và độ lặp lại 100%.
• Que thử cho kết quả nhanh trong 10-20 phút, dễ sử dụng, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm cơ bản và điểm chăm sóc sức khỏe.
• Đề xuất triển khai sản xuất thử nghiệm, đào tạo sử dụng và mở rộng nghiên cứu cải tiến để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh Sởi tại Việt Nam.

Luận văn mở ra hướng phát triển sản phẩm kit test nhanh virus Sởi sản xuất trong nước, góp phần nâng cao năng lực y tế dự phòng và giảm thiểu tác động của dịch bệnh. Các nhà nghiên cứu, cơ sở sản xuất và cơ quan quản lý được khuyến khích tiếp tục phát triển và ứng dụng kết quả này trong thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nhiễm vi rút Sởi trên thế giới và ở Việt Nam. Tình hình nhiễm vi rút Sởi trên thế giới. Trước khi có vắc xin sởi (1963) trung bình mỗi năm có khoảng 2,6 triệu trường hợp tử vong sởi và trung bình cứ 2-3 năm lại xảy ra dịch lớn.

Giai đoạn 2000-2017, ước tính vắc xin sởi đã ngăn ngừa được khoảng 21,1 triệu trường hợp tử vong do sởi và giảm 80% từ 545.000 trường hợp ước tính của năm 2000 xuống còn 110.000 trường hợp vào năm 2017 trên toàn thế giới. Trước những thành tựu đạt được sau khi triển khai tiêm vắc xin sởi, Tổ chức Y tế thế giới đã đặt mục tiêu loại trừ bệnh sởi tại cả 5 khu vực trên thế giới vào năm 2020, nhiều quốc gia trên thế giới đã đạt hoặc đang từng bước thực hiện mục tiêu loại trừ bệnh sởi đã đề ra, tuy nhiên trên thực tế bệnh sởi đã tăng trở lại ở nhiều vùng trên thế giới, bao gồm cả châu Âu, châu Phi, Bắc Mỹ và Nam Á từ năm 2008 tới nay với mức ảnh hưởng rộng khắp toàn cầu [27]. Theo báo cáo của WHO đến ngày 30/9/2019, toàn cầu ghi nhận tổng cộng 423.963 trường hợp mắc sởi (bao gồm cả sởi xác định bởi phòng xét nghiệm, lâm sàng và có liên quan dịch tễ học), tại tất cả các khu vực và vùng lãnh thổ. Các khu vực mắc nhiều trong 9 tháng đầu năm 2019 bao gồm: khu vực Châu Phi 186.010 trường hợp, khu vực Châu Âu 97.527 trường hợp, khu vực Đông Nam Châu Á 67.604 trường hợp và khu vực Tây Thái Bình Dương 49.396 trường hợp.

Khu vực có số trường hợp mắc sởi thấp là khu vực Châu Mỹ 6.506 trường hợp sởi, tuy nhiên khu vực này chỉ công nhận những ca sởi được xác định bởi phòng xét nghiệm, do đó nếu xác định ca sởi dựa trên cả 3 yếu tố như những khu vực khác thì số ca sởi được ghi nhận có thể sẽ lớn hơn nhiều. So sánh với cùng kì năm 2018, số mắc sởi toàn cầu trong năm 2019 tăng 2,45 lần, trong đó khu vực Châu Phi tăng gấp 7,91 lần (188.753 ca), khu vực Tây Thái Bình Dương tăng 2,69 lần (49.311 ca) và khu vực Châu Âu tăng gần 2 lần (97. WHO và UNICEF cảnh báo sự gia tăng các ca mắc bệnh sởi trong tháng 1 và tháng 2 năm 2022 là một dấu hiệu đáng lo ngại về nguy cơ lây lan các bệnh có thể phòng ngừa được bằng vắc xin và có thể gây ra các đợt bùng phát lớn hơn, đặc biệt là bệnh sởi ảnh hưởng đến hàng triệu trẻ em vào năm 2022 [30]. 1 Sự gián đoạn liên quan đến đại dịch, gia tăng sự bất bình đẳng trong việc tiếp cận với vắc xin và sự phân tán nguồn lực từ việc tiêm chủng định kỳ đang khiến quá nhiều trẻ em không được bảo vệ khỏi bệnh sởi và các bệnh có thể phòng ngừa bằng vắc xin khác.

Nguy cơ bùng phát dịch lớn đã tăng lên khi các cộng đồng nới lỏng các biện pháp giãn cách xã hội và các biện pháp phòng ngừa khác đối với COVID-19 được triển khai trong thời kỳ cao điểm của đại dịch. Ngoài ra, với hàng triệu người phải di dời do xung đột và khủng hoảng bao gồm ở Ukraine, Ethiopia, Somalia và Afghanistan, sự gián đoạn trong tiêm chủng định kỳ và dịch vụ tiêm chủng COVID-19, thiếu nước sạch và vệ sinh cũng như tình trạng quá tải làm tăng nguy cơ tiêm vắc xin- bùng phát dịch bệnh có thể ngăn chặn được.338 trường hợp mắc sởi đã được báo cáo trên toàn thế giới vào tháng 1 và tháng 2 năm 2022, so với 9665 trường hợp trong hai tháng đầu năm 2021. Vì bệnh sởi rất dễ lây lan nên các trường hợp mắc bệnh có xu hướng xuất hiện nhanh chóng khi mức độ tiêm chủng giảm. Các cơ quan lo ngại rằng sự bùng phát của bệnh sởi cũng có thể báo trước sự bùng phát của các bệnh khác không lây lan nhanh như vậy.

Vào năm 2020, 23 triệu trẻ em không được tiêm vắc-xin cơ bản cho trẻ em thông qua các dịch vụ y tế thông thường, con số cao nhất kể từ năm 2009 và nhiều hơn 3,7 triệu so với năm 2019. Kể từ ngày 1 tháng 4 năm 2022, 57 chiến dịch phòng bệnh bằng vắc-xin tại 43 quốc gia dự kiến diễn ra kể từ khi bắt đầu đại dịch vẫn bị hoãn lại, ảnh hưởng đến 203 triệu người, trong đó phần lớn là trẻ em. Trong đó có 19 chiến dịch sởi khiến 73 triệu trẻ em có nguy cơ mắc sởi do bỏ lỡ tiêm chủng. Tại Ukraine, chiến dịch đuổi kịp bệnh sởi năm 2019 bị gián đoạn do đại dịch COVID-19 và sau đó là do chiến tranh.

Cần có các chiến dịch định kỳ và cập nhật ở bất cứ nơi nào có thể tiếp cận để giúp đảm bảo không có các đợt bùng phát lặp lại như trong năm 2017–2019, khi có hơn 115 000 trường hợp mắc bệnh sởi và 41 trường hợp tử vong ở quốc gia này – đây là tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở Châu Âu [30]. Tỷ lệ bao phủ từ 95% trở lên với 2 liều vắc-xin sởi an toàn và hiệu quả có thể bảo vệ trẻ em khỏi bệnh sởi. Tuy nhiên, sự gián đoạn liên quan đến đại dịch 2 COVID-19 đã làm trì hoãn việc giới thiệu liều vắc-xin sởi thứ hai ở nhiều quốc gia. Tình hình nhiễm vi rút Sởi tại Việt Nam.

Từ đầu năm 2014 đến năm 2017 có 6.611 trường hợp sốt phát ban dạng sởi, trong đó ghi nhận 2.492 trường hợp được xác định mắc bệnh sởi (bao gồm các trường hợp xét nghiệm dương tính và xác định dịch tễ học) tại 59 tỉnh/thành phố, các cơ sở y tế đã lấy 4.335 mẫu xét nghiệm, có 2.303 mẫu dương tính với sởi (53%). Tích lũy từ tháng 11/2013 đến 31/3/2014 ghi nhận 3.380 trường hợp mắc sởi, trong đó có 25 trường hợp tử vong; số mắc thấp hơn vụ dịch năm 2009- 2010 (8.233 trường hợp mắc). Tại Việt Nam, bệnh sởi bùng phát bắt đầu từ tháng 10 năm 2018, tính đến đầu tháng 3 đã ghi nhận 18.078 trường hợp sốt phát ban nghi sởi, trong đó 2.924 ca mắc sởi dương tính được xác định tại 56 tỉnh, thành phố, và tính đến hiện nay số mắc vẫn chưa có xu hướng giảm. Các trường hợp mắc bệnh tập trung chủ yếu tại các vùng núi, vùng sâu, vùng xa, vùng dân tộc thiểu số sinh sống tại các tỉnh, thành phố nhiều khu công nghiệp, mật độ dân cư cao, giao lưu đi lại lớn.

Cụ thể, trong 12 tuần đầu năm 2019 tại TP.Hồ Chí Minh ghi nhận 3.316 trường hợp sốt phát ban nghi sởi trong đó số ca chưa được tiêm chủng là 1.788 ca (tương đương 54%), số ca không rõ tiền sử tiêm chủng là 1. Và tại Hà Nội từ đầu năm 2019 tính đến 10 tháng 3 đã ghi nhận 412 ca mắc sởi (tăng 366 ca so với cùng kỳ năm ngoái) phân bố tại các quận, huyện, thị trấn, xã. Điều đáng nói là có đến 92% bệnh nhân mắc sởi chưa được tiêm chủng hoặc tiêm chủng không đầy đủ hoặc không rõ tiền sử tiêm chủng do mất sổ tiêm chủng. Năm 2018, Việt Nam ghi nhận 7.585 ca nghi Sởi/Rubella, trong đó có 3.529 ca được lấy mẫu bệnh phẩm và 1.794 ca dương tính với sởi, tăng gấp 8,4 lần so với số mắc Sởi của cả năm 2017 (214 ca).

Tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với Sởi năm 2018 là 50,8%, tăng cao so với năm 2017 (14%). Riêng trong 3 tuần đầu tháng 1/2019, theo báo cáo ban đầu của các địa phương, tiếp tục ghi nhận 2.441 ca nghi Sởi/Rubella. 3 Năm 2019 Việt Nam ghi nhận 40.058 người mắc sởi, trong đó có 4 ca tử vong do sởi, tỉ lệ mắc là 41,52/100000 dân[6]. Năm 2020 Việt Nam ghi nhận 3.365 người mắc sởi, trong đó có 0 ca tử vong do sởi, tỉ lệ mắc là 0,36/100000 dân [7].

Đặc điểm của vi rút Sởi. Hình thái và cấu trúc. Vi rút Sởi thuộc họ Paramyxoviridae, chi Morbillivi rút, hình cầu, đường kính 100-250 nm, chứa ARN sợi đơn, trọng lượng phân tử 4,6 x 106 dalton, vỏ capsid đối xứng xoắn và có bao ngoài [4]. Hình dạng vi rút Sởi [31].

Vi rút Sởi có tính đề kháng yếu, ở 560C sau 30 phút vi rút mất khả năng lây nhiễm, tồn tại trên 5 năm ở nhiệt độ lạnh -700C. Vi rút Sởi nhạy cảm với ánh sáng mặt trời và nhiều tác nhân lý hóa, rất nhạy cảm với ether [4]. Cấu trúc Vi rút Sởi [5] Cấu trúc vi rút sởi gồm sợi xoắn ARN, nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), Larger protein (L), protein Matrix (M), protein C, V và các gai nhú glycoprotein do Hemag-glutinin (H) và Fusion (F) tạo thành [13]. Vi rút sởi có tính đề kháng yếu, ở 560C sau 30 phút vi rút mất khả năng lây nhiễm, tồn tại trên 5 năm ở nhiệt độ lạnh -700C.

Vi rút sởi nhạy cảm với ánh sáng mặt trời và nhiều tác nhân lý hóa, rất nhạy cảm với ether [4]. Sự nhân lên của vi rút Sởi. Bộ gen RNA của vi rút dài 15.894 nucleotide và mã hóa cho sáu protein cấu trúc và hai protein không cấu trúc. Các protein cấu trúc là protein nucleocapsid (N), protein nền (M), phosphoprotein (P), protein haemagglutinin (H), protein dung hợp (F) và protein polymerase (L).

Hai protein không cấu trúc là V và C, được mã hóa bởi gen P, có tác dụng điều chỉnh phản ứng của tế bào đối với nhiễm trùng [21, 26]. Trong khi Vi rút ra khỏi tế bào chủ, Vi rút sẽ chiếm màng tế bào của tế bào chủ, tạo thành vỏ của Vi rút. Lớp vỏ này có được từ tế bào chủ giúp Vi rút tránh được khả năng miễn dịch của tế bào chủ. Bên trong lớp vỏ là chất nền được tạo thành từ một protein có tên là M.

RNA bộ gen được bao quanh bởi một protein nucleocapsid dạng xoắn (N). Các protein đặc biệt L và phosphoprotein P giúp sao chép bộ gen của vi rút và tạo ra các bản sao của vi rút. Các glycoprotein haemagglutinin (H) và dung hợp (F) tạo nên các hình chiếu bề mặt trên bao. Hai glycoprotein này tương tác với hoặc không có protein tế bào bổ sung (thụ thể) giúp Vi rút liên kết và xâm nhập vào các tế bào miễn dịch, như tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào đuôi gai và tế bào biểu mô bám vào các điểm nối [21].

Các protein này xác định tính đặc hiệu của vi rút đối với các loại tế bào và mô khác nhau. Nhiễm bệnh Sởi truyền khả năng miễn 5 dịch suốt đời chống lại Vi rút do sản xuất kháng thể IgG và tế bào nhớ chống lại protein haemagglutinin ngăn chặn sự liên kết của Vi rút với các thụ thể của tế bào chủ [25].